Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1 Понятие о меланоме кожи 9
1.1.1 Классификация и виды меланом 11
1.1.2 Прогностические группы 14
1.1.3 Метастатическая меланома 14
1.1.4 Генетические факторы риска 14
1.1.5 Молекулярные маркеры меланомы 15
1.1.6 Сигнальные пути, активированные при меланоме кожи 17
1.1.7 Регуляторы апоптоза в клетках меланомы 25
1.1.8 Таргетная терапия меланомы 26
1.1.9 Другие виды терапии меланомы кожи 28
1.2 Нуклеофозмин (NPM, В23, ньюматрин) 29
1.2.1 Строение молекулы В23 30
1.2.2 Фосфорилирование В23 32
1.2.3 Основные функции В23 34
1.2.4 Роль В23 в клетке 36
1.2.5 Мутации гена NPM в опухолевых клетках 39
1.3 Нуклеолин (С23, NCL) 40
1.3.1 Структура гена NCL и молекулы С23 41
1.4 Роль С23 и В23 в регуляции апоптоза 46
ГЛАВА 2. Материалы и методы 49
2.1. Материалы 49
2.1.1 Характеристика больных метастатической меланомой кожи 49
2.1.2 Характеристика больных меланомой слизистых оболочек 52
2.1.3 Характеристика контрольных образцов 53
2.1.4 Характеристика клеточных линий 53
2.1.5 Характеристика ксенографтов меланомы кожи человека mel6 и mel7 56
2.2 Методы 56
2.2.1 Выделение геномной ДНК 56
2.2.2 ПЦР-анализ 56
2.2.3 Анализ ПЦР-продуктов в ПААГ 59
2.2.4 Анализ экспрессии генов NCL/NPM 59
2.2.5 Окрашивание срезов 60
2.2.6 ИГХ-окрашивание 61
2.2.7 Вестерн-блотинг 62
2.2.8 Тест на выживаемость клеток (МТТ-тест) 62
2.2.9 Статистическая обработка результатов 63
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждения 64
Заключение 96
Выводы 98
Список сокращений 99
Список литературы 100
- Прогностические группы
- Сигнальные пути, активированные при меланоме кожи
- Характеристика контрольных образцов
- Анализ экспрессии генов NCL/NPM
Прогностические группы
Частота заболеваемости наследственной меланомой составляет около 10% от всех случаев. Наличие семейной отягощённости повышает риск заболевания примерно в два раза [65]. Для наследственной меланомы характерно раннее начало и не менее двух случаев заболевания среди родственников первой линии родства, а также первично-множественные меланомы у пациентов.
Генетический анализ семей, отягощенных меланомой, выявил сцепление заболевания с хромосомным локусом 9р21, а именно с геном р16/CDKN2A 15 мощным ингибитором клеточного цикла путем супрессии CDK4 [34, 138]. Ген CDKN2A состоит из четырёх экзонов и кодирует 2 различных белка р16INK4a и р14АRF, которые участвуют в регуляции клеточного цикла и апоптоза, и образуются в результате альтернативного сплайсинга [40]. Абсолютный риск меланомы среди носителей мутаций CDKN2A зависит от родословной и факторов среды.
Эпидемиологические исследования показали прямую зависимость между светлой кожей и риском развития меланомы [65]. Среди множества известных генов регулирующих начальную и факультативную пигментацию выделяют экспрессию рецептора MC1R - умеренный фактор риска меланомы [115]. Около 80% рыжеволосых индивидов – носители герминальных полиморфных вариантов гена MC1R p.D84E, p.R151C, p.R160W, p.D294H, p.R142H и p.I155T тесно связаны с фенотипом RHC, в то время как варианты p.V60L, p.V92M и p.R163Q чаще встречаются у темнокожих [131]. MC1R активирует аденилатциклазу в ответ на связывание с -MSH [66]. Далее увеличивается cAMP, связывающий транскрипционный фактор MITF, который индуцирует транскрипцию генов, синтезирующих эумеланин. Эумеланин – основной источник УФ-затухания в сильно пигментированной коже. Около 1% светлокожих пациентов с меланомой несут мутации MITF (E318K) и для них характерны патогенетические полиморфные варианты гена MC1R [169].
