Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы
1.1 Инвазивный рост и метастазирование в проявлении злокачественности карцином 15
1.2 Физиологические прототипы инвