Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 13
1.1 Характеристика люминального В (Her2 отрицательного) рака молочной железы 14
1.2 Особенности системной терапии при люминальном В раке молочной железы .16
1.3 Возможные причины неэффективности химиотерапии у больных раком молочной железы 17
1.4 Молекулярно-генетические маркеры эффективности отдельных химиотерапевтических препаратов 23
Глава 2. Материалы и методы 32
Глава 3. Результаты 52
3.1 Влияние клинико-морфологических параметров на эффективность НАХТ в группе ретроспективного исследования 52
3.2 Влияние молекулярно-генетических параметров на эффективность НАХТ в группе ретроспективного исследования 55
3.3 Разработка алгоритма персонализированного назначения НАХТ больным РМЖ на основании результатов ретроспективного исследования и данных литературы 65
3.4 Валидация разработанного алгоритма. Проспективное исследование .75
Заключение 83
Выводы 98
Практические рекомендации 99
Список литературы 100
- Особенности системной терапии при люминальном В раке молочной железы
- Молекулярно-генетические маркеры эффективности отдельных химиотерапевтических препаратов
- Влияние молекулярно-генетических параметров на эффективность НАХТ в группе ретроспективного исследования
- Валидация разработанного алгоритма. Проспективное исследование
Введение к работе
Актуальность проблемы
Рак молочной железы (РМЖ) на протяжении многих лет занимает лидирующие позиции по показателям заболеваемости и смертности среди женского населения как в мире, так и в России [Аксель Е. М., 2012; Каприн А. Д., 2016]. Рак молочной железы считается гетерогенным заболеванием. Согласно последним рекомендациям ESMO (European Society for Medical Oncology), NCCN (National Comprehensive Cancer Network), RUSSCO (Российского общества онкологов-химиотерапевтов) выделяют 5 молекулярных подтипов РМЖ: люминальный А, люминальный В [HER2 отрицательный], люминальный В [HER2 положительный], HER2 положительный, тройной негативный.
Определяющей чертой люминального В подтипа является, наряду с наличием экспрессии рецепторов половых гормонов, высокая пролиферативная активность (ki67>20%) опухоли [Senkus E., 2015; Бондаренко И. Н., 2016]. Данный тип встречается в 20-35% всех случаев рака молочной железы и чаще обнаруживается у более молодых женщин [Holm К., 2010; Regosa F., 2015; Liu Z., 2016]. Общая выживаемость пациентов с люминальным В РМЖ сравнима с данным показателем при тройном негативном и Her2-позитивном раках, которые давно признаны новообразованиями, характеризующимися наиболее агрессивным течением и неблагоприятным исходом В., 2011; Heiser L. M., 2012; Liu Z., 2016].
Учитывая молекулярные особенности люминального В РМЖ, пациентам с данным типом опухоли показано проведение как гормоно-, так и химиотерапии [рекомендации ESMO 2016]. Однако, известно, что люминальные опухоли молочной железы менее чувствительны к проведению химиотерапии по сравнению с трижды негативными и Her2 положительными новобразованиями [Esserman L. J., 2012; Kaufmann M., 2012; Kim M. M., 2013].
В настоящее время цитостатическая терапия активно используется в
неоадъювантном режиме [Артамонова Е.В., 2013; Семиглазов В.Ф., 2016]. Это
продиктовано, во-первых, стремлением к уменьшению объема первичной
опухоли, что создает более благоприятные условия для выполнения
органосохраняющих операций [Schott A.F., 2012; Семиглазов В.Ф., 2016]; во-
вторых, определением чувствительности первичной опухоли к проводимой
химиотерапии in vivo, что позволяет адекватно планировать лечение в
адъювантном режиме, а в-третьих, достижение полной морфологической
регрессии (ПМР) способствует улучшению отдаленных результатов
[Kaufmann M., 2012; Prowell T. M., 2012; von Minckwitz G., 2012; Sikov W. M.. 2015].
Частота развития ПМР опухоли на фоне химиотерапии неодинакова для разных молекулярных подтипов, и если при тройном негативном РМЖ она колеблется от 22 до 58% [Liedtke C., 2008; Carey L., 2010; Kaufmann M., 2012; Sikov W. M., 2015], то при люминальном В составляет всего 6 - 9% [Schott A.F., 2012; Sikov W. M., 2015].