Среди генов-мишеней MITF, помимо генов, кодирующих пигменты, имеются гены, кодирующие ингибиторы клеточного цикла CDK (CDK1), p16Ink4a [106] и р21 [35]. Генами-мишенями, транскрипцию которых регулирует MITF, являются также CDK2 [54] и Slug, кодирующий белок-регулятор инвазии меланоцитов [76, 136], и гены тирозинкиназных рецепторов [111].
1. Уровень лактатдегидрогеназы/ЛДГ - один из надёжных прогностических факторов метастатической МК. Гипоксия в клетках МК затрудняет синтез АТФ путём окислительного фосфорилирования глюкозы, в то время как при низких концентрациях кислорода или в анаэробных условиях ЛДГ катализирует превращение пирувата в лактат. Высокий уровень ЛДГ является негативным предиктором ответа на терапию дакарбазином или комбинацией дакарбазин + облимерсен [16].
2. Низкомолекулярные белки семейства S100, которые выполняют множество значимых для клетки функций. Существует не менее 20 известных белков, каждый из которых кодируется отдельным геном. Белки семейства S100 фосфорилируют другие белки, участвуют в регуляции транскрипции, регулируют активность ферментов, уровень кальция и функции цитоскелета. Внеклеточные белки этого семейства регулируют лейкоцитарную хемоаттракцию, активацию макрофагов и модулируют клеточную пролиферацию, связанные с воспалительными процессами и канцерогенезом [135]. Несколько белков из семейства S100 регулируют р53 и апоптоз; некоторые из них действуют как опухолевые промоторы, а другие - как супрессоры опухолей. Для белков семейства S100 характерна тканевая и клеточная специфичность экспрессии. Белок S100В представлен как в нормальной ткани, так и в злокачественных опухолях. Уровень его экспрессии коррелирует с клинической стадией заболевания, включая злокачественную меланому, для которой этот маркер хорошо изучен и является диагностическим [9, 29, 78].
3. Белок с меланома-ингибирующей активностью (МИА) – белок, высоко экспрессируемый в клетках злокачественной меланомы. Кодируется одной копией гена на хромосоме 19q13.31-q13.33 и выступает в качестве аутокринного фактора роста. Его название на самом деле неправильно, и его гиперэкспрессия коррелирует с усилением инвазии, диссеминацией и метастазированием опухоли [28, 74]. Клинически высокий уровень белка МИА в опухоли связан с более поздней стадией и плохим прогнозом [31, 113, 146].
С поздними стадиями развития меланомы коррелирует также высокий уровень экспрессии VEGF, хотя этот маркёр обладает низкой чувствительностью и специфичностью. Однако в 90% случаев распространённой меланомы он является негативным предиктором процесса [124]. Существует множество других маркёров, связанных со специфичностью сигнальных путей или характеристиками меланомных клеток (табл. 3). Таблица 3 — Характеристика некоторых маркёров злокачественной меланомы Группа Маркер Меланоцитарные и меланома-специфичные маркеры Тирозиназа (TYR), TRP1 (Tyrosine Related Protein 1) и TRP2 (Tyrosine Related Protein 2) TYR2,допахром таутомераза, Gp100, MITF
Ассоциированные с меланомой антигенные маркёры Pmel17, меланоцит-специфичный MART1 и др. белки I класса MHC-ограниченных опухолевых антигенов, меланотрансферрин (р97), MUC-18 (Melanoma cell adhesion molecule), высокомолекулярные меланома-ассоциированные антигены MAGE Однако ни один из известных маркёров не является более достоверным, чем S100 или ЛДГ [12].
В основе высокопролиферативной активности опухолевых клеток лежит гиперактивация множества сигнальных путей (рис. 2). Генетические нарушения лежат в основе неконтролируемого роста опухоли, устойчивости к апоптозу, способности к инвазии и метастазированию. Для МК характерна молекулярная гетерогенность, ряд мутаций встречается наиболее часто и имеет решающее значение для выживания и прогрессирования опухоли (табл. 4).
Сигнальные пути, активированные при меланоме кожи
Срезы толщиной 4-5 мкм депарафинировали в ксилоле, затем проводили через батарею спиртов: дважды по 3 минуты в 100%- 96% этаноле и через две смены деионизированной воды (2-3 минуты).
Срезы подсушивали и окрашивали в свежеприготовленном растворе коллоидного серебра из расчёта: 1 объём 2% раствора желатина в 1% муравьиной кислоте и 2 объёма 50% водного раствора нитрата серебра. Окрашивали срезы в плотно закрытом сосуде при комнатной температуре в тёмной камере около 30-35 минут.
Затем дважды промывают препараты деионизированной водой и наносили на стёкла 5% раствор тиосульфата натрия (закрепитель), инкубировали 5 минут, смывали дважды деионизированнойводой, проводили через спирты: 96% (1-2 минуты) и 100% (1-2 минуты), подсушивали, проводили через ксилол для просветления (1-2 минуты), заключали в бальзам.
Депарафинированные срезы окрашивали на предметном стекле в следующей последовательности: 1) споласкивание в деионизованной воде 30 сек; 2) окрашивание гематоксилином Эрлиха 2-5 мин (подбирают эмпирически); 3) споласкивание в деионизированной воде 30 сек; 4) промывка под проточной водой 3-5 минут; 5) контроль окрашивания под микроскопом; 6) дифференциация окраски 1% раствором хлористоводородной кислоты в 70 спирте 1-2 сек; 7) промывка под проточной водой 5 мин; вишнёвая окраска ядер становится синей; если хроматин и ядрышко видны недостаточно чётко, то дифференциацию следует повторить 8) споласкивание в деионизованной воде 30 сек; 9) докрашивание 1% водным раствором эозина около 1 минуты; 10) споласкивание в деионизованной воде 30 сек; 11) быстрое обезвоживание препаратов в 700 – 960 - 1000 спирте, подсушивание на воздухе, осветление в ксилоле и заключение в бальзам.
Для иммуногистохимического окрашивания использовали толстые срезы с заключенного в парафин архивного опухолевого материала и в 15 случаях – дополнительно срезы нормальной ткани (биопсий кожи для сравнения пар опухоль – норма), верифицированные паталогоанатомом. Для визуализации белков С23 и В23 использовали первые моноклональные антитела, меченные биотином (antiNCL и antiNPM, Sigma Aldrich, St Louis, USA) в разведении 1:1000 и систему EnVision с пероксидазой (НПО Лабораторная Диагностика, Москва), по инструкции производителя. Для визуализации белков в культурах, клетки фиксировали в 4% параформальдегиде (мембранная фракция) или в смеси 4% параформальдегида с 0.2% Triton X-100 (фракция в цитозоле). Ядра контрастировали 4,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) с дополнительным контрастированием гематоксилином или азур-эозином. Для количественного анализа уровней экспрессии С23/В23 изображения (не менее 20 полей зрения) анализировали под микроскопом ZEISS LSM, ZEISS, Germanу) с помощью пакета программ MatLab 7.0, (WCIF-Image J softwareNIH, Bethesda, MD). Пример ИГХ-окрашивания срезов МК приведён на рисунке 18.
Белки В23/С23/р53/ -актин выделяли из суспензий клеток меланомы и фибробластов, лизированной в охлажденном буфере RIPA (50 мМТрис, рН 7,4, 4% NP40,0,25% дезоксихолат Na, 150мМ NaCl, 1мМ ЭДТА, ингибитор протеаз Complete-10 мг на 10 мл буфера) после инкубации в течение часа при 40С с последующим центрифугированием при 10 000 об/мин, 15 мин. для осаждения белка. Затем 20-30 мкг белка фракционировали в 10%-ном SDS-ПААГ и переносили на мембрану PVDF Мilipore (Billerica, BioLife, USA). Неспецифическое связывание блокировали в течение часа в буфере, содержащем 20мМ Трис-HCl, 55мМ NaCl, 0,1% Tween 20, 5% обезжиренного сухого молока. Мембраны инкубировали 8-10 час с расвором первичных антител в блокирующем буфере (разведение 1:1000). Использовали антитела к -актину (Sigma Aldrich, St.Louis,USA) и к р53, С23 (SantaCruz, Ca, USA) Отмытые мембраны инкубировали с конъюгированными с пероксидазой хрена вторичными антителами и визуализировали с помощью комплекта Pierce Biotechnology (BioLife, USA).
В основе теста – восстановление желтой соли тетразолия (МТТ) дегидрогеназами в митохондриях живых клеток до пурпурных кристаллов формазана, которые растворяют в ДМСО и затем измеряют концентрацию формазана на оптическом сканере. Интенсивность пурпурной окраски пропорциональна количеству живых клеток до обработки культуры ДМСО. Суточные культуры инкубировали 2-3 cуток с тестируемыми катионными пептидами (КП) в 96-луночных планшетах в трехкратном повторе для каждой из концентраций КП (от 0,25 до 4 мкг/мл). Контроль – клетки в лунках без добавления КП. Затем в лунки добавляли раствор МТТ, инкубировали клетки 4 часа и лизировали их ДМСО, концентрацию формазана в лунках измеряли на оптическом сканере при = 570 нм.
Для статистической обработки данных использовалась программа Statistica версия 6.1: t-тест Стьюдента (достоверность различий между частотой встречаемости ПВ в исследуемых выборках), критерий Спирмена (оценка корреляции между ПВ и экспрессией исследуемых белков). Достоверными считали изменения, для которых показатель р 0,05.
Характеристика контрольных образцов
ПМЗО представлены 2 различными неоплазиями МК+ рак молочной железы а) Пациентка И., 1951 г.р., отмечена избыточная масса тела. В 1990 г травмировала давно возникший на коже правого бедра невус, который был удален хирургически, дополнительного лечения не проводилось. В 2000 г. у этой пациентки был выявлен рак правой молочной железы. После радикальной мастэктомии проведено 4 курса ПХТ по схеме FAC, затем в течение 3 лет пациентка получала тамоксифен, без признаков прогрессирования. В 2011 г. в мягких тканях правого бедра выше старого послеоперационного рубца обнаружен метастатический узел и выполнена операция Дюкена. Однако наблюдалось продолженное метастазирование в мягких тканях правого бедра, лёгких и печени. Была назначена ПХТ по схеме CVD 1, лечение было осложнено нейтропенией 4 степени. Второй цикл лечения - с поддержкой КСФ. Наблюдалась отрицательная динамика с метастазами МК в печени и лёгких. Вследствие прогрессирования назначена химиотерапия таксолом и карбоплатином: первый цикл осложнился нейтропенией 4 степени на фоне профилактики КСФ и летальным исходом в возрасте 63 года. В метастазе МК обнаружена мутация BRAF V600E. б) комбинация рак молочной железы + МК
Пациентка К., 1953 г.р. В 2000 г. диагностированы рак левой молочной железы и синхронная МК левой голени. В 2001 г., после радикальной мастэктомии и резекции МК без последующей терапии, обнаружены метастазы рака молочной железы в костях скелета, назначена лучевая терапия и тамоксифен. С 2002 г. пациентка принимала препараты фемара и золадекс, по мере прогрессирования – ингибиторы ароматазы, аредиа, с 2006 г. принимала зомету. В 2010 г. обнаружен остеомиелит верхней челюсти, зомету, а затем аримедекс отменили. Дальнейшего лечения по поводу рака молочной железы пациентка не получала. В 2014 г. выявлены метастазы МК в мягких тканях левой голени и брюшной стенке, которые удалены хирургически. В 2015 г. отмечен рецидив МК в послеоперационном рубце на левой голени.
ПМЗО представлены 2 различными неоплазиями: МК+ рак почки Пациентка В., 1977 г. р. с врожденным пигментным невусом на коже спины, который неоднократно травмировала. В 2009 г. невус удалили лазером как папиллому, гистологического исследования не проводилось. В 2013 г. отмечено уплотнение в правой лопаточной области, в 2014 г. новообразование удалено хирургически с подозрением на липому. Гистологически верифицирована МК, которую удалили в 2014 г. Вскоре были выявлены метастазы МК в подмышечных лимфоузлах справа и в мягких тканях спины, а также объёмное образование в правой почке. Проведена резекция почки, иссечение метастатических узловых образований в мягких тканях спины и лимфаденэктомия. В метастазах МК выявлена мутация BRAF V600E. У пациентки избыточная масса тела.
ПМЗО представлены 3 различными неоплазиями: фибросаркома яичника + МК+ рак молочной железы. Пациентка М., 1950 г.р. в 2008 году перенесла экстрипацию матки с придатками и удаление большого сальника по поводу фибросаркомы левого яичника. При плановом осмотре в 2015 г. у нее обнаружен опухолевый узел в левой подмышечной области, при осмотре кожных покровов на спине выявлено новообразование, гистологически верифицирована МК. В хирургически удаленных узлах обнаружены метастазы МК спины и метастазы рака молочной железы. Проведено 2 курса адъювантной ПХТ по схеме: адриабластин+ эндоксан. У пациентки отмечены избыточный вес и менопауза с 42 лет.
