Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 10
1.1 История открытия дендритных клеток 10
1.2 Морфо-функциональные особенности дендритных клеток 11
1.3 Роль дендритных клеток в канцерогенезе 12
1.4 Биотерапия рака с использованием дендритных клеток 17
1.5 Индуцированные опухолью патологические изменения дендритных клеток 20
1.6 Роль Интерлейкина-15 в физиологии иммунных клеток 29
1.7 Роль Активина А в биологии дендритных клеток 32
1.8 Влияние химиотерапии злокачественных новообразований на дендритные клетки 34
Глава 2 Материалы и методы 41
2.1 Биологический материал 41
2.2 Получение и культивирование дендритных клеток человека 41
2.3 Получение и культивирование дендритных клеток мыши 42
2.4 Получение и культивирование Т клеток 42
2.5 Культивирование опухолевых клеток 43
2.6 Оценка пролиферации CD4 Т-лимфоцитов + 43
2.7 Иммуноферментный анализ 43
2.8 Проточная цитофлуориметрия и клеточный сортинг 44
2.9 Оценка инфильтрации тканей ДК и другими иммунными клетками 45
2.10 Изучение индуцированных опухолью изменений в дендритных клетках in vitro 45
2.11 Совместное культивирование опухолевых клеток с незрелыми ДК мыши с использованием полупроницаемых матриц-вставок 46
2.12 Изучение индуцированных опухолью изменений в дендритных клетках in vivo 46
2.13 Изучение влияния Интерлейкина-15 (ИЛ-15) на жизнеспособность дендритных клеток в присутствии опухоли in vitro 48
2.14 Изучение влияния Интерлейкина-15 (ИЛ-15) на жизнеспособность дендритных клеток в присутствии опухоли in vivo 48
2.15 Изучение влияния Активина А на дендритные клетки мыши in vitro 49
2.16 Регуляция влияния опухолевого микроокружения на дендритные клетки мыши in vivo с помощью сверхнизких доз препарата паклитаксел 53
2.17 Окрашивание гематоксилин и эозином. 56
2.18 Окрашивание на клеточную гибель методом TUNEL 56
2.19 Микроскопия 57
2.20 Статистический анализ 57
Глава 3 Результаты 58
3.1 Индуцированные опухолью изменения в дендритных клетках 58
3.2 Влияние Интерлейкина-15 (ИЛ-15) на жизнеспособность дендритных клеток в присутствии опухоли 65
3.3 Роль Активина А в улучшении эффективности терапии дендритными клетками 69
3.4 Регуляция влияния опухолевого микроокружения на дендритные клетки in vivo с помощью сверхнизких доз препарата паклитаксел 79
Глава 4 Обсуждение результатов 86
Выводы 92
Список сокращений 93
Список литературы 94
- Индуцированные опухолью патологические изменения дендритных клеток
- Индуцированные опухолью изменения в дендритных клетках
- Роль Активина А в улучшении эффективности терапии дендритными клетками
- Обсуждение результатов
Индуцированные опухолью патологические изменения дендритных клеток
Отдельного внимания заслуживает вопрос об изменениях ДК, которые опухоль индуцирует in situ и in vivo. В 1993 году Beсker сообщил о секретируемом раковыми клетками толерогенном цитокине — Интерлейкин-10 [91; 92]. Вскоре была продемонстрирована роль выделяемого опухолевыми клетками ИЛ-10 в контексте изменения антиген-представляющих свойств инфильтрирующих опухоль ДК [93]. Ряд исследований выявил, что не только раковые, но и другие клетки в опухолевом микроокружении выделяют влияющие на ДК факторы. Среди них можно особо отметить ИЛ-10, ИЛ-8, ИЛ-6, ТРФ-, фактор роста эндотелия сосудов, простагландины, ганглиозиды, спермин, бромезинподобные пептиды (гастрин-рилизинг-пептид и Нейромидин В), Белки RANKL, HLA-G, CCL2, CCL20, лактат, гиалуроновую кислоту, монооксид азота, активные формы кислорода и пр. [94].
Благодаря данным исследований, стали известны характерные виды патологических изменений в ДК у онкологических пациентов. Эти исследования подтверждают способность опухоли угнетающе влиять на дифференцировку и функциональную активность ДК in vitro и in vivo. Именно вызванные опухолью изменения ДК в значительной степени предопределяют неполноценный противоопухолевый иммунитет и низкую эффективность различных методов иммунотерапии рака. Среди наиболее значимых изменений функций ДК при раке можно выделить:
1. Нарушения образования, дифференцировки и созревания ДК;
2. Индукцию апоптоза предшественников ДК и самих ДК;
3. Ингибирование презентации антигенов ДК;
4. Конверсию ДК в иммуносупрессорные регуляторные ДК;
5. Нарушение миграции ДК.
Нарушения образования, дифференцировки и созревания ДК
Снижение местной численности популяции дендритных клеток при про-грессировании опухолевого процесса было продемонстрировано при меланоме [54] и плоскоклеточном раке кожи [95]. Также была доказана тенденция к сокращению числа циркулирующих в периферической крови ДК у онкологических больных с различными солидными опухолями [96], что нашло подтверждение в исследованиях пациентов с множественной миеломой и немелкоклеточным раком легких [97; 98].
Кроме того, было выявлено негативное влияние опухоли на процесс образования ДК — дендропоэз [99; 100]. Например, было доказано, что культивирование совместно со средой от раковых клеток, равно как и с самими опухолевыми клетками, тормозит образование ДК из гемопоэтических клеток-предшественников in vitro и in vivo. Совместное культивирование мышиных ге-мопоэтических клеток-предшественников, либо CD34+ клеток-предшественников человека с клетками нейробластомы приводит к значительному (до 90%) сокращению образования ДК in vitro [101]. Схожие наблюдения отмечались при совместном культивировании с клетками линии рака простаты и рака легкого [102]. Моноциты, выделенные от больных с глиобластомой, отличаются низкой способностью дифференцироваться в зрелые ДК [103], что нашло подтверждение при изучении воздействия других видов опухолей на ДК [104].
ДК, образующиеся в организме больных раком, имеют ограниченный потенциал к полноценному созреванию. Например, ДК у пациентов с поздней ста 22 дией колоректальной аденокарциномы не экспрессируют маркеры созревания в ответ на стимуляцию липополисахаридом [105].
Среди секретируемых опухолью факторов стоит отметить эндотелиальный фактор роста сосудов (VEGF), который достоверно ингибирует дифференцировку ДК при раке [106]. Например, у больных с колоректальным раком количество ДК находится в обратной пропорциональной зависимости от уровня VEGF в сыворотке крови. Среди других угнетающих ДК секретируемых опухолью факторов можно отметить ИЛ-6 [107], контролирующий экспрессию М-КСФ рецепторов на моноцитах и их дифференцировку в макрофаги. Кроме того, сообщалось о влиянии секретируемого опухолью трансформирующего ростового фактора (ТРФ) и ИЛ-10 на снижение экспрессии поверхностной костимуляторной молекулы CD80 на ДК у больных миеломой [68].
Анализ маркеров дифференцировки внутриопухолевых ДК показал наличие зависимости степени зрелости ДК от локализации ДК в пределах опухоли. Так при раке молочной железы незрелые CD1a+ ДК обнаруживались в опухолевом ложе, в то время как зрелые CD83+DC-LAMP+ ДК выявлялись в перитуморальной зоне. Схожим образом отмечалась инфильтрация опухолевых узлов преимущественно CD1a+ ДК, в то время как перитуморально было больше S-100+CD1a- ДК. В инвазивном крае колоректальной карциномы зрелые CD83+ ДК формировали кластеры с Т клетками, в то время как незрелые CD1a+ ДК были рассеяны и редко формировали кластеры с лимфоцитами. При оральном плоскоклеточном раке [108], холангиоцеллюлярной карциноме [109], раке желчного пузыря [110], почечной аденокарциноме [111] отмечалось, что инфильтрирующие опухоль ДК обладают преимущественно незрелым фенотипом.
Индукция апоптоза ДК и их предшественников
При совместном культивировании ДК и клеток различных линий опухолевых клеток отмечается время и дозозависимое усиление апоптоза в ДК под воздействием выделяемых опухолью факторов. Более того, в инфильтрирующих опухоль ДК определяется значительно более высокий уровень апоптоза, чем в ДК, полученных из селезенки этих животных [112]. Рядом исследователей сообщалось об индуцированной опухолью гибели клеток-предшественников ДК [113], ускорении раннего апоптоза ДК в опухолевом микроокружении [114] и наличии ко-роткоживущих моноцитарных ДК у пациентов с распространенным раком [115; 116].
В активации апоптоза в ДК под влиянием опухоли участвуют несколько сигнальных путей. Эти сигнальные пути регулируются белками Bcl-2, Bcl-xL, Bax, FLIP, цитохромом С и другими молекулами [117; 118]. Вместе с тем активация сигнальных путей CD40, ИЛ-15 и ФНО- способна нарушать индуцированный опухолью апоптоз ДК [112; 119]. Среди выделяемых опухолью молекул, которые усиливают апоптоз ДК, можно отметить гиалуронан [120], ганлиозиды GM3 и GD3 [121], муцин [122], белок HMGB1 [123] и другие факторы. Даже на ранней стадии у пациентов с раком молочной железы в крови отмечалось существенно большее количество апоптотических ДК [119]. Секреция опухолью ТРФ- также способна индуцировать экспрессию лиганда программированной смерти programmed death-1 ligand — B7H1 на ДК [124].
Нарушение функции ДК под влиянием опухоли
Опухолевое микроокружение продуцирует цитокины и хемокины, обладающие иммуносупрессивным действием и препятствующие созреванию ДК и Т-лимфоцитов. Кроме того, для микроокружения опухоли характерно низкое содержание кислорода (гипоксия), обусловленное сниженной микроциркуляцией крови в опухолевой ткани. Гипоксия опухоли связана с опухолевой прогрессией, устойчивостью к радио- и химиотерапии [125], а также c изменениями фенотипа макрофагов [126]. В условиях гипоксии ДК имеют нормальный уровень экспрессии поверхностных маркеров и цитокинов, но их миграционная активность подавлена [127].
Опухолевые клетки производят энергию преимущественно с помощью активного гликолиза с последующим образованием молочной кислоты, а не посредством медленного гликолиза и окисления пирувата в митохондриях с использова 24 нием кислорода как в большинстве нормальных клеток. Молочная кислота является важным фактором, влияющим на ДК. Молочная кислота оказывает как негативное, так и положительное влияние на формирование Т клеточного иммунного ответа [128]. Натриевая соль молочной кислоты и метаболиты глюкозы подавляют фенотипическое и функциональное созревание ДК, что коррелирует с подавлением активации NF-B [129]. Под действием молочной кислоты изменяется экспрессия АГ в человеческих ДК моноцитарного происхождения и снижается секреторный потенциал ДК .
Индуцированные опухолью изменения в дендритных клетках
Под действием опухоли отмечалась выраженная индукция апоптоза в ДК in vitro и in vivo. В рамках работы данный процесс был продемонстрирован на примере совместного культивирования мышиных ДК с клетками мышиной меланомы линии B16 либо рака предстательной железы мыши линии RM1 на матрицах-вставках в течение 48 часов (рисунок 3). Данный эффект нашел подтверждение при культивировании предшественников человеческих ДК с клетками рака простаты человека линии LNCaP. В результате было выявлено усиление апоптоза в обработанных опухолью ДК по сравнению с контролем (39,1±4,5% против 8,6±1,2%, р 0,001, n=4) (рисунок 4).
Более того, при изучении воздействия опухоли на ДК in vivo, также отмечалось снижение экспрессии поверхностных костимуляторных молекул CD80 и CD86, что свидетельствовало о замедлении процесса функционального созревания ДК (рисунок 5). Под воздействием опухоли в дендритных клетках снижалась экспрессия молекул главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) I класса и участвующих в обработке антигенных белков молекул. Например, с помощью проточной цитометрии было обнаружено, что при коинкубации ДК с клетками плоскоклеточной карциномы линий PCI38 и PCI4B снижалась экспрессия субъединиц иммунопротеосом LMP2, LMP7 и LMP10, протеосомы MB-1 и оксидоредуктазы ERp57.
В ходе экспериментов in vitro наблюдалась выраженная поляризация опухолью классических ДК в иммуносупрессивные ДК (рисунок 6). Культивирование предшественников ДК (in vitro день 5) со средой от опухолевых клеток легочной карциномы Льюиса (линия 3LL) в течение 72 часов приводило к конверсии субпопуляции классических CD11chighCD11blow/neg ДК в иммуносупрессорные CD11clowCD11bhigh ДК. При добавлении супернатанта от опухоли уровень имму-носупрессорных ДК увеличивался с 1,56±0,22% в контрольной группе до 9,86±0,61% (p 0,05). Одновременно отмечалось четырехкратное снижение количества классических ДК по сравнению с контролем (p 0,05).
Далее для подтверждения эффекта поляризации опухолью зрелых ДК, производилось совместное 72 часовое культивирование полученных ex vivo из легких здоровых мышей классических CD11chighCD11blow/neg ДК с клетками линии 3LL на матрицах-вставках. Полученные в результате совместного культивирования поляризованные ДК ингибировали пролиферацию предактивированных кон-кавалином А Т клеток in vitro, что подтверждалось в исследовании с захватом радиоактивного 3Н-Тимидина и количественно выражалось как снижение числа событий в минуту (рисунок 7).
Далее проводилась оценка влияния поляризованных регуляторных ДК на процесс роста опухоли in vivo.
Иммуносупрессорные CD11clowCD11bhigh ДК получались из культуры мышиных ДК после обработки супернатантом клеток мышиной легочной карциномы Льюиса (линия 3LL). Методом клеточного сортинга на аппарате FACS выделялись CD11clowCD11bhigh иммуносупрессорные ДК и CD11chighCD11blow/neg классические ДК. После внутривенного введения 1/10 от минимальной туморогенной дозы клеток линии 3LL, полученные дендритные клетки вводились группам животных на 3 и 10 день. В группах животных, получивших в качестве терапии 0,9% раствор NaCl (контрольная группа) или классические ДК (группа 3LL+кДК) в легких не отмечалось образование опухолевых узлов. Однако среди животных, которым вводились иммуносупрессорные регуляторные ДК (группа 3LL+регДК) у 30% мышей развились опухоли (рисунок 8).
Далее для оценки влияния иммуносупрессорных регуляторных ДК на активность Т клеток in vivo из селезенок мышей всех групп выделялись Т-лимфоциты. К Т-лимфоцитам добавлялась контрольная среда (черные столбики), либо облученные клетки линии 3LL (серые столбики) (рисунок 8). Затем методом ИФА в супернатантах оценивалась продукция ИФН-у. В группе 3LL+regDC отмечалось снижение количества ИФН-у, секретируемого Т-лимфоцитами (0,516+0,01 пг/мл) по сравнению с контрольной (19,366+1,82 пг/мл) и группой классических ДК (3LL+cDC) (27,026+1,96 пг/мл) (р 0,05 между группами, ANOVA).
Для подтверждения полученных данных, эксперимент был выполнен с введением минимальной туморогенной дозы клеток линии 3LL. В этом случае сохранялась тенденция к пропорциональному увеличению количества опухолевых узлов в группе регуляторных ДК и отмечалось ингибирование регуляторными ДК опухолеспецифических цитотоксических Т-лимфоцитов (рисунок 9).
Подводя итог, следует отметить, что в ходе многократных экспериментов получены результаты, демонстрирующие негативное воздействие опухоли на ДК. Это воздействие приводит к снижению жизнеспособности, функциональной активности ДК, а также поляризации классических ДК в регуляторные ДК. В итоге комплекс описанных процессов приводит к нарушению способности организма к эффективному противоопухолевому ответу и усугубляет течение заболевания, что нашло подтверждение в полученных экспериментальных данных in vivo.
В связи с этим особую важность приобретает необходимость разработки подходов по улучшению жизнеспособности и функциональной активности препаратов ДК для повышения эффективности иммунотерапии ДК, поскольку в условиях опухолевого микроокружения ДК подвергаются неблагоприятному воздействию целого ряда факторов.
Роль Активина А в улучшении эффективности терапии дендритными клетками
Факторы семейства трансформирующего ростового фактора- (ТРФ-) играют ключевую роль в регулировании развития и гомеостаза, посредством контроля дифференцировки, пролиферации, поляризации и жизнеспособности различных типов клеток. Известно о иммуномодулирующих свойствах ТРФ- и его влиянии на различные клетки иммунной системы в опухолевом микроокружении. Однако менее изученной остается роль других членов семейства ТРФ- в опухолевом процессе.
Активин А является ключевым регулятором развития В-клеток и обладает способностью подавлять пролиферацию и индуцировать апоптоз в лимфоидных клетках. Открытым остается вопрос о влиянии Активина А на ДК как ключевые антигенпрезентирующие клетки в организме. В данном исследовании производилась оценка влияния Активина А на ДК in vitro и in vivo. В серии экспериментов использовались линии мышиной мелано-мы (B16) и мышиной легочной карциномы Льюиса (3LL).
На первом этапе была показана экспрессия рецепторов к Активину А (тип 1 и тип 2) на ДК. Для этого методом ОТ-ПЦР измерялась экспрессия мРНК рецепторов к Активину А (тип 1 ALK2, ALK4 и тип 2 ACTRIIB) в незрелых и зрелых ДК (день 0 и день 7 in vitro). Экспрессия белков обоих типов (I и II) рецепторов в культивируемых ДК была также подтверждена методом Вестерн-Блот (рисунок 14).
При ОТ-ПЦР с 3 дня в культуре в ДК выявляется мРНК рецепторов к Активину А in vitro. Метод электрофореза. Снизу. Экспрессия данных рецепторов подтверждается методом Вестерн-Блот После in vitro обработки Активином А (100 нг/мл) в течение 48 часов в ДК методом Вестерн-Блот определялся уровень общих и фосфорилированных белков SMAD2 и ERK1/2. Было выявлено, что под воздействием Активина А происходит более чем 2-кратная активация сигнальных путей SMAD2 и ERK1/2 (рисунок 15).
Далее проводился поиск факторов, которые секретируются дендритными клетками после обработки Активином А. При сравнении уровней секреции Г-КСФ, эотаксина, ГМ-КСФ, интерферона-, ИЛ-1, ИЛ-1 , ИЛ -2, ИЛ -3, ИЛ-4, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-9, ИЛ-10, ИЛ-12, ИЛ-13, ИЛ -15, ИЛ-17, IP-10, KC, LIF, LIX, MCP-1, М-КСФ, MIG, MIP-1, MIP-1, MIP-2, RANTES, ФНО- и VEGF в контрольных и обработанных Активином А ДК методом мультиплексного анализа Luminex (США) существенных отличий выявлено не было. Но отмечалось более чем 3-кратное увеличение производства лигандов семейства Фактора Некроза Опухоли (ФНО) — белков APRIL (TALL-2, TNFSF13A) и BAFF (TALL-1, TNFSF13B) (рисунок 16).
Затем было исследовано влияние факторов, выделяемых ДК после стимуляции Активином А на сингенные Т клетки.