В последнее время, в литературе появились данные, свидетельствующие о том, что не только ПМР, но также и выраженная частичная регрессия опухоли в ответ на НАХТ ассоциирована с улучшением отдаленных результатов лечения [Miller М., 2014; Symmans W. F., 2007].
Однако, далеко не всегда цитостатическая терапия оправдывает
возложенные на нее надежды. В качестве одной из наиболее значимых причин
неэффективности химиотерапиитерапии злокачественных новообразований
рассматривается множественная лекарственная устойчивость (МЛУ)
опухолевых клеток, которую наиболее часто связывают с работой энергозависимых ABC-транспортеров (ATP-Binding Cassette), осуществляющих выброс цитостатических и таргетных препаратов из опухолевых клеток против градиента концентрации с затратой энергии АТФ. Семейство ABC-транспортеров (ATP-Binding Cassette), насчитывает 50 генов и главными подсемействами являются ABCB, ABCC и ABCG. По данным литературы 75-85% наблюдений низкой эффективности химиотерапии при РМЖ обусловлено развитием МЛУ клеток опухоли [O'Driscoll L., 2006; Gillet J.P., 2012; Eechoute K., 2011; Kathawala R. J., 2015]. Имеются сведения о том, что высокие уровни экспрессии некоторых АВС-транспортеров коррелируют с резистентностью к ХТ при раке легкого, простаты, почки, толстой кишки, молочной железы и нейробластоме [Ambudkar S.V., 2003; Munoz M., 2007; Cole S., 2014]. Однако, стоит отметить, что данные о связи экспрессии АВС транспортеров с эффективностью НАХТ при РМЖ в клинических исследованиях не всегда однозначны [Trok B. J., 1997; Burge H., 2003; Сlarkе R., 2012].
В изучении влияния работы АВС-транспортеров на химиорезистентность новообразований особый интерес представляют исследоваания хромосомных аберраций в локусах генов МЛУ. Хромосомные аберрации (делеции, амплификации) хромосомных регионов и отдельных хромосом называют изменениями числа копий ДНК (СNV – copy number variation). CNV особенно распространены в солидных опухолях различных локализаций, и в частности, в новообразованиях молочной железы Horlings, 2010].
В ряде исследований была показана сопряженность между амплификацией локусов генов некоторых АВС-транспортеров и низкой эффективностью химиотерапии при злокачественных новообразованиях [Pang E., 2005; Flahaut M., 2006; Wang K., 2014]. Что же касается изучения связи делеции локусов генов МЛУ с чувствительностью опухоли к химиотерапии, то таких исследований в литературе практически не представлено.
В последнее время стало известно, что CNV и в других хромосомных регионах (не являющихся генами АВС-транспортеров), также ассоциированы с химиорезистентностью опухолевых клеток , 2011; Liedtke C., 2009; Wikman H., 2012]. В целом, данные о влиянии CNV в различных регионах хромосом на эффективность НАХТ при раке молочной железы единичны, противоречивы и нуждаются в дальнейшем изучении.
Даже в случае высокой вероятности достижения объективного ответа
опухоли в ответ на предоперационную химиотерапию, не решенной остается
проблема выбора схемы лечения. С этих позиций обсуждается значимость
определенных молекулярно-генетических характеристик опухоли,
претендуюших на роль маркеров монорезистентности.
Наиболее изученным критерием эффективности отдельных
конвенциональных цитостатических препаратов при раке молочной железы является амплификация локуса гена топоизомеразы IIа (Тор2а) (17q12-21), которую связывают с высокой чувствительностью опухоли к антрациклинам [Konecny G. E., 2010; Wonshik H., 2011; Clarke R., 2012]. Одновременно с CNV в локусе гена Тор2а рассматривается предсказательное значение высокого уровня экспрессии этого белка [, 2011; Susini T., 2014].
В настоящее время для лечения больных РМЖ часто используется препарат кселода (капецитабин), который по своей сути является активным предшественником 5-фторурацила [Brouckaert O., 2012; Joensuu H., 2009]. Молекулярные маркеры эффективности указанных лекарственных средств также обсуждаются в литературе. Наиболее вероятным кандидатом на роль предиктора эффективности указанных препаратов является уровень экспрессии тимидилатсинтетазы (TYMS) [Kornmann M., 2003; Matsuoka K., 2004; Cho Y. 2011; Liu Y., 2016].