В изученной выборке ПМЗО у женщин преобладали различные комбинации МК с раком молочной железы. У 3 из 7 больных МК развивалась раньше других неоплазий в составе ПМЗО и быстро прогрессировала с образованием отдаленных метастазов. Метастазирование МК обычно наблюдалось вскоре после хирургического удаления первичной опухоли. У 2 из 7 пациенток в МК обнаружена мутация BRAF V600E; у 1 из 7 – две мутации: в гене EGFR (рак легкого) и в гене NRAS (метастаз МК). У 1 из 7 пациенток в семье имелся случай онкологического заболевания. 4 из 7 пациенток имели избыточный вес.
Случай крайне редкой множественной МК, возникшей у пациента в возрасте 23 лет, вероятно, обусловлен генетически и требует дальнейшего изучения.
Независимо от пола, у больных ПМЗО метастазирование МК наблюдалось достаточно быстро после хирургического удаления первичного очага. Выживаемость больных ПМЗО в случаях, когда МК была последней опухолью, оказалась выше, чем при манифестации МК как первое из выявленных новообразований.
Среди различных факторов риска МК существенную роль играют первично-множественные злокачественные опухоли (ПМЗО) в анамнезе пациентов. Частота ПМЗО в России составляет по клиническим данным от 2 до 20%, при этом наблюдается неуклонный рост заболеваемости. В России частота ПМЗО составила в 2000 г. 5,7% от числа всех первичных новообразований, в 2012 г. – 13-15%, в среднем – 20,8 случаев ПМЗО на 100 тыс. населения [1]. Тенденция к повышению частоты ПМЗО – двух и более новообразований, независимо возникающих у пациентов в течение жизни, обусловлена как с ростом продолжительности жизни онкологических больных, с использованием потенциально канцерогенных методов лечения, так и с возросшим воздействием неблагоприятных факторов среды.
Кроме экзогенных факторов риска ПМЗО важно учитывать мутационный статус генов и генные полиморфизмы, влияющие на эффективность противоопухолевого иммунитета, баланс между клеточной пролиферацией и дифференцировкой. Анализ экспрессии генов NPM/NCL в клетках меланомы кожи и в нормальной ткани
Наши предварительные исследования экспрессии С23/В23 в опухолях, на мышиных ксенографтах и в культуре клеток (рак толстой кишки, рак молочной железы, рак, рак легкого) выявили повышенный уровень экспрессии в опухоли по сравнению с нормой [3]. Большой интерес представляет изучение особенностей экспрессии С23/В23 в метастатической меланоме.
Анализ изображений иммуногистохимически окрашенных попарных срезов опухолевой и нормальной ткани у 15 пациентов с метастатической МК выявил следующие закономерности. Во-первых, уровень экспрессии С23 во всех случаях выше, чем уровня В23 (статистическая тенденция). Причем относительно высокий уровень экспрессии С23/В23 был выявлен в опухолях у пациентов с отдаленными метастазами в головной мозг. Полученные результаты указывают на плохой прогноз МК при гиперэкспрессии С23/В23 (табл. 16).
Анализ экспрессии генов NCL/NPM
У первой пациентки через 6 мес. после иссечения первичной меланомы и 2 мес. таргетной терапии гливеком, после стабилизации процесса, была отмечена отрицательная динамика, множественные метастазы в забрюшинном пространство, легких и печени, через 3 мес. констатирована смерть. У второй пациентки с соматическим отягощением, без хирургического вмешательства, стабилизация процесса в результате терапии гливеком продолжалась 6 месяцев. Затем было отмечено увеличение размеров метастатически измененных паховых лимфоузлов. Генетический анализ биопсийного материала, взятого из пахового узла, выявил отсутствие мутации гена KIT. Однако в ДНК, выделенной из этого метастатического узла, мы обнаружили мутацию в экзоне 2 гена NRAS, приводящая к замене глицина на цистеин в кодоне 12 - G12Cys. Считается, что данная мутация резистентна к гливеку, однако в литературе отмечена чувствительность опухолей, несущих эту мутацию, к иммунотерапии интерлейкином и ипилимумабом. Эта пациентка прожила после начала таргетной терапии около года.
