Введение к работе
Актуальность темы. Неослабевающий интерес исследователей к проблеме лечения злокачественных опухолей яичников объясняется трудностями ранней диагностики, частыми рецидивами даже при начальных стадиях болезни и неудовлетворительными результатами лечения диссеми-нированных форм заболевания (В.А.Горбунова и соавт., 2003; С.Климов и соавт., 2005; Е.Г.Новикова и соавт., 2005).
В настоящее время первичные злокачественные опухоли яичников в общей структуре онкологических заболеваний встречаются довольно часто (Е.М.Аксель и соавт., 1999, 2001; В.Л.Винокуров, 2000). Так, в 2000 году в мире зарегистрировано более 165000 новых случаев рака яичников и более 101000 смертей от этой патологии. В России ежегодно рак яичников выявляется более чем у 11,7 тысяч женщин, а смертность - составляет 9,5 на 100000 женского населения (Е.М.Аксель и соавт., 2003; В.А.Горбунова и соавт., 2004). При этом 70% среди вновь выявленных случаев заболевания составляют распространенные III-IV стадии болезни (К.И.Жордания, 2002).
Эти новообразования характеризируются не только трудностями ранней диагностики, но и высокими показателями летальности, а частота лечебного эффекта и длительность ремиссии существенно различаются у многих больных (В.А.Горбунова и соавт., 2003; И.Н.Трофимова и соавт., 2004). Вместе с тем, за последние годы отмечены определенные успехи в лечении этих пациенток (В.П.Козаченко и соавт., 1998; А.Г.Блюменберг и соавт., 2002). По сводным данным популяционных раковых регистров стран Европы, 1-летняя выживаемость больных раком яичников составляет 63%, 3-летняя - 41%, 5-летняя - 35% (К.И.Жордания, 2002). Так, если выживаемость больных раком яичников в 1962 г. составляла только 32%, то в 2000 г. - уже более 50%.Следует отметить, что прогресс при лечении был достигнут за счет совершенствования химиотерапии (внедрение новых лекарственных препаратов, совершенствование комбинаций для лечения), развития хирургической техники и анестезиологии (В.А.Горбунова и соавт., 2003, 2004; И.Б.Манухин и соавт., 2004; Katsaros D. etal, 2005).
Однако, в настоящее время рак яичников занимает первое место в структуре смертности среди злокачественных новообразований органов женской репродуктивной системы (Е.М.Аксель и соавт., 2003). Анализ данных отечественной и зарубежной литературы свидетельствует о неудовлетворительных результатах лечения этой категории больных и объяснением этому служит тот факт, что ко времени установления диагноза у 70% пациенток рак яичников диагностируется на поздних стадиях опухолевого процесса (К.И.Жордания, 2002; А.Г.Блюменберг, 2002).
Уже не вызывает сомнения тот факт, что рак яичников объединяет группу различных гистогенетических вариантов опухоли, некоторые из них отличаются агрессивностью клинического течения и склонностью к раннему метастазированием. Так, у 2-3% больных во время установления диагноза уже вьювляются гематогенные метастазы в печени, головном мозге и легких (К.И.Жордания, 2000). Все это может быть связано с «биологическими» характеристиками новообразования, а, именно, гистологическим вариантом строения опухоли, степенью дифференцировки и плоидностью опухоли, что в определенной степени определяет ее способность к инвазив-ному росту в окружающие органы и ткани (В.П.Козаченко и соавт., 1999; А.И.Карселадзе, 2000; Н.И.Портнова, 2001; Л.З.Полищук и соавт., 2002; И.В.Паниченко и соавт., 2003). Кроме того, в бластомогенезе рака яичников у 10-20% больных вьювляются различные повреждения генома, что также имеет тесную связь с особенностями «биологического» поведения опухоли, чувствительностью ее к лекарственной терапии, а стало быть и прогнозом заболевания (А.М.Гарин и соавт., 2000).
В настоящее время частично изучены и определены пути передачи «сигналов» трансформации клеток при раке яичников, исследованы некоторые рецепторы факторов роста (RAS, АКТ-2, Р13-киназы, EGF-R, ERB-B2), выделены гены супрессоры (р53, DAB2, NOEY2, LOT1), однако их роль в механизмах канцерогенеза при опухолях, в том числе и раке яичников, остается до конца не выясненной (И.Б.Зборовская и соавт., 2001;
5 И.НТрофимова и соавт., 2004; Е.В.Бахидзе и соавт., 2005; В.И.Кулинский и соавт., 2005).