Говоря о поиске информативных критериев эффективности отдельных химиотерапевтических препаратов у больных РМЖ, стоит сказать об активно обсуждаемой в последнее время корреляции между наличием герминальной мутации BRCA1 и высокой чувствительностью опухоли к препаратам платины [Rottenberg S., 2008; Gronwald J., 2009; Byrski Т., 2010; Byrski Т., 2015].
С наличием мутации гена BRCA1 также сопряжена низкая эффективность таксанов у больных РМЖ [Byrski T., 2007; Kriege M., 2012]. Кроме того, изучается связь объективного ответа опухолей при применении данного класса препаратов с уровнем экспрессии -тубулина третьего типа с мутацией в локусе этого гена [Mozzetti S., 2005; Leskel S., 2011; Yuan S. F., 2012; Karki R., 2013; Zhang H. L., 2012].
Тем не менее, несмотря на большое количество проводимых фундаментальных и клинических исследований, однозначного мнения относительно предсказательной значимости изучаемых критериев, а также выбора схемы при РМЖ нет. А тот факт, что эффективность одних и тех же
цитостатических средств, применяемых для лечения пациентов со схожими
клиническими, морфологическими и иммуногистохимическими
характеристиками новообразований, может координально различаться, говорит
о необходимости поиска новых информативных маркеров, сопряженных с
высокой эффективностью химиотерапии в целом, и отдельных
химиотерапевтических препаратов в частности.
Цель исследования
Разработать и клинически апробировать методику персонализированного назначения неоадъювантной химиотерапии у больных люминальным В раком молочной железы с использованием молекулярно-генетических маркеров опухоли.
Задачи исследования
-
По результатам ретроспективного этапа исследования идентифицировать в опухолевой ткани молочной железы хромосомные аномалии (делеции и амплификации), ассоциированные с эффективностью НАХТ.
-
Оценить эффективность различных схем НАХТ в зависимости от исходного уровня экспрессии генов монорезистентности (Top2, TUBB3, TYMS) в опухолевой ткани больных РМЖ.
-
На основании определения хромосомных аберраций и уровня экспрессии генов монорезистентности в ткани опухоли разработать алгоритм принятия решения в отношении целесообразности проведения предоперационной химиотерапии и выбора схемы у больных РМЖ.
-
Провести клиническую валидацию разработанного алгоритма персонализированного назначения НАХТ у больных люминальным В РМЖ.
Научная новизна
Впервые показана связь между делецией локусов генов АВС-транспортеров: АВСВ1-7q21.1, АВСB3-6p21.32, ABCC1-6p13.1, ABCG2-4q22.1, АВСС5-3q27, АВСВ7-Xq13.3 и высокой эффективностью предоперационной химиотерапии.
Впервые в ДНК опухоли молочной железы с помощью микрочипового исследования идентифицированы CNV в регионах, не являющихся генами АВС-транспортеров, связанные с объективным ответом на НАХТ: делеция 18р11.1 – 32; 11q21 – 25 регионов и амплификация1q21.3-44 региона.
Впервые на основании молекулярно-генетических характеристик опухоли разработан двухэтапный алгоритм персонализированного назначения НАХТ больным раком молочной железы, включающий определение показаний к предоперационному лечению и позволяющий выбрать оптимальную схему
химиотерапии. Показана высокая предсказательная значимость разработанного алгоритма в отношении увеличения показателей эффективности НАХТ у больных люминальным В РМЖ.
Практическая значимость
В ходе работы определены дополнительные информативные молекулярно-генетические предсказательные критерии у больных операбельными формами РМЖ: делеция генов АВС-транстпортеров (АВСВ1-7q21.1, АВСB3-6p21.32, ABCC1-6p13.1, ABCG2-4q22.1, АВСС5-3q27, АВСВ7-Xq13.3), а так же делеция 18р11.1 – 32; 11q21 – 25 регионов и амплификация1q21.3-44 региона.
Разработанный алгоритм позволил добиться высокой эффективности НАХТ: непосредственная эффективность лечения составила 88,5%; достижение полных морфологических регрессий наблюдалось у 19,2% пациентов.
Использование алгоритма в клинической практике позволило не только существенно увеличить показатели эффективность НАХТ, но и избежать необоснованного назначения цитостатических препаратов при отсутствии показаний к их применению.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Ряд CNV опухоли, такие как, делеции локусов генов АВС-транспортеров: АВСВ1, АВСВ3, ABCB7, АВСС1, АВСС5, АВСG2, ABCG4, а так же делеции 11q21-25, 18p32-11.1 регионов и амплификация 1q21.3-44, могут рассматриваться в качестве дополнительных информативных предсказательных критериев у больных раком молочной железы.
-
Высокий уровень экспрессии топоизомеразы II сопряжен с высокой эффективностью антрациклинов, высокий уровень экспрессии тимидилатсинтетазы ассоциирован с высокой частотой регрессии новообразований при проведении неоадъювантной химиотерапии по схемам, включающим кселоду, уровень экспрессии тубулина третьего типа значимо не влияет на эффективность таксанов.
-
Применение разработанного алгоритма персонализированного назначения неоадъювантной химиотерапии при определении тактики лечения больных люминальным В раком молочной железы позволяет в 88% наблюдений добиться объективного ответа опухоли при этом в 19,2% - полной морфологической регрессии и у 65% пациентов обеспечивает выраженное уменьшение размеров новообразования более, чем на 80% от первоначального объема.
Апробация диссертации
Основные положения диссертации доложены на конференциях молодых ученых «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии»
(Томск, 2014 – 2015); на постерной сессии VIII съезда онкологов и радиологов стран СНГ (Казань, 2014); на XIX Российском онкологическом конгрессе (Москва 2015); на II ежегодном конгрессе Российского общества онкомаммологов (Сочи, 2015); на заседании областного общества онкологов (Томск 2016); на III ежегодном международном симпозиуме Российского общества онкомаммологов (Франция, Антиб, 2016).
Личный вклад автора
Личный вклад автора состоит в непосредственном участии на этапах
отбора пациенток, вошедших в исследование, проведения больным курсов
неоадъювантной химиотерапии, хирургического вмешательства и
адъювантного лечения, оценке результатов исследования, их обработке, интерпретации, а также подготовке и оформлении научных публикаций.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 22 работы, из них 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК, 1 статья в зарубежном издании, 19 тезисных работ в материалах региональных, всероссийских и международных съездов и конференций. Получен 1 патент и зарегистрирована 1 база данных.
Объем и структура диссертации
Особенности системной терапии при люминальном В раке молочной железы
Молекулярная классификация РМЖ коренным образом изменила подходы к выбору объема системного лечения [10, 18, 50]. В настоящее время, при люминальном В (Her2 отрицательном) РМЖ, который наряду с наличием рецепторов половых гормонов характеризуется высокой пролиферативной активностью (ki67 20%), показано проведение эндокрино-и химиотерапии [3, 137].
В литературе имеются указания на то, что эстрогенрецептор положительные опухоли с высоким индексом пролиферативной активности, т.е. новообразования, которые могут быть рассмотрены, как представители люминального В типа, значительно хуже реагируют на эндокринную терапию, чем опухоли с низкими значениями Ki67 [15, 18, 131].
Так же известно, что люминальные опухоли молочной железы менее чувствительны к проведению химиотерапии по сравнению с трижды негативными и Her2 положительными новобразованиями [44, 55, 74, 76].
В настоящее время ХТ активно используется в неоадъювантном режиме [2, 9]. Это продиктовано, во-первых, стремлением к уменьшению объема первичной опухоли, что создает более благоприятные условия для выполнения органосохраняющих операций [10, 135]; во-вторых, определением чувствительности первичной опухоли к проводимой химиотерапии in vivo, что позволяет по результатам оценки эффективности адекватно планировать лечение в адъювантном режиме. В-третьих, достижение полной морфологической регрессии (ПМР) способствует улучшению отдаленных результатов [56, 74, 96, 126, 152]. Ретроспективный анализ двух крупных рандомизированных исследований National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project (NSABP) B-16 и В-27 показал, что у больных раком молочной железы при достижении ПМР показатели общей и безрецидивной выживаемости были значительно выше по сравнению с пациентами, у которых данный эффект химиотерапии получен не был [39, 94, 129]. Мета-анализ проведенный в 2012 году, включавший результаты 7 крупных рандомизированных исследований по оценке эффективности НАХТ у 6377, показал связь ПМР с увеличением безрецидивной выживаемости у пациентов с люминальный В (HER2 отрицательным), HER2 положительным (не люминальным) и трижды негативным РМЖ. В то время, как для опухолей люминального А и люминального В (HER2 положительного) подтипов данной ассоциации получено не было [152]. Однако, частота развития ПМР неодинакова для разных молекулярных подтипов.
Так, по результатам III фазы рандомизированного исследования GeparTrio, включающего 2072 пациентки, получивших 6–8 курсов неоадъювантной химиотерапии по схеме ТАС (доцетаксел 75 мл/м2, доксорубицин 50 мг/м2, циклофосфамид 500 мг/м2), достижение полных морфологических регрессий у больных тройным негативным и Her2 положительным раком отмечалось в 38,9 % и 39 % наблюдений соответственно по сравнению с 10 % при люминальном В типе РМЖ (р 0,0001) [152]. А по мнению ряда авторов, частота развития ПМР при люминальном В РМЖ не превышает и 9 % [74, 135].
В последнее время, в литературе появились данные, свидетельствующие о том, что не только ПМР, но также и выраженная частичная регрессия опухоли в ответ на НАХТ, ассоциированы с улучшением отдаленных результатов лечения [102, 144].
Предоперационная химиотерапия у больных РМЖ далеко не всегда оправдывает возложенные на нее надежды. В качестве одной из главных причин ее не эффективности в настоящее время рассматривают множественную лекарственную устойчивость (МЛУ), под которой понимают невосприимчивость клеток или организма одновременно к целому ряду лекарственных препаратов разного химического строения и с разным механизмом действия. Она определяется как снижение чувствительности до такой степени, что клетки способны размножаться при воздействии на них препарата в критической или более высокой концентрации [61]. Феномен МЛУ имеет важное клиническое значение, поскольку представляет собой серьезное препятствие на пути успешного лечения многих злокачественных опухолей. Развитие МЛУ к используемым лекарственным препаратам является одним из проявлений фундаментального биологического свойства всех живых организмов – приспособления к изменениям условий внешней среды. Исследования последних лет показали, что молекулярные механизмы МЛУ многообразны, и лекарственная устойчивость может определяться включением различных биологических систем, характеризующих разные этапы осуществления токсического действия химиопрепарата – от ограничения накопления лекарства внутри клетки до отмены программы гибели клеток, индуцируемой веществом [149]. Нередко в клетке включается несколько защитных механизмов, однако чаще всего преобладает какой-то один. Наиболее изученным механизмом, клиническая значимость которого при определенных формах новообразований установлена, является активация трансмембранных транспортных белков - ABC-транспортеров (ATP-Binding Cassette) [4, 11].
Молекулярно-генетические маркеры эффективности отдельных химиотерапевтических препаратов
При поиске информативных критериев, сопряженных с эффективностью отдельных химиотерапевтических препаратов у больных РМЖ, особое внимание в последнее время уделяется зависимости между наличием герминальной мутации BRCA1 и высокой чувствительностью опухоли к препаратам платины [29, 30, 31, 54, 90]. Это объясняется тем, что продукты двух супрессорных генов, BRCA1 и BRCA2, ассоциированных с раком молочной железы, входят в репарационный белковый комплекс, обладающий высокой чувствительностью к повреждению ДНК. Наряду с белками BRCA1 и BRCA2 в этот комплекс входят продукты других генов (ATM, MSH2, MLH1 и др.), участвующие в гомологичной репарации ДНК. При возникновении генетических дефектов в работе каких-либо белков комплекса, нарушается процесс репарации двунитевых разрывов ДНК, и мутантные клетки, как правило, погибают. Этим объясняется тот факт, что генетические дефекты в белках системы репарации двунитевых разрывов ДНК и, в частности, мутации в гене BRCA1, сопровождаются резким повышением чувствительности клеток к генотоксическим агентам, в том числе к препаратам платины [5]. Описанный молекулярный механизм подтверждается множеством исследований. Так, в 2015 году были опубликованы результаты работы Byrski et al., в которых сообщалось о достижении полной морфологической регрессии у 61 % пациентов на фоне НАХТ цисплатином. Данное исследование включало 107 пациенток, имеющих BRCA-ассоциированный РМЖ. В других, более ранних работах, частота полной морфологической регрессии при аналогичных условиях варьировала от 24% до 72% [29, 31, 54, 90].
