Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Перитонеальный канцероматоз: новый взгляд на проблему (обзор литературы) 11
1.1. Анатомо-физиологические особенности брюшины 11
1.2. Эпидемиология и основные направления лечения перитонеального канцероматоза 19
1.3. Патогенетические механизмы развития перитонеального канцероматоза 27
Глава II. Материалы и методы исследования 36
2.1. Материал исследования 36
2.2. Подготовка и исследование биологических объектов методами световой и электронной микроскопии .43
2.3. Аппаратное обеспечение наноанатомического уровня исследований 48
2.4. Методы статистической обработки данных 50
Глава III. Результаты собственных исследований. Анатомо-физиологические предпосылки развития перитонеально канцероматоза 51
3.1. Особенности строения рельефа поверхности диафрагмальной и тазовой брюшины в норме по данным световой микроскопии .51
3.2. Возможности сканирующей электронной микроскопии в наноанатомических исследованиях интактной диафрагмальной и тазовой брюшины. 57
3.3. Сравнительная характеристика серозно-лимфатических люков интактной диафрагмальной и тазовой брюшины по данным растровой электронной микроскопии 65
3.4. Особенности строения диафрагмальной и тазовой брюшины при канцероматозе по данным атомно-силовой микроскопии 76
3.5. Патоморфологические особенности серозно-лимфатических люков диафрагмальной и тазовой брюшины при канцероматозе по данным светооптической микроскопии .79
3.6. Оценка состояния серозно-лимфатических люков диафрагмальной брюшины при канцероматозе по данным растровой электронной микроскопии 90
Глава IV. Обсуждение полученных результатов .96
Заключение 109
Выводы 116
Практические рекомендации 117
Список литературы 118
- Эпидемиология и основные направления лечения перитонеального канцероматоза
- Особенности строения рельефа поверхности диафрагмальной и тазовой брюшины в норме по данным световой микроскопии
- Сравнительная характеристика серозно-лимфатических люков интактной диафрагмальной и тазовой брюшины по данным растровой электронной микроскопии
- Оценка состояния серозно-лимфатических люков диафрагмальной брюшины при канцероматозе по данным растровой электронной микроскопии
Введение к работе
Актуальность исследования. Изучению строения и функции лимфатической системы брюшины посвящено значительное количество работ как отечественных, так и зарубежных ученых (Жданов Д.А., 1952; Банин В.В., 1981; Gordon E.J., Rao S., Pollard J.W. et al., 2010). В общедоступной литературе сведений об морфологических особенностях серозно-лимфатических люков брюшины - как части ее лимфатической системы при канцероматозе не приводятся.
К числу актуальных проблем современной онкологии относится перитонеальный канцероматоз. Значимость этой проблемы объясняется неудовлетворительными показателями общей выживаемости и негативным прогнозом. По данным многоцентрового проспективного исследования естественной истории развития ПК EVOCAPE 1 медиана общей выживаемости больных с перитонеальным канцероматозом составила 3,1 мес., средняя общая продолжительность жизни — 6,0 мес. (Wadhwa R., Song S., Lee J.S.et al., 2013). Недостаточная эффективность существующих методов противоопухолевой терапии во многом связана с существенными пробелами в понимании механизмов морфо- и патогенеза канцероматоза брюшины. В большинстве литературных источников под перитонеальным канцероматозом понимают распространение опухолевых клеток по поверхности брюшины с точки зрения имплантационной теории, но эти механизмы не объясняют развитие данного состояния при наличии первичной опухоли вдали от брюшной полости (например, при раке легкого, молочной железы и др.) (Yonemura Y., 2007; Ганцев Ш.Х., 2013-2016). Другие варианты диссеминации опухолевых клеток (например, лимфогенное) имеют системный характер, что меняет общепринятый в России патогенез канцероматоза брюшины, а это, в свою очередь, подталкивает к пересмотру в нашей стране общепринятых стандартов лечения данного состояния при раке. В связи с этим возникает
необходимость изучения данной категории пациентов для уточнения патогенетических механизмов распространения опухолевых клеток от первичного очага на поверхность брюшины, при котором выход раковых клеток на ее поверхность реализуется посредством серозно-лимфатических люков брюшины, являющиеся частью лимфатической системы в целом. Ясное представление патогенетических механизмов развития данного состояния позволит существенно модифицировать общепринятые подходы лечения этого инкурабельного процесса, что является несомненно актуальным. (Sugarbaker PH., 2008; Yonemura Y., 2012; Ганцев Ш.Х.,2015).
Цель исследования. Обоснование роли серозно-лимфатических люков брюшины и лимфогенного пути метастазирования в развитии перитонеального канцероматоза.
-
Изучить анатомическое строение серозно-лимфатических люков интактной париетальной брюшины с помощью светооптических и электронных микроскопов.
-
Провести сравнительную оценку серозно-лимфатических люков интактной диафрагмальной и тазовой брюшины по данным растровой электронной микроскопии.