Для этого на 5 день in vitro ДК в течение 48 часов стимулировались Акти-вином А (100 нг/мл), затем культивировались в течение 48 часов с предактивиро-ванными конкавалином А (2,5 мкг/мл) сингенными Т клетками. Для оценки разницы в пролиферации Т клеток использовался тест с захватом радиоактивного 3Н-тимидина (рисунок 17).
В экспериментах с нейтрализующими антителами in vitro была подтверждена роль факторов APRIL и BAFF, выделяемых ДК после стимуляции Активином А. С целью нейтрализации выделяемого ДК фактора APRIL выполнялось добавление блокирующего химерного белка TACI (TACI-Fc, 2,5-100 нг/мл) к совместно культивированным ДК и Т клеткам, что приводило к дозозависимому снижению способности ДК стимулировать Т клетки (p 0,05). В группе контрольных ДК наблюдалось усиление пролиферации Т клеток от 344±19 cpm (показатель контрольной группы) до 11476±1239 cpm (соотношение ДК к Т клеткам 1:30). В группе обработанных Активином А ДК пролиферация Т клеток повышалась до 20440±613 cpm, а добавление блокирующего белка TACI-Fc (100 нг/мл), снижало пролиферацию Т клеток до сопоставимого с группой контрольных ДК уровня (14244±223 cpm, p 0,05). Это позволило сделать вывод о ключевой роли секрети-руемого под воздействием Активина А ДК фактора APRIL в увеличении пролиферации Т клеток in vitro (рисунок 18).
В свою очередь, добавление блокирующего белка BAFF-R-Fc (10 нг/мл) к культурам клеток в аналогичных экспериментальных условиях предотвращало связывание BAFF, выделяемого ДК с рецептором на Т клетках, что приводило к снижению способности обработанных Активином А ДК блокировать индуцированный активацией апоптоз CD8+ Т клеток. Методом проточной цитометрии с окрашиванием на AnnexinV+ в контрольной группе было выявлено 76,3±6,9% AnnexinV+ Т клеток, 24,8±4,6% Т клеток были AnnexinV+ в культуре с добавлением контрольных ДК, 14,5±2,4% Т клеток были AnnexinV+, в группе обработанных Активином А ДК, а в группе обработанных Активином А ДК с добавлением нейтрализующих BAFF факторов 25,3±4,1% Т клеток были AnnexinV+ (p 0,05) (рисунок 19). Схожие данные были получены при использовании CD4+ Т клеток.
Методом проточной цитометрии с окрашиванием на Annexing оценивался уровень апоптоза в предактивированных конкавалином А в течение 48 часов Т клеток. В качестве контроля использована среда Т клеток. Верхний ряд. Добавление ДК (группа T+ДК) оказывало противоапоптотический эффект, усиливавшийся в случае предварительной обработки ДК Активином А (группа T+ДК/Активин). Нижний ряд. Добавление ко всем группам блокирующего антитела BAFF-R-Fc нивелировало данный эффект
Эти результаты позволяют сделать вывод о том, что секретируемый после обработки ДК Активином А белок BAFF способствует улучшению выживаемости Т клеток in vitro.
Эффективность метода предварительной обработки препаратов ДК Акти-вином А (100 нг/мл в течение 48 часов) была также подтверждена на моделях мышиной меланомы линии B16 и мышиной легочной карциномы линии 3LL. Оба эксперимента включали 3 группы: контрольная (терапия 0,9% раствором NaCl), группа ДК (терапия классическими ДК — 1106 клеток на введение) и группа ДК/Активин (терапия препаратом ДК — 1106 клеток на введение, предварительно обработанных в течение 48 часов Активином А в дозе 100 нг/мл).