Кроме того, что с наличием герминальной мутации гена BRCA1 сопряжен выраженный ответ опухоли на препараты платины, продукт данного гена также играет роль в регуляции митоза опухолевой клетки и может быть вовлечен в модулирование ответа на таксаны. Препараты указанного класса связываются с -тубулином и стабилизируют микротрубочки, тем самым блокируя их деполимеризацию и останавливая процесс формирования клеточного веретена. Это приводит к нарушению митоза [12, 97, 105]. Продукт гена BRCA1 участвует в обнаружении ненормального митоза и индукции апоптоза для предотвращения репликации анеуплоидных клеток [103, 105]. В исследованиях на клеточных линиях было показано, что индукция экспрессии гена BRCA1 после воздействия паклитаксела приводит к активации контрольной точки митоза (т.е. остановке деления клетки) и последующей клеточной гибели [107, 127]. Другими словами, для того чтобы изменения, происходящие в клетках опухоли под действием таксанов, привели к остановке ее деления, необходимо присутствие белка BRCA1. При отсутствии полноценного продукта гена BRCA1 реализация противоопухолевого действия указанного класса препаратов затруднена [69, 60]. Таким образом, дефицит продукта гена BRCA1, обусловленный его мутацией (при большинстве герминальных мутациях, как правило, образуется стоп-кодон), приводит к тому, что апоптоз опухолевых клеток под действием таксанов не индуцируется.
Связь мутации гена BRCA1 с низкой эффективностью таксанов продемонстрирована в ряде клинических исследований [14, 67, 79]. В работе Kriege et al. показано, что эстрогенрецептор отрицательные опухоли молочной железы у носительниц мутации BRCA1 значительно хуже отвечали на предоперационную химиотерапию таксанами, чем новообразования с таким же рецепторным статусом у пациенток, не имеющих мутацию гена BRCA1. Однако, для опухолей, имеющих рецепторы половых гормонов, данная зависимость не нашла подтверждения [79]. В другом исследовании, включившем 44 пациентки с BRCA-ассоциированным РМЖ, говорится о низкой эффективности таксанов при проведении НАХТ по сравнению с другими химиотерапевтическими препаратами. Указанное исследование не предполагало разделения пациентов на группы в зависимости от рецепторного статуса опухоли, хотя большинство больных также имело трижды негативный РМЖ [67].
Несмотря на большой интерес к изучению связи наследственных мутаций BRCA1 с чувствительностью новообразований к различным агентам, сопряженность аллельной делеции локуса гена BRCA1 в ткани опухоли с эффективностью различных химиотерапевтических препаратов в клинических исследованиях не рассматривается. Однако, в эксперименте на мышиной модели, показано, что при делеции в ткани опухоли гена BRCA1 наблюдаются биологические эффекты идентичные таковым при наличии герминальной мутации BRCA1 [87].
Кроме связи низкой эффективности таксанов с мутацией BRCA1, в литературе предложено еще несколько механизмов, ответственных за отсутствие чувствительности новообразований к указанному классу препаратов. Анализ представленных в литературе данных свидетельствует о том, что большая часть этих механизмов была описана в экспериментах с использованием таксанов в концентрациях значительно превышающих те, которые применяются в клинической практике [150].
Влияние молекулярно-генетических параметров на эффективность НАХТ в группе ретроспективного исследования
На диагностическом этапе всем больным проводилось клинико инструментальное обследование, включающее осмотр, общеклинические анализы (общий анализ крови, общий анализ мочи, биохимический анализ крови, исследование свертывающей системы крови), электрокардиограмму, РПГА на сифилис, анализ крови на определение маркеров ВИЧ и вирусных гепатитов, компьютерную томографию органов грудной клетки, маммографию, УЗИ молочных желез, зон регионарного лимфооттока, печени, сцинтиграфию костей скелета. Стадия заболевания устанавливалась согласно международной классификации по системе TNM (2009). Всем пациентам до начала лечения проводилась пистолетная биопсия новообразования с обязательным гистологическим и иммуногистохимическим исследованием и определением молекулярных подтипов опухоли. У пациентов из проспективной и ретроспективной групп дополнительно забирали образец опухолевой ткани из которого выделяли ДНК, РНК с последующим проведением микрочипового исследования и определением уровня экспрессии Top2a, TYMS, TUBB3. Морфологическое и иммуногистохимическое исследование опухолевой ткани
Для проведения морфологического исследования биопсийный материал фиксировался в 10–12% нейтральном формалине. Проводка осуществлялась по стандартной методике. Срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Гистологическое исследование выполнялось с применением светового микроскопа Carl Zeiss Axio Lab.A1 (Германия). Изучались ткань первичной опухоли и все удаленные лимфатические узлы. Диагноз рака молочной железы устанавливался согласно «Гистологической классификации опухолей молочной железы» (ВОЗ, 2012). Степень злокачественности определялась по модифицированной схеме P. Scarff, H. Bloom и W. Richardson.