-
Изучить регионарные особенности строения серозно-лимфатических люков диафрагмальной и тазовой брюшины в норме и при канцероматозе.
-
Изучить механизмы распространения опухолевых клеток по лимфатической системе брюшины как одного из механизмов развития перитонеального канцероматоза.
Научная новизна работы:
1. Изучены особенности регионарного строения серозно-лимфатических
люков диафрагмальной и тазовой брюшины в норме и при перитонеальном
канцероматозе с помощью светооптических и электронных микроскопов.
2. Проведена сравнительная количественная оценка серозно-
лимфатических люков интактной диафрагмальной и тазовой брюшины по
данным растровой электронной микроскопии.
3. Сформирована концепция развития перитонеального канцероматоза с
точки зрения лимфогенной теории метастазирования рака.
4. Представлена схема развития и масштаб перитонеального
канцероматоза в зависимости от уровня поражения лимфатического
дренажа.
Научно-практическое значение. Результаты исследования расширяют современные представления об основных патогенетических механизмах развития перитонеального канцероматоза с точки зрения лимфогенной теории метастазирования рака и являются неотъемлемой частью общей теории метастазирования. Полученные новые данные могут послужить опорной точкой оптимизации лекарственной терапии для профилактики метастазирования и снижения его масштабов при раке. Это позволит улучшить выживаемость данной категории больных.
Внедрение результатов работы. Результаты исследования внедрены и используются в учебном процессе кафедры онкологии с курсами ИДПО ФГБОУ ВО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздрава России. Итоговые результаты диссертационного исследования, посвященные вопросам пато- и морфогенеза перитонеального канцероматоза, используются при чтении лекций, проведении практических занятий для студентов, клинических интернов, ординаторов, аспирантов. Тема диссертационного исследования входит в план научных исследований
Научно-исследовательского института онкологии Башкирского государственного медицинского университета.
Личное участие автора в получении результатов. Автором осуществлено планирование научного исследования. Самостоятельно изучена и проанализирована литература по теме диссертации, освоены методики исследования, собраны, обработаны и проанализированы полученные результаты. Ряд исследований выполнены совместно с кандидатом медицинских наук, доцентом кафедры анатомии Башкирского государственного медицинского университета Р.С. Минигазимовым.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
-
Выявленные особенности регионарного строения серозно-лимфатических люков интактной париетальной брюшины свидетельствуют об отличиях их в резорбционной функциональной нагрузке в разных областях серозного покрова.
-
Патоморфологические изменения серозно-лимфатических люков и субмезотелиальных рельефообразующих структур париетальной брюшины при канцероматозе сопровождаются различной степенью обструкцией «люков» с последующим нарушением реабсорбционной функции серозного покрова.
-
По альтернативной (лимфогенной) теории развития перитонеальный канцероматоз представляет собой системный процесс, локусом поражения при котором являются серозно-лимфатические люки.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на ученом Совете лечебного факультета БГМУ (Уфа, Россия, 2013), заседании кафедры онкологии с курсами онкологии и патологической анатомии ИДПО БГМУ (Уфа, Россия, 2013, 2014, 2016), Международной телеконференции «Академическое сотрудничество в области онкологии» (Семей-Уфа, Россия, 2015). Основные положения
лимфогенной теории развития перитонеального канцероматоза были доложены на Международной Евразийской онкологической конференции (Уфа, Россия, 2013), в рамках саммита стран ШОС и БРИКС (Уфа, Россия, 2015), а также опубликованы в электронном формате. В конкурсах на лучшую научную работу молодых ученых ВУЗов и научных учреждений Республики Башкортостан в 2014 и 2016 годах исследовательская работа удостоена первого места в номинации «Медицинские науки. Фармация». "Прорывные направления в онкологии: роль и место молодых ученых".
Соответствие диссертации паспорту научной специальности.
Научные положения диссертации соответствуют формулам специальностям 14.01.12 – «Онкология» и 14.03.02 – Патологическая анатомия (медицинские науки). Результаты проведенного исследования соответствуют области данной специальности, конкретно пункту 2 паспорта научной специальности.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, среди них 5 – в научных изданиях, рецензируемых ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы из 152 наименований (29 отечественных и 123 зарубежных авторов). Работа иллюстрирована 9 таблицами, 5 диаграммами, 35 рисунками.
Благодарности. Считаю своим долгом поблагодарить научного руководителя проф. Ш.Х. Ганцева за выбор темы и постоянную помощь при выполнении работы, а также кандидата медицинских наук Р.С. Минигазимова за совместное осуществление ряда научно-практических аспектов данного исследования.
Эпидемиология и основные направления лечения перитонеального канцероматоза
В последние годы наблюдается тенденция к росту числа онкологических заболеваний органов брюшной полости, при этом увеличивается число распространенных форм заболевания [15, 24]. Одной из актуальных проблем современной онкологии является совершенствование методов лечения больных с отдаленными метастазами, при этом ПК остается наиболее опасным осложнением онкологических заболеваний брюшной полости. Значимость этой проблемы объяснятся рядом аспектов [15-18]:
1. Перитонеальный канцероматоз при определенных состояниях соответствует критерию М1, что относит больных в группу с негативным прогнозом;
2. Предложенные методы лечения больных с ПК в своем большинстве исходят из имплантационной теории канцероматоза. Эта теория рассматривает патологический процесс, как локальный, лечение которого в своем большинстве проводится на основе прямого воздействия на брюшинные патологические очаги;
3. Локальные методы лечения ПК имеют инвазивный характер, сопровождаются повреждением тканей, лимфореей, нарушением микроциркуляции органов брюшной полости.
Вопросы ПК широко обсуждаются онкологами во всем мире. Одним из значительных событий прошедшего года был X международный конгресс канцероматоза, прошедший в 2016 году в Вашингтоне, который был посвящен в основном методам совершенствования лечения этой категории больных [18]. В большинстве докладов было отмечено, что подходы к лечению больных ПК представляет собой сложную задачу, требующая дальнейшего изучения и совершенствования диагностических и лечебных технологий. По данным многоцентрового проспективного исследования естественной истории развития ПК EVOCAPE 1 исследователями было показано, что медиана общей выживаемости этих больных составила 3,1 мес., средняя общая продолжительность жизни — 6,0 мес. [26, 37, 61].
ПК представляет собой метастазирование злокачественных опухолей из желудочно-кишечного, овариального или мезенхимального источников с признаками поражения серозных оболочек имплантационным путем и/или посредством крово- и лимфотока [69, 73, 87, 89, 11]. В большинстве литературных источников под ПК понимают распространение раковых клеток на брюшину. При этом распространение раковых клеток происходит поверхностно с предпочтением определенных регионов, которые обладают незначительной подвижностью, как например, диафрагмальная поверхность, область слепой кишки или дугласово пространство. Считается, что опухолевые клетки, отделившиеся от пораженной опухолью органа являются источником ПК [123, 129, 135]. Причем большинство исследователей полагают, что низкодифференцированные формы опухоли характеризуются возможностью возникновения ПК из минимального количества жизнеспособных опухолевых клеток. Этому способствуют и операционные технологии - разрозненные во время операции группы опухолевых клеток образуют небольшие опухолевые конгломераты, которые могут свободно перемещаться по брюшной полости [65, 147, 148, 151].
Инвазия опухолью брюшины является самостоятельным неблагоприятным фактором прогноза, определяющим возможность диссеминации опухоли по брюшине с ранним интраперитонеальным рецидивом. Риск развития ПК значительно увеличивается при дистальной локализации поражения, циркулярном росте опухоли, трансформации ее на смежные органы и ткани, а также некрозе опухоли, приводящие к ее перфорации [18, 48, 49]. ПК является одной из основных причин смерти пациентов с онкологическими заболеваниями брюшной полости. Зачастую это связано с развитием метастатической (канцероматозной) кишечной непроходимости. Средний период между резекцией опухоли и развитием кишечной непроходимости, вызванной перитонеальными метастазами, составляет 19 месяцев [60, 62]. Литературный анализ многочисленных попыток систематизировать онкологическую патологию, осложняющуюся развитием ПК, позволяет выделить основные группы заболеваний, включающие [62, 66, 70, 87]: доброкачественные (в редких случаях) и злокачественные новообразования желудочно-кишечного тракта, гепато-билиарной системы, органов малого таза; первичные опухоли брюшины (мезотелиома первичная, перитонеальная аденокарцинома); новообразования без первично выявленного очага, мезенхимального происхождения (лимфомы, саркомы); муцинозные аппендикулярные злокачественные поражения брюшины. Злокачественные опухоли брюшины могут проявляться в виде злокачественного асцита, множественных мелких опухолевых узлов, опухолевых масс различных размеров, или диссеминированных отложений муцина, известных как перитонеальная псевдомиксома [64, 70].
Диссеминация опухолевых клеток в брюшной полости может происходить и при развитии первичной опухоли, но наиболее часто возникает как рецидив опухоли после радикального хирургического лечения [69]. У 10– 35% всех пациентов с рецидивирующим заболеванием, рецидив опухоли ограничивается только перитонеальной поверхностью. В большинстве случаев распространение злокачественных клеток по брюшине рассматривается как неблагоприятный прогностический фактор, данная форма прогрессирования опухолей практически не поддаётся хирургической коррекции, а существующие подходы в химиотерапии способны лишь на незначительное время облегчить состояние больного [54, 80].
ПК, по различным данным, развивается не менее чем у 20–35 % больных со злокачественными новообразованиями брюшной полости. Из них при раке поджелудочной железы – примерно в 40 %, раке желудка – в 30–40 % [107], колоректальном раке – до 10 % [100, 108]. Мукоидный (слизистый) рак и аппендикулярный рак показывают самые высокие показатели перитонеальной диссеминации [115]. Большая часть случаев ПК непосредственно связана со злокачественными новообразованиями яичников. Известно, что на момент установления диагноза рака яичников ПК выявляется у 65–70 % больных. Несмотря на то, что 60–80% случаев, диагностируемых на поздней стадии, достаточно адекватно реагируют на системную химиотерапию препаратами платины, прогноз остается неблагоприятным из-за высокого показателя рецидивов (5-летняя выживаемость 25%) [119]. Приблизительно у 50–75% женщин с опухолью яичников развиваются рецидивы. Инвазия капсулы яичников и диссеминация в брюшную полость – основной путь, которым распространяется рак яичников, наблюдается в 82% случаев, тогда как в 12% случаях вовлекаются ретроперитонеальные лимфатические узлы [124]. Как правило, данное состояние сопровождается обширным выпотом в серозную полость и многочисленными просовидными высыпаниями на поверхности брюшины, сливающиеся и образовывающие более крупные очаги.
Что касается рака желудка [107, 108], то несмотря на тенденцию к снижению уровня заболеваемости рак желудка сохраняет лидирующие позиции в структуре онкологической заболеваемости, а наиболее частым вариантом метастазирования является ПК, которую выявляют у 30-40% больных раком желудка. При лапаротомии у пациентов с потенциально резектабельным раком желудка метастазы по брюшине выявляют у 10 – 20% больных, в группе пациентов с диссеминированной формой перитонеальные метастазы (изолированные или в комбинации с другими метастазами) встречаются у 72% больных [93, 94]. Исследования интраоперационных смывов с брюшины свидетельствуют, что при поражении субсерозного слоя желудочной стенки частота обнаружения опухолевых клеток составляет, около 10%, тогда как при прорастании серозной оболочки она экспоненциально возрастает до 43%. Эта закономерность обусловлена тем, что инвазия серозной оболочки является самостоятельным неблагоприятным фактором прогноза, определяющим возможность диссеминации опухолевых клеток по брюшине с ранним интраперитонеальным рецидивом, а наличие опухолевых клеток является признаком распространенности заболевания и определяет паллиативный характер лечения [83, 136].
ПК при колоректальном раке выявляется в 10 % случаев на момент установления диагноза и является второй по частоте после метастазов в печень причиной смерти больных с колоректальным раком [123, 134].
Прогрессирование заболевания в виде ПК после радикальных операций встречается в 4-19% наблюдений. В случае рецидива колоректального рака ПК выявляют более чем у 44% пациентов [37]. У преобладающей части пациентов с колоректальным раком диагноз заболевания устанавливается в той стадии, когда опухолью уже поражены соседние органы, либо опухоль распространилась на брюшину [65].
Особенности строения рельефа поверхности диафрагмальной и тазовой брюшины в норме по данным световой микроскопии
Рельеф поверхности и рельефообразующие структуры интактной диафрагмальной и тазовой брюшины нами исследованы с помощью методов световой микроскопии на просвет и в отраженном свете. В норме визуально рельеф поверхности брюшины представляет собой ровную и блестящую на вид поверхность. При изучении рельефа поверхности париетальной брюшины исследуемых областей обнаруживаются различной формы, размерности, ориентации и регулярности возвышения и углубления. При световой микроскопии могут определяться истонченные участки брюшины, соответствующие местам расхождения отдельных пучков коллагеновых волокон поверхностного волнистого коллагенового и глубокого коллагеново-эластического слоев. Общий рельеф париетальной брюшины исследуемых областей определяется планом строения субмезотелиальных рельефообразующих структур, представленный регулярной волнистостью поверхностного волнистого коллагенового слоя. Он формируется при синхронизации спиралевидных волнистостей смежных коллагеновых волокон по длине шага и радиусу. Также одной из наиболее характерной, специфической особенностью рельефа диафрагмальной и тазовой брюшины является наличие на их поверхностей овальных или линейных возвышений и углублений размерами 0,2 х 0,2 мм до 0,5 х 1,5 мм. Они соответствуют местам расхождения отдельных пучков коллагеновых волокон поверхностных слоев брюшины и имеют часто округло-овальные формы. Стенки этих углублений образованны пучками коллагеновых волокон глубокого коллагеново-эластического слоя брюшины. Со стороны интимальной поверхности брюшины данные углубления отделены от серозной полости «окнами разряжения» (расходящимися пучками) коллагеновых волокон поверхностного волнистого коллагенового слоя, перфорированной базальной мембраной и одним рядом мезотелиальных клеток, являющиеся диафрагмой для субмезотелиальных полостей брюшины (серозно-лимфатических люков). При слущивании мезотелиальных клеток в базальной мембране диафрагмы «люка» под световым микроскопом определяется множество пор до 5 мкм. В коллагеново-волокнистых полостях располагаются лимфатические капилляры и сосуды. К коллагеново-волокнистым стенкам камеры «люка» изнутри прилегает стенка слепо начинающегося лимфатического капилляра, Лимфатический капилляр огибает трабекулы, обволакивая их своей стенкой.