С целью более углубленного понимания некоторых этапов патогенеза рака яичников необходимо изучение конкретных биологически активных веществ в механизмах регуляции «биологического» поведения опухоли, а именно, ее роста, инвазии в окружающие ткани и метастазирования. На основании этих исследований непременно встанет вопрос о возможной разработке новых подходов к лекарственной патогенетической терапии рака яичников, которые целенаправленно подавляют продукцию рост-стимулирующих факторов, продуцируемых самой опухолью или окружающими тканями, что позволит регулировать рост опухоли. Эти исследования помогут объяснить различие в агрессивности течения и лекарственной чувствительности опухолей яичников, которые сравнимы по распространенности и гистологическому строению.
Особое внимание в последние годы исследователи уделяют изучению механизмов апоптоза или программированной гибели клетки с характерными морфологическими и биохимическими признаками (М.А.Пальцев, 2004; Т.И.Синельникова, 2004; Thompson СВ., 1995).
Известно, что апоптоз - исключительно важный механизм поддержания гомеостаза многоклеточного организма. Благодаря программированной гибели удаляются поврежденные, завершившие свой жизненный путь, а также «нежелательные» клетки, без повреждения клеточного микроокружения (Н.Н.Белушкина и соавт., 2004). Нарушение процессов клеточной гибели может приводить к возникновению патологических состояний, к числу которых относятся онкологические заболевания, в том числе и рак яичников (С.Г.Аббасова и соавт., 1999; Т.И.Синельникова, 2004; В.С.Симонова и соавт., 2005; И.В.Гужова и соавт., 2005; Hefler L. et al., 2000; Hong Z. et al, 2000; Levine D.A. et al., 2004). Одной из ключевых молекул, участвующих в развитии Fas-опосредуемого апоптоза, является Fas-рецептор - трансмембранный гликопротеин 1 типа (синонимы АРО-1, CD-95), который индуцирует апоптоз в клетке после взаимодействия с Fas-лигандом или агонисти-
ческими моноклональными антителами против Fas (Т.И.Синельникова, 2004). Причиной устойчивости опухолевых клеток к Fas-зависимому апоп-тозу может быть повышенная продукция этими клетками растворимого Fas-антигена (sFas), который является продуктом альтернативного сплайсинга полноразмерной молекулы Fas (Cheng J. et al., 1994; Cascino I. et al., 1995) и способен ингибировать Fas-опосредуемый апоптоз. Повышенная концентрация sFas была выявлена при аутоиммунных заболеваниях (Shimaoka Y. et al., 1998), системном туберкулезе кожи (Fushimi М. et al., 1998), синдроме поликистозных яичников (И.Б.Манухин и соавт., 2001), гепатоцеллюлярной карциноме (Jodo S. et al., 1998). L.Hefler et al. (2000) на основании предварительных исследований предлагают использовать этот маркер в дифференциальной диагностике рака и доброкачественных новообразований яичников, а высокая концентрация sFas до проведения химиотерапии Может служить фактором прогноза общей и безрецидивной выживаемости этих пациенток.
Сравнительно недавно с использованием методов молекулярной биологии был открыт гормон лептин, который секретируется адипоцитами белой жировой ткани и костного мозга, трофобластами плаценты и клетками амниона матки беременных женщин (ЮА.Панков, 1998). Лептин играет важную роль в регуляции потребности организма животных и человека в питательных веществах и расходе энергии, способствуя снижению запаса жиров (И.В.Терещенко, 2001), в том числе и за счет апоптоза адипоцитов (Masuzaki Н. et al., 1997; Stoving R.K. et al., 1998). Клинических исследований о роли лептина у больных раком яичников, и в частности, анализ его связи с продукцией активаторов и ингибиторов апоптоза, у этой категории больных не проводилось, а основное число научных работ проведено в экспериментальных исследованиях на культуре клеток из тканей или на самих висцеральных жировых тканях (Halleux СМ. et al., 1998). Поскольку среди этиологических факторов развития рака яичников, помимо внешних и наследственных, выделяют эндокринологические нарушения (Я.В.Бохман и соавт., 1995), в частности, нарушение овуляции как провоцирующего мо-
7 мента, изучение продукции ключевого рецептора апоптоза с уровнями ба-зальной секреции лептина (центрального регулятора стероидогенеза) у больных раком яичников позволит выяснить не только взаимосвязь между этими показателями, но и определить их роль в клиническом течении болезни.
В последние годы исследователи уделяют пристальное внимание изучению механизмов неоангиогенеза в патогенезе новообразований, поскольку опухоль не может развиваться и расти без образования в ней новой сети сосудов (Pintucci G. et al., 1996). В последние годы было продемонстрировано наличие целого ряда регуляторных ангиогенных и антиангиогенных факторов, которые обеспечивают формирование и развитие новых сосудов внутри самой опухоли, в том числе и при раке яичников (Е.С.Герштейн и соавт., 2002; И.Н.Подушкина, 2004). При этом, наиболее активным стимулятором ангиогенеза в опухолях считается фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) (Folkman J., 1985). В отличие от всех других факторов, положительно стимулирующих неоангиогенез в опухоли, VEGF является активным митогеном только по отношению к эндотелиальным клеткам (Ferrara N., 1995). В последнее время особое внимание уделяется изучению различных активаторов неоангиогенеза и их связи с процессами инвазии и метастати-зования, однако работ, в которых проводилось совместное изучение лептина, sFas и VEGF при раке яичников в доступной литературе нами не обнаружено.
Следовательно, углубленное изучение апоптоза, в частности, его ключевого рецептора - sFas, центрального регулятора стероидогенеза - лептина, их связь с основными клинико-морфологическими характеристиками рака яичников, с продукцией ключевого активатора ангиогенеза - VEGF, а также факторами, которые не только активируют, но и ингибируют эти процессы, позволит разработать более эффективные методы патогенетического лечения заболевания и, возможно, использовать некоторые показатели, характеризующие эти процессы, в оценке прогноза заболевания.
Изучение содержания лептина и растворимого Fas-антигена в сыворотке крови больных серозным раком, пограничными серозными опухолями и доброкачественными новообразованиями яичников для оценки их взаимосвязи с основными клинико-морфологическими характеристиками заболевания, продукцией фактора роста эндотелия сосудов и прогнозом.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи.
-
Провести сравнительное определение содержания лептина и растворимого Fas-антигена в сыворотке крови больных серозным раком, пограничными серозными опухолями и доброкачественными новообразованиями яичников, а также у практически здоровых женщин соответствующего возраста (группа контроля).
-
Изучить закономерности и изменения уровней лептина и растворимого Fas-антигена в сыворотке больных серозным раком яичников с учетом основных клинико-морфологических характеристик заболевания (возраста, репродуктивного статуса, стадии болезни, морфологического варианта строения опухоли, степени ее дифференцировки).
-
Провести анализ взаимосвязи концентраций лептина и растворимого Fas-антигена с показателями фактора роста эндотелия сосудов в сыворотке крови больных серозным раком яичников.
-
Оценить клиническое значение лептина, растворимого Fas-антигена, фактора роста эндотелия сосудов и коэффициентов их соотношений в прогнозе безрецидивной выживаемости больных серозным раком яичников.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА Впервые выполнено сравнительное определение содержания лептина и растворимого Fas-антигена, проведен анализ их связи с продукцией ключевого активатора ангиогенеза фактора роста эндотелия сосудов в сыворотке крови больных серозным раком, пограничными опухолями и доброкачественными новообразованиями яичников с учетом основных клинико-
морфологических характеристик, клинического течения и прогноза заболевания.
Настоящая работа представляет практический интерес для оценки взаимосвязи концентраций лептина и растворимого Fas-антигена в сыворотке крови больных раком яичников с длительностью безрецидивной выживаемости, а также зависимость их продукции от показателей ключевого активатора ангиогенеза - фактора роста эндотелия сосудов.
Сравнительное исследование содержания лептина, растворимого Fas-антигена, фактора роста эндотелия сосудов и их соотношений в сыворотке крови больных серозным раком яичников с целью возможного использования этих показателей как критериев прогноза болезни. АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ
Основные результаты диссертации доложены на симпозиуме «Национальные дни лабораторной медицины России» (Москва, 1999); на XI и XII Российских Национальных Конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 2004, 2005); на Российской научно-практической конференции «Состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2004); на Конгрессе «Национальные дни лабораторной медицины России» (Москва, 2004).
Материалы диссертации доложены 21 декабря 2004г. на совместной научной конференции хирургического отделения гинекологии, хирургического отделения опухолей органов женской репродуктивной системы, отделения амбулаторных методов диагностики и лечения, лаборатории клинической биохимии НИИ клинической онкологии ГУ Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН.
По теме диссертации опубликованы 9 научных работ. СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ
Диссертация написана на 136 страницах машинописного текста, включает введение, обзор данных литературы, главу «Материалы и методы
исследования», двух глав «Результаты собственных наблюдений», обсуждение полученных данных, выводы и список цитируемой литературы, который состоит из 65 работ отечественных и ПО работ зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 17 таблицами, 19 рисунками.
Определены и проанализированы уровни sFas, лептина и VEGF, в сыворотке крови 100 женщин, лечившихся в НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН по поводу новообразований яичников в период с января 1999 г. по март 2004 г. При этом, 27% больных были в возрасте до 45 лет, 30% - от 45 до 55 лет и 43% - старше 55 лет; 60 больных (60,0%) были в постменопаузе длительностью от 1,0 до 35 лет.