Обсуждение результатов
Несмотря на достижения современной науки, по-прежнему актуальным и неразрешенным остается вопрос комбинирования различных подходов к иммунотерапии опухоли и традиционных методов лечения в рамках единой программы для онкологических пациентов. Разработка мер по повышению эффективности противоопухолевого иммунного ответа остается одним из важнейших направлений научных исследований в онкологии, поскольку одной из ключевых причин развития опухоли является нарушение нормальных функций иммунного ответа. Результаты научных исследований позволяют заключить, что опухоль представляет собой сложную биологическую систему, тесно связанную с организмом, в котором она возникла и развивается. При этом опухолевые клетки находятся в окружении разнообразных по своей природе факторов, формирующих их микроокружение. К клеточным и гуморальным факторам микроокружения опухоли относятся различные клетки и структуры, простые химические вещества и сложные макромолекулы. Все они способны прямо и опосредованно влиять на иммунную систему больного.
Поэтому стимуляция ответа опухолеспецифических иммунокомпетентных клеток способна существенно ограничивать процесс роста и распространения раковых клеток в организме. Однако также известно и о негативном влиянии микроокружения опухоли, которое «поляризует» иммунокомпетентные клетки в толерогенные подтипы благодаря секреции ряда факторов, нарушая тем самым полноценный противоопухолевый иммунный ответ, что усугубляет течение злокачественного процесса в организме больного.
В этой связи особую актуальность приобретает разработка подходов к восстановлению дисбаланса иммунной функции организма путем целенаправленного воздействия на выведенные из строя иммунокомпетентные клетки.
Лечение вакцинами на основе ДК является наиболее значимым направлением терапии онкологических больных с использованием ДК. По состоянию на сентябрь 2016 согласно данным U.S. National Institutes of Health в мире проводилось более 80 исследований терапии онкологических заболеваний вакцинами на основе дендритных клеток.
Стоит отметить, что результаты клинических исследований довольно противоречивы, одной из ведущих причин этого является отсутствие стандартизированных протоколов получения вакцин на основе аутологичных ДК. Существует необходимость в разработке критериев оценки качества препарата ДК в отношении таких аспектов создания ДК вакцин как: получение предшественников ДК, дифференцировка ДК in vitro, оценка жизнеспособности и иммунофенотипических характеристик вакцинных ДК, стерильность вакцинного препарата и др.
В рамках вакцинотерапии дендритными клетками существует множество факторов, способных негативно влиять на эффективность этого метода. Среди них можно выделить выбор источника дендритных клеток, способа их выделения, культивирования и добавляемых факторов для роста и созревания ДК, режима введения вакцин и опухолеспецифического антигена. ДК, генерированные in vitro с использованием различных протоколов приготовления вакцинного препарата, представляют собой различные клеточные популяции, и это, несомненно, затрудняет оценку клинической и иммунологической эффективности ДК-вакцины [262-264]. Также вакцинотерапия ДК может быть неэффективной вследствие узкой специфичности иммунизирующих эпитопов или одного иммуногенного эпитопа. В действительности, использование сложных опухолеассоциированных антигенов облегчает индукцию/активацию Т клеток с различными специфичностями Т клеточного рецептора, которые могут лучше контролировать заболевание и предотвращать уклонение опухоли от иммунобиологического надзора. Кроме того известно, что обработка ДК опухолеспецифическим антигеном приводит к превращению ДК в зрелую клетку, однако избыток зрелых дендритных клеток, вводимый пациенту при вакцинации нередко способен вызвать аутоиммунные реакции. Все упомянутые выше сложности, равно как и отсутствие единого протокола по проведению терапии вакцинами ДК и по дальнейшему наблюдению за пациентами приводят к значительным расхождениям в отмечаемых эффектах и побочных реакциях от такой терапии.
Среди исследователей сформировалось понимание, что для дальнейшего эффективного клинического использования ДК требуется стандартизация апробированных методов с целью дальнейшего изучения у больных с максимальным уменьшением объема опухолевой массы (циторедуктивные операции), минимальной остаточной болезнью, достаточной иммунокомпетентностью.
Известно, что судьба вводимых ДК в организм онкологических больных во многом предопределяется влиянием опухолевого микроокружения, поэтому разработка методов, способных нивелировать негативное воздействие раковых клеток на ДК является важным этапом развития данного биотерапевтического направления.