Иммуногистохимическое исследование биопсийного материала проводилось по стандартной методике. Использовались антитела фирмы Dako к рецепторам эстрогена (клон 1D5, RTU, мышиные), прогестерона (клон PgR 636, RTU, мышиные), к онкопротеину c-erbB-2 (Her2/neu статус) (рабочее разведение 1:500, кроличьи), к Ki-67 (клон MIB-1, RTU, мышиные), фирмы Novocastra.
Выделение ДНК и РНК из опухоли Для молекулярных исследований образцы опухоли помещали в раствор RNAlater (Ambion, USA) и сохраняли при температуре –80С (после 24-часовой инкубации при +4С) для дальнейшего выделения РНК и ДНК. РНК выделяли с помощью набора RNeasy Plus mini Kit, содержащего ДНК-азу I (Qiagen, Germany, #74134) в соответствие с инструкцией производителя (http://www.qiagen.com/knowledge-and-support/resource center/resource-download.aspx?id=4a299ac7-4a55-4ae0-aaca f3ae8f66d9c1&lang=en). На первом этапе происходит лизис ткани опухоли молочной железы при помощи RLT буфера. В пробирку 1,5 мл на один образец ткани добавляли 600 мкл RLT-буфера, который содержит гуанидинизотиоцианат. Опухолевая ткань в пробирках с RLT измельчалась и прогревалась в течении часа при температуре 56С, периодически помешивая на вортексе. После инкубации лизат ткани опухоли молочной железы прогоняли через спин-колонки 1, содержащие ДНК-азу. После центрифугирования спин-колонки удалялись, а к стоку добавляли 400 мкл этанола и перемешивали. После добавления этанола образец переносили на спин-колонки 2 (MinElute RNeasy). После инкубации колонок при комнатной температуре в течение 3 мин они центрифугировались 15 сек при 10 000 об/мин. Сток из пробирки удаляли при помощи вакуумного насоса. Для очистки адсорбированной на мембране колонок РНК от примесей, колонки последовательно промывали промывочным буфером RW1 и дважды промывочным буфером RPE. После отмывок колонки помещали в новую пробирку с ингибитором РНК-аз Ribolock (Fermentas, Lithuania). В колонку добавляли 50 мкл miliQ воды и центрифугировали 1 мин при 10 000 об/мин. Потом добавляли еще 50 мкл воды и снова центрифугировали. Затем измерялись спектрофотометрические показатели РНК и ставился капиллярный электрофорез. На спектрофотометре NanoDrop-2000 (Thermo Scientific, USA) оценивали концентрацию и чистоту выделения РНК. Концентрация РНК составила от 80 до 250 нг/мкл, А260/А280 = 1,95-2,05; А260/А230 = 1,90-2,31. Целостность РНК оценивалась при помощи капиллярного электрофореза на приборе TapeStation (Agilent Technologies, USA) и набора R6K ScreenTape (Agilent Technologies, USA #5067-5367). RIN составил 5,6 – 7,8.
Валидация разработанного алгоритма. Проспективное исследование
Учитывая большой арсенал химиотерапевтических препаратов и схем, используемых для лекарственного лечения РМЖ, при наличии показаний к предоперационному лечению, значимым так же является рассмотрение вопроса о выборе схемы НАХТ. По этой причине следующим этапом исследования стало определение показаний к выбору отдельных цитостатических препаратов, основываясь на данных литературных и результатах ретроспективного исследования.
Так, показаниями к назначению антрациклинов, было наличие в опухолевой ткани амплификации локуса гена Тор2а, а так же высокий уровень экспрессии данного фермента. Пороговый уровень экспрессии, необходимый для назначения антрациклинов, был определен, как 4,1. К такому заключению мы пришли на основании результатов ретроспективного исследования, в котором из 46 пациентов, получавших предоперационную химиотерапию по схемам с включением антрациклинов (FAC, CAX), уровень экспрессии был определен у 45. В случае регрессии новообразования, медиана уровня экспрессии Тор2а была ровна - 4,599 (1,424 - 8,632), тогда как среди пациентов, у которых наблюдалась стабилизация или прогрессирование заболевания данный показатель был существенно ниже и составил 1,66 (0,843 - 4,096).
Вопрос о целесообразности назначения кселоды возникал в том случае, когда были показаны препараты антрациклинового ряда и осуществлялся выбор между использованием 5-фторурацила и кселоды, т.е. между назначением схемы FAC или САХ. Основным критерием, говорящем о необходимости применения кселоды, являлся высокий уровень экспрессии TYMS. Данный показатель, по мнению ряда авторов (S. W. Lam, H. Seki, A. Calascibetta), свидетельствует о низкой эффективности токсически переносимых доз 5-фторурацила. Учитывая способность кселоды метаболизироваться в активный 5-фторурацил и создавать в тканях опухоли локальные высокие концентрации 5-фторурацила, было высказано предположение о том, что в условиях гиперэкспрессии TYMS, указанный препарат будет более эффективен, чем 5-фторурацил в стандартно используемых концентрациях. Пороговое значение уровня экспрессии TYMS было определено на основании результатов ретроспективного исследования. Данный показатель мало отличался в группах с различной эффективностью НАХТ с использованием кселоды и составил 1,7 (1,05 – 3,48) в когорте пациентов с высокой эффективностью, и 1,02 (0,393 – 2,106) в опухолевой ткани больных с низкой эффективностью цитостатической терапии. Уровень экспрессии TYMS, являющийся показанием к назначению кселоды, был определен, как 2,1.
Учитывая многочисленные литературные данные (T. Byrski , T. Huzarski, R. Dent, J. Gronwald, J. Kladny, B. Gorski, J. Lubinski, S. A. Narod; K. Rhiem, B. Wappenschmidt, K. Bosse, H. Kppler, A.N. Tutt, R.K. Schmutzler), говорящие о связи наследственной мутации гена BRCA1 с нарушениям в работе системы репарации ДНК, и, как следствие, с высокой эффективностью ДНК-повреждающих агентов, а именно препаратов платины, было сделано заключение о том, что широкая представленность в опухолевой ткани клона с делецией локуса гена BRCA1, так же будет ассоциирована с высокой чувствительностью новообразования к препаратам платины. Именно поэтому делеция гена BRCA1, в случае представленности клона более 30%, была определена в качестве показания к назначению схем НАХТ с включением цисплатина. Кроме того, указанная хромосомная аберрация явилась противопоказанием к назначению таксанов (на основании данных литературы, говорящих о низкой эффективности этого класса препаратов у пациентов с герминальной BRCA мутацией (S. Akashianaka, Ch. Watanabe, T. Takamaru, T. Kuwayama, M. Ikeda, H. Ohyama, M. Mori, R. Yoshida).
При определении показаний к назначению таксанов в литературе обращают на себя внимание данные о связи высокой эффективности данной группы препаратов с низким уровнем экспрессии TUBB3 (R. Karki, M. Mariani, M. Andreoli, Sh. He, G. Scambia, Sh. Shahabi, C. Ferlini). Однако, определить пороговый уровень описанного показателя на основании результатов ретроспективного исследования не представлялось возможным, т.к. данный критерий был одинаков в группах больных с различным эффектом НАХТ. Из 13 пациентов, получавших таксаны, регрессия наблюдалась у 7, при этом медиана уровня экспрессии TUBB3 составила - 3,4 (0,1597 – 4,157), а в случае стабилизации или прогрессирования заболевания этот показатель был равен – 3,7 (0,112 – 6,108). Исходя из полученных данных, уровень экспрессии TUBB3 не вошел в алгоритм персонализированного выбора схемы химиотерапии. Учитывая тот факт, что низкий уровень экспрессии гена, зачастую сопряжен с делецией его локуса, сама делеция TUBB3 - 16q24.3 была предложена нами в качестве критерия для назначения таксанов. Таким образом, проведенный анализ литературных данных и результатов, полученных в ходе ретроспективного исследования, позволили определить критерии для выбора химиотерапевтических препаратов при назначении НАХТ больным РМЖ (рисунок 8).