Лимфа внутри лимфатического сосуда отделена от серозной полости стенкой лимфатического капилляра с ее прерывистой базальной мембраной, разряженным слоем поверхностного волнистого коллагенового слоя и одним рядом мезотелиальных клеток на перфорированной базальной мембране.
Данные серозно-лимфатические люки и определяют специфическую резорбирующую функцию брюшины данных областей. Методы световой микроскопии нам позволили обнаружить и изучить серозно-лимфатические люки разных областей серозного покрова, имеющие разные формы и размеры с консолидированными коллагеновыми волокнами в трабекулы, располагающиеся в просветах самих лимфатических капилляров и участвующие в их конструкции. В структуре серозно-лимфатических люков также можно обнаружить трабекулы, укрепляющие противоположные стенки «люка» (рис.4). Глубокий решетчатый коллагеново-эластический слой прослеживается на всем протяжении и является наиболее мощной частью волокнистой конструкции брюшины, содержит в себе мелкие кровеносные и лимфатические сосуды. В брюшине мышечной части диафрагмы определяются крупные серозно-лимфатические люки размерами от 200 до 300 мкм, располагающиеся в субмезотелиальных структурах брюшины. Лимфатические сосуды или лимфатические капилляры, формирующие такие серозно-лимфатические люки, часто имеют значительные размеры (до 200-250 мкм в диаметре) и называются синусоидными капиллярами. Присутствуют составные части диафрагмы серозно-лимфатического люка: мезотелий, перфорированная базальная мембрана и разряженные участки поверхностного волнистого коллагенового слоя. В этих местах осуществляется наиболее тесный контакт серозно-лимфатического люка с интимальной поверхностью брюшины, посредством которые осуществляется всасывание полостной жидкости, а также взвешенных в ней клеточных элементов и частиц.
При трехмерной световой микроскопии поверхности интактной брюшины исследуемых областей определяются многочисленные щелевидной формы углубления разных форм и размеров с четко ограниченными контурами. Большинство представленных серозно-лимфатических люков в исследуемых областях серозного покрова имеют вид крупных щелей, стенки которых соединены крупными трабекулами (рис.5). Часто размеры таких трабекул составляет до 3-5 мкм. В качестве идентификационного признака «люка» при трехмерной световой микроскопии является окончатое строение поверхностного волнистого коллагенового слоя.
Пленочный препарат. Импрегнация аммиачным раствором нитрата серебра. Мезотелиальные клетки слущены. Падающее отраженное освещение, оптическое увеличение 80
На представленном рисунке определяются относительно крупные, вытянутые, радиально направленные серозно-лимфатические люки, щелевидной формы, ориентированные параллельно друг к другу. В объемном изображении хорошо визуализируются элементы серозно-лимфатического люка. Стенки полостей серозно-лимфатических люков представлены относительно крупными спиралевидными пучками коллагеновых волокон глубокого волокнистого слоя. Тонкие извилистые коллагеновые волокна данного слоя брюшины синхронизированы между собой и собираясь в обособленные более толстые пучки участвуют в образовании стенок серозно лимфатических люков (рис.5). В построении микрорельефа поверхности как диафрагмальной, так и тазовой брюшины участвует поверхностный волнистый слой. Он отчетливо визуализируется на всем протяжении в виде высокоамплитудных коллагеновых волокон поверхностного волнистого коллагенового слоя, консолидированных в отдельные пучки диаметром 5-15 мкм (рис.6). Пучки данного слоя брюшины могут непрерывно перекидываются через противоположные стенки серозно-лимфатического люка, укреплять их и участвовать в образовании диафрагмы «люка».
Анатомическое строение париетальной брюшины тазового отдела очень схоже со строением брюшины диафрагмальной области. В частности, также имеются поверхностные лимфатические капилляры в области серозно лимфатических люков брюшины, но в меньшем количестве, находящиеся на уровне поверхностного волнистого коллагенового слоя. «Люки» имеют меньшие размеры, по сравнению с «люками» диафрагмальной брюшины, но также участвуют во всасывании перитонеальной жидкости. Часто они имеют размеры от 1 до 10 мкм, но также встречаются относительно крупные серозно лимфатические люки до 30-40 мкм. По данным трехмерной световой микроскопии количество крупных серозно-лимфатические люков в брюшине тазового отдела гораздо меньше по сравнению с диафрагмальной. Серозно лимфатические люки данных областей также участвуют в регуляции лимфообращения как в норме, так и при патологии. В свою очередь, участки поверхностного слоя брюшины, к которым примыкает поверхностный лимфатический капилляр имеют значительные изменения, адаптивные к функции «люков». Также наряду с серозно-лимфатическими люками необходимо отметить еще одну характерную особенностью рельефа поверхности серозных оболочек - это ее регулярная волнистость, которую невозможно интерпретировать трехмерного изображения совокупной поверхности подпокровных коллагеновых волокон (рис.6). В частности, поверхностный волнистый коллагеновый слой, плотно прилегающими друг к другу спиралевидными коллагеновыми волокнами, приобретает окончатый вид, создавая коллагеново-волокнистый каркас «люка». При этом одинарный ряд коллагеновых волокон, собираясь в пучки, создает «окна разряжения» поверхностного волнистого коллагенового слоя.
Сравнительная характеристика серозно-лимфатических люков интактной диафрагмальной и тазовой брюшины по данным растровой электронной микроскопии
Нами проведена количественная сравнительная анатомическая оценка серозно-лимфатических люков интактной диафрагмальной и тазовой брюшины по данными растровой электронной микроскопии.
На рис.12 отображены данные растровой электронной микроскопии интактной поверхности брюшины тазовой и диафрагмальной областей. Площадь исследования участка тазовой брюшины составила 26 882 мм2; диафрагмальной - 24 773 мм2. Определяются множественные «люки» первого типа. В центре рис.23b определяется крупный люк второго типа, находящийся в функционально-активном состоянии. Серозно-лимфатические люков тазовой брюшины имеют сложное микроскопическое строение и характеризуются более плотным расположением с гораздо меньшими размерами, по сравнению с «люками» диафрагмальной брюшины. При этом «люки» второго типа в брюшине тазовой области практически не определялись. Сравнительной анатомической характеристики методом растровой электронной микроскопии были подвергнуты 32 образца интактной диафрагмальной брюшины и 32 образца интактной тазовой брюшины. Сводные данные по количеству образцов исследуемых областей и их площадей представлены в таблице 7. Сравнительной анатомической характеристики методом растровой электронной микроскопии были подвергнуты те же образцы, на которых изучались морфологические особенности интактной париетальной брюшины (всего 64 образца).
Сравнительной анатомической характеристики методом растровой электронной микроскопии были подвергнуты те же образцы, на которых изучались морфологические особенности интактной париетальной брюшины (всего 64 образца). Для достоверности получения результатов исследования, сравниваемые области брюшины изучались под одним и тем же оптическим увеличением (939х). Это объясняется тем, что при данном увеличении серозно-лимфатические люки определялись как в диафрагмальной, так и в тазовой брюшине. В каждом исследуемом образце, размер которого составлял примерно 4,935,10 мм, поле сканирования при увеличении 939 раз выбиралось случайно и составляло примерно 215х225 мкм. Основные показатели сравниваемых областей брюшины представлены в табл.7. Таким образом площадь одного сканируемого образца диафрагмальной брюшины составила 51990±1808,5 мкм2; тазовой - 49116±1545,1 мкм2. Общая площадь исследования всех образцов составила 1 663 680 мкм2 и 1 571 712 мкм2 соответственно. Схожие площади исследования сравниваемых областей брюшины объясняются изучением одинакового поля сканирования при одном и том же увеличении одинакового количества образцов.
Изучение морфологических особенностей интактной диафрагмальной и тазовой брюшины проводилось в два этапа. На начальном этапе изучался микрорельеф поверхности брюшины при оптическом увеличении 100х-500х. При исследовании брюшины под малым оптическим увеличением обнаруживались крупные серозно-лимфатические люки только в диафрагмальной области без четкой детализации их структур. В брюшине тазовой области при оптическом увеличении до 500х «люки» не визуализировались. Последующим этапом морфологического исследования брюшины послужило изучение микрорельефа ее поверхности и серозно-лимфатических люков под большим оптическим увеличением. При оптическом увеличении 900х-2000х стали доступны визуализации составные элементы крупных серозно-лимфатических люков брюшины (стенки «люка», филаменты), а также мелкие «люки» брюшины тазовой области, имеющие диаметр меньше 5 мкм. Серозно-лимфатические люки в исследуемых областях брюшины были распределены неравномерно и определялись не на всех участках. В диафрагмальной брюшине обнаруживались как мелкие (от 3 до 10 мкм), так и относительно крупные (до 80-100 мкм) «люки». В тазовой брюшине преимущественно встречались «люки» малых размеров (до 3-5 мкм) с более плотным расположением, чем в диафрагмальной брюшине. Также визуализировались и относительно крупные «люки» для данной области диаметром до 20-25 мкм. Данный феномен можно объяснить разной резорбционной функциональной способностью различных областей серозного покрова. Для количественного подсчета и последующего сравнительного анализа серозно-лимфатических люков исследуемых областей проводилась их маркировка на отдельном графическом слое в программе «Adobe Photoshop CC» (Adobe Systems Software, Ltd., Ирландия). Затем маркеры извлекались в отдельный файл с белым фоном. Количество и диаметр «люков» подсчитывали в автоматическом режиме с помощью программы «Image Pro plus 6.0» (Media Cybernetics, Inc., США). На рис.13,14 продемонстрирован этап ручной маркировки и программного подсчета количества «люков» на иссеченных участках интактной тазовой и диафрагмальной брюшины на площади 98 715 мкм2.
Статистическая обработка результатов проводилась в операционной среде Windows 7 с использованием стандартных программных продуктов «Excel 2013» (Microsoft, Corp., США) и программы «Statistica 10.0» (StatSoft, Inc., США). В качестве руководства для статистической обработки использовались материалы «Статистического анализа медицинских данных» [27].
После проведения автоматического подсчета количества «люков» были выведены основные их показатели. Данные представлены в табл. 8
Как видно из табл.8 и рис.15 общее количество серозно-лимфатических люков исследуемых областей составило - 5 359 на площади 3 235 392 мкм2. В брюшине тазовой области выявлено - 3 444 «люка»; диафрагмальной — 1 915. Средний диаметр «люка» тазовой брюшины составил — 2,52±0,07 мкм; диафрагмальной - 23,43±0,41мкм. При этом диаметр самого крупного «люка» был выявлен в диафрагмальной области - 85,23 мкм, самого мелкого в тазовой - 0,13 мкм. Количество «люков» тазовой брюшины в 1,8 раз больше, чем в диафрагмальной. После программного подсчета количества «люков» и определения их основных показателей была сформирована база данных, включающая в себя два показателя: качественный - область брюшины; количественный - диаметр «люка». Область брюшины имела два значения: диафрагмальную и тазовую. Первая выборка включала в себя количество «люков» диафрагмальной области (щ=1915); вторая - количество «люков» тазовой области (п2= 3444).
Проверка гипотезы о нормальности распределения количественных показателей в исследуемых группах осуществлялась на основе критериев: Колмогорова-Смирнова, Шапиро-Уилкса. Эти процедуры заложены во многих пакетах статистического анализа. Ниже приведены результаты обработки данных в Statistica 10 (рис.16,17). Так как распределение количественных показателей в исследуемых группах отличалось от нормального, то для их характеристики указывались следующие параметры: медиана, среднее значение, минимум, максимум, а также перцентили. Достоверность различий между двумя независимыми выборками по количественному признаку оценивалась по критерию Манна-Уитни (рис.18).
U-критерий Манна-Уитни предназначен для оценки различий между двумя независимых выборками по уровню какого-либо признака, измеряемого количественно. Достоверность двух независимых выборок оценивалась непараметрическим критерием Манна-Уитни в программе Statistica 10.0. (р= 0,000001). С помощью него мы проверяли гипотезу о том, что две выборки не отличаются друг от друга и являются одной выборкой. Гипотеза не подтвердилась - различия между выборками статистически достоверны. Достоверность р=0,000001 что означает что эти выборки различны с вероятностью 99,999%. Следующим этапом сравнительного анализа серозно-лимфатических люков исследуемых областей было их ранжирование по диаметрам. Как видно из рис.19 основное количество «люков» (3185) имеют размеры от 0 до 5 мкм и определяются в брюшине тазовой области. При этом в брюшине диафрагмальной области количество «люков» аналогичных размеров составляет - 285. Также в тазовой брюшине встречаются относительно крупные «люки» размерами 10-35 мкм, но в меньшем количестве. В брюшине диафрагмальной области встречаются «люки» разных размеров и распределены они относительно равномерно. По сравнению с тазовой брюшиной, мелкие «люки» диафрагмальной брюшины до 5 мкм встречаются гораздо реже (285). Напротив, относительно крупные «люки» от 40 мкм и более встречаются только в брюшине диафрагмальной области.
Зная количество и среднее значение диаметров серозно-лимфатических люков диафрагмальной (23,43±0,41 мкм) и тазовой (2,52±0,07 мкм) брюшины можно рассчитать их общую площадь по следующей формуле: S= D2/4 n.
Таким образом, площадь «люков» диафрагмальной брюшины = 3,14 23,432/4 1915 = 825 245 мкм2; площадь «люков» тазовой брюшины = 3,14 2,522/4 3444 = 17 177 мкм2. Площадь диафрагмальной брюшины без «люков» = 1 663 680 – 825 245 = 838 435 мкм2. Площадь тазовой брюшины без «люков» = 1 571 712 – 17 177 = 1554 535 мкм2. Данные по площадям «люков» сравниваемых областей представлены в табл.9.
Оценка состояния серозно-лимфатических люков диафрагмальной брюшины при канцероматозе по данным растровой электронной микроскопии
В мировой практике в патогенезе перитонеального канцероматоза при раке ведущей считается имплантационная теория диссеминации опухолевых клеток по брюшине. Мы в своих научных исследованиях обратили внимание на некоторые особенности лимфогенного метастазирования рака и развитие канцероматоза с участием серозно-лимфатических люков брюшины.
На рис. 30 представлена сканограмма поверхности париетальной брюшины диафрагмальной области при канцероматозе. Данный исследуемый участок характеризуется наличием относительно крупного серозно-лимфатического люка размером 123145 мкм, в просвете и по периферии которого определяются опухолевых клетки. Данный феномен представляет собой финальный этап нарушения микроциркуляции на уровне синусоидальных лимфатических капилляров брюшины, то есть на уровне серозно-лимфатических люков. Для развития перитонеального канцероматоза принципиально важным является нарушение лимфатического оттока в брюшной полости на уровне внеорганных лимфатических сосудов, лимфатических узлов звеньев оттока лимфы. Также на поверхности брюшины определяются опухолевые клетки, не связанные с «люками», а свободно располагающиеся на ее поверхности.
Также в своих исследованиях мы обратили внимание на тот факт, что серозно-лимфатические люки при перитонеальном канцероматозе находятся в разном функциональном состоянии, что может иметь важное практическое значение при лимфообращении в брюшной полости при раке. На рис. 31 отображены данные растровой электронной микроскопии серозно лимфатических люков диафрагмальной брюшины при канцероматозе, находящиеся в различном функциональном состоянии. Просветы большинства «люков» ( ) – свободны от опухолевых клеток, имеют вид поперечных щелей, разделенные трабекулами – это функционально-активные «люки». Створки таких «люков» смыкаются полностью. Также определяются «люки» разных форм и размеров (х), субтотально и тотально блокированные опухолевыми клетками – это функционально-неактивные «люки». Их функция по всасыванию и выделению перитонеальной жидкости нарушена. Створки таких «люков» практически не смыкаются, что вызывает существенные нарушения крово-и лимфообращения в брюшной полости при перитонеальном канцероматозе.
Феномен частичной или полной обструкции «люков» опухолевыми клетками описывается впервые и имеет важное практическое значение в онкологии, в частности, при перитонеальном канцероматозе. В случае частичного блока «люка» всасывание и выделение жидкости из брюшной полости осуществляется не в полной мере, при полном блоке «люка» опухолевыми клетками процессы крово- и лимфообращения компенсируются резервными в большей степени свободными от опухолевых клеток функционально-активными «люками». Также при исследовании методом растровой электронной микроскопии нами не было обнаружено филаментов серозно-лимфатических люков при канцероматозе диафрагмальной брюшины, как это было в случае с интактной брюшиной. Увеличение масштабов поражения брюшины при канцероматозе рано или поздно приводит к полной окклюзии всех оставшихся «люков», что клинически проявляется различными видами осложнений, в частности, асцитом, интерстициальным отеком. Необходимо отметить, что скопление жидкости в интерстициальном пространстве может быть обусловлено как из-за увеличения транссудации, так и вследствие перемещения её из внутриклеточного пространства во внеклеточное внесосудистое пространство при различных видах изменений осмоляльности биологических жидкостей. Наконец, необходимо помнить, что у данной категории пациентов на процессы нарушения резорбции жидкости из брюшной полости могут также влиять гемодинамическая недостаточность сердца, венозный застой при гипертензии в системе воротной вены.
С точки зрения оценки факторов перитонеального канцероматоза необходимо учитывать, что в патологических условиях соотношение всасывания и транссудации может резко изменяться и «всасывающие» участки на какой-то период становятся «транссудирующими», и наоборот.
В соответствии с движением лимфы от органов брюшной полости в грудной лимфатический проток человека и до места его впадения в венозные сосуды для удобства изучения вопроса канцероматоза брюшины была предложена классификация лимфатического оттока в брюшной полости по уровням (рис. 32):
1 уровень (А) – локальная лимфатическая сеть органов;
2 уровень (B) – внеорганные лимфатические сосуды и лимфатические узлы звена оттока лимфы;
3 уровень (C) – «воронка», сформирования внеорганными лимфатическими сосудами брюшной полости, забрюшинного пространства;
4 уровень (D) – грудной лимфатический проток;
5 уровень (E) – лимфовенозный шлюз.
Данная классификация, исходящая из анатомических предпосылок, позволяет изучать распространение раковых клеток поэтапно на каждом из вышеназванных уровней, в зависимости от локализации опухоли. На рис.32,32 представлена схема развития и масштаб перитонеального канцероматоза в зависимости от уровня поражения лимфатического дренажа.
Так, если лимфатический блок наступает на II уровне, то канцероматоз имеет практически местный масштаб. При блоке IV и, особенно, V уровня может наблюдаться тотальный поражение. Безусловно, эта степень нарушения лимфоциркуляции, имеет системный масштаб. Вышеописанная теория развития перитонеального канцероматоза с точки зрения лимфогенной теории метастазирования, не исключающая имплантационный характер поражения брюшины при раке, позволяет несколько по иному рассматривать процесс метастазирования рака органов брюшной полости. Исследования, проведенные нами позволяют более детально понять механизмы развития перитонеального канцероматоза и разработать соответствующие методы для его предотвращения, а также лечения уже развивающегося процесса.