Полученные результаты свидетельствуют о молекулярно-генетической неоднородности меланомы слизистых оболочек гениталий, позволяющей опухоли за счет пролиферации клеток, несущих другие драйверные мутации или другие генетические изменения, избежать воздействия таргетных препаратов. Возможно, более агрессивный рост опухоли у первой пациентки (несмотря на более молодой возраст) связаны также с носительством сразу трех ПВ и делеции в экзоне 4 гена NCL- ПВ2+ПВ3+ПВ4+del, что вносит вклад в ускорение пролиферации с последующей геномной нестабильностью. Напомним, что в опухолях с комбинацией ПВ2+ПВ3+del наблюдалась гиперэкспрессия С23 (табл. 17). У второй пациентки, несмотря на ПМЗО, обнаружена лишь комбинация ПВ1+ПВ4 в гене NPM, в этом случае уровень экспрессии был сравнительно ниже, что отражается на скорости метастазирования [4].
Как отмечалось, для меланомы слизистых характерны мутации в нескольких экзонах гена c-KIT, а также мутации генов BRAF и NRAS. Результаты исследований показывают, что частота мутаций гена KIT в первичной меланоме слизистых оболочек существенно зависит от локализации опухоли: она значительно выше в меланоме вульвы, чем в других типах меланом слизистых оболочек (35% против 10%). В исследованной выборке было 16 пациенток с меланомой слизистых в области наружних половых органов и 2 – с меланомой слизистой носа и меланомой без ВПО с метастазом в слизистую тонкого кишечника.
Напомним, что протоонкоген KIT (c-kit) кодирует трансмембранный тирозинкиназный рецептор KIT фактора роста стволовых клеток KIT/SCF-R, который играет важную роль в регуляции дифференцировки меланобластов в меланоциты и в миграции этих клеток. Этот рецептор активирует несколько важнейших сигнальных путей, включая RAS-MAPK и PI3K-AKT (рис. 29). При связывании молекул SCF (лиганда) с рецептором происходит димеризация, фосфорилирование и активация тирозинкиназы KIT. Фосфорилированные остатки тирозина (Y568-Y936) высокоспецифично взаимодействуют с другими сигнальными молекулами, активируя соответствующие пути и регулируя ключевые клеточные функции Большинство активирующих мутаций локализовано в 11 экзоне гена KIT, который кодирует подмембранный домен рецептора, и представлено однонуклеотидными заменами. Как правило, мутантный генотип в первичной опухоли и метастазах меланомы слизистых оболочек совпадают.
Исследование молекулярных механизмов развития меланомы способствовало разработке целого ряда таргетных препаратов, которые стали широко использоваться в качестве альтернативной терапии меланом слизистых оболочек с драйверными мутациями, включая мутации в гене KIT. Поэтому генетическое тестирование меланом слизистых оболочек является важным этапом лечения, улучшающим выживаемость и качество жизни больных.
Из-за отсутствия эффективных методов лечения метастатической МК, поиск молекулярно-генетических маркеров и их характеристик особенно актуален.
В последнее время рассматриваются несколько подходов для регуляции МАРК-сигнального каскада, изменения в котором приводят к развитию меланомы. Во-первых, поиск регуляторных белков-маркеров прогрессии МК, во-вторых, создание фармакологических агентов для таргетной терапии сигнальных молекул, в-третьих, анализ лекарственной устойчивости и механизмов индукции МК, наконец изучение механизмов резистентности МК к лекарственной терапии [57]. Анализ генетических изменений при метастатической МК создает основу для развития всех этих направлений клинической онкологии. Комплекс генетических изменений включает гены NCL, NPM, BRAF, NRAS, KIT, PDGRF и другие локусы и создает генетическую нестабильность и молекулярную неоднородность опухоли, провоцирующие агрессивное течение заболевания и трудности терапии МК [103, 145, 129]. Характеристика таких изменений в ключевых генах NPM/NCL, кодирующих многофункциональные регуляторные белки, с использованием как клинического материала, так и модельных систем, позволила бы уточнить механизмы канцерогенеза МК и разработать способы ингибирования опухолевого роста, что необходимо для успешной диагностики и лечения меланомы. В некоторых образцах МК были обнаружены также мутации в гене PDGFR. Примечательно, что мутации и полиморфизмы гена PDGFR выявлены только у пациентов с эпителиоидноклеточной саркомоподобной непигментированной МК.