В настоящем исследовании использовались препараты ДК, не проходившие обработку опухолеспецифическими антигенами, поскольку исследователем ставилась задача по поиску универсальных механизмов защиты ДК от неблагоприятного воздействия опухоли вне зависимости от выбранного вида опухоли и/или опухолеспецифического антигена. Следует отметить , что способ введения ДК-вакцины является очень важным фактором успешной вакцинации. Несмотря на то, что ДК, нагруженные антигеном, могут непосредственно активировать Т клетки в регионарных по отношению к месту их введения лимфатических узлах, необходимо принимать во внимание способ введения ДК, так как от этого может зависеть качество иммунного ответа. Например, известно о преимущественной индукции Т-хелперов 1-го типа после внутрикожного и внутрилимфатического введения и Т-хелперов 2-го типа и образование антител при внутривенном введении [265].
Активированные эффекторные клетки мигрируют из места введения ДК вакцины в регионарные скопления лимфоидной ткани и активируют тканеспецифический иммунитет [266]. Внутривенное введение ДК вакцины, например, при меланоме кожи, исключает индукцию и миграцию эффекторных клеток кожи, тем самым, обедняя противоопухолевый иммунный ответ. Также показано, что при внутривенном введении ДК оседают в легочной ткани, печени, селезенке и не определяются в опухоли и лимфатических узлах.
В результате настоящей работы были получены данные, свидетельствующие о важной роли предварительной обработки препаратом ИЛ-15 (100 нг/мл в течение 48 часов) для защиты ДК от апоптоза и усилении их выживаемости, в том числе и при внутриопухолевом введении дендритных клеток. Данный положительный эффект приводил к выраженному торможению опухолевого роста в экспериментальной модели in vivo, что является следствием повышения жизнеспособности вводимых ДК.
Поиск путей к эффективной стимуляции дендритными клетками Т клеток привел к изучению влияния члена семейства ТРФ-, цитокина Активин А на ДК. В результате исследования подтверждены данные о наличии на дендритных клетках рецепторов к Активину А и о его стимулирующем действии на функциональную активность ДК. Под влиянием Активина А, дендритные клетки секретируют факторы BAFF и APRIL, напрямую усиливающие выживаемость и пролиферацию CD8+ Т клеток. В ходе экспериментов с перевиваемыми линиями опухолей in vivo в рамках настоящего исследования был продемонстрирован противоопухолевый эффект и увеличение продолжительности жизни животных при введении дендритных клеток, предварительно обработанных Активином А (100 нг/мл в течение 48 часов). При этом отмечалось существенное усиление образования опухолеспецифических ИФН-у производящих Т клеток in vivo, что отражало индукцию противоопухолевого иммунного ответа.
Комбинированная терапия биопрепаратами и химиопрепаратами является другим аспектом, который был исследован в рамках данной работы. Системное применение химиотерапевтических препаратов обладает характерным побочным действием, в некоторых случаях носящим необратимый характер. В связи с этим значительное внимание уделяется поиску новых форматов химиотерапии, способных сохранять противоопухолевый эффект, сочетая его с меньшим количеством осложнений. В результате в клиническую практику была внедрена метрономная терапия, подразумевающая применение меньших доз химиопрепаратов в течение длительного времени. В рамках настоящей работы был изучен новый подход к химиотерапии опухолей — «химоиммуномодуляция», при которой воздействие препарата в первую очередь направлено не на делящиеся опухолевые клетки, а на микроокружение опухоли, состоящее в том числе из собственных иммунносупрессорных клеток. Данные ряда исследований подтверждют особую роль, которую играют патологически измененные поляризованные иммунные клетки, в становлении и развитии солидных новообразований. Применение химиопрепаратов в дозе 1/20 от МПД достоверно способно увеличивать иммуногенность опухоли, стимулируя тем самым противоопухолевый ответ.