Клинический диагноз у всех больных подтвержден гистологическим исследованием удаленного новообразования яичника в соответствии с гистологической классификацией ВОЗ (Scully R.E. et al., 1999): серозный рак яичника выявлен у 51 (51,0%) больной; пограничные серозные опухоли - у
II (11,0%); доброкачественные новообразования (серозная цистаденома) - у
38 (38,0%). Высоко дифференцированный серозный рак яичника (G1) обна
ружен у 5, умеренно- (G2) и низкодифференцированный (G3) - у 7 и 37 па
циенток, соответственно. Опухоли яичника с разной степенью дифферен-
цировки обнаружены у 2 больных.
Почти половина больных новообразованиями яичников (49,0%) была с проявлениями асцита, при этом асцит выявили у подавляющего большинства больных серозным раком яичников (88,9%). Преобладали пациентки с
III (32) и IV (14) стадиями заболевания (FIGO), в I и во II стадиях было 5
больных.
Длительность безрецидивного периода анализировали у всех больных раком яичников, в среднем она равнялась 1,21 года (медиана - 1,05 лет). Причем, у подавляющего (70,3%) числа больных серозным раком яичников рецидив был выявлен в течение первого года от начала лечения.
Больные серозным раком и пограничными опухолями яичников получили следующие виды лечения: 36 больным раком яичников была выпол-
нена экстирпация матки с придатками и удаление большого сальника; 15 пациенткам выполнена экстирпация матки с придатками и резекция большого сальника; 9 больным с пограничными опухолями выполнено удаление придатков, резекция большого сальника, а 2 больным - надвлагалищная ампутация матки с придатками и резекция большого сальника.
Больные раком яичников через 2-3 недели после операции получали адъювантную химиотерапию по следующим схемам: цисплатин 80 мг/м2 + циклофосфан 800 мг/м2 - 23 больных; карбоплатин (AUC 6) + циклофосфан 800 мг/м2 - 6 больных; цисплатин + адриамицин + циклофосфан - 14 больных; таксол 175 мг/м2 с карбоплатином (AUC 6) или цисплатином 75 мг/м2 - 4 больных; таксотер 80 мг/м2 + цисплатин 75 мг/м2 - 4 больных.
Больные доброкачественными новообразованиями яичников получили следующие объемы хирургического лечения: экстирпация матки с придатками - 7 больных, надвлагалищная ампутация матки с придатками - 7 больных, 4 больным была выполнена резекция яичника, 13 пациенткам -правосторонняя тубоовариоэктомия, 6 больным - левосторонняя тубоова-риоэктомия, 1 больной выполнили экстирпацию шейки матки, удаление правого яичника.
Лабораторные методы исследования
Метод определения концентрации sFas в сыворотке крови. Взятие крови у больных новообразованиями яичников и практически здоровых женщин проводили до лечения из кубитальной вены с 8.00 до 9.00 час натощак. Сыворотку крови отделяли от форменных элементов при центрифугировании на холоду в течение 10 мин при 2500xg и хранили при температуре -40 С до проведения исследования.
Концентрацию sFas определяли иммуноферментным методом, разработанным научными сотрудниками ИБХ им. М.М.Шемякина и ЮА.Овчинникова РАН и лаборатории клинической биохимии НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, с использованием моноклональных антител против Fas SA-8.
Метод определения концентрации лептина в сыворотке
крови. Концентрацию лептина в сыворотке крови определяли иммунофер-ментным методом в образцах сыворотки крови, полученных ранее описа-ным методом, с помощью наборов реактивов фирмы фирмы «DRG» (США).
Метод определения концентрации VEGF в сыворотке крови. Концентрацию VEGF в сыворотке крови определяли иммунофермент-ным методом при использовании наборов реактивов фирмы «R&D» (США).
Группу контроля составили 60 практически здоровых женщин в возрасте от 30 до 65 лет.
Статистический анализ полученных данных
Анализ распределений изучаемых признаков проводили с помощью критерия согласия Колмогорова-Смирнова.
Для выявления различий средних значений применяли однофактор-ный и многофакторный дисперсионный анализы.
Достоверность различий частот в изучаемых признаках оценивали с помощью критерия у?, для малых выборок рассчитывали точный критерий Фишера.
Меру линейной связи оценивали с помощью коэффициента корреляции Пирсона, непараметрического коэффициента корреляции рангов Spearman.
Анализ кривых выживаемости проводили методом Kaplan-Mayer, сравнения кривых выживаемости проводили методами Log-Rank, с учетом поправки Бонферрони для множественных сравнений. Многофакторный анализ влияния признаков на безрецидивную выживаемость проводили с использованием модели Сох hazard proportional regression.
При выборе статистических процедур учитывали методологические требования Международного Конгресса по гармонизации GCP "Статистические принципы для клинических исследований" (1СН Guidelines // Good Clin. Pract. J. - 1998. - Vol.5, №4. - p. 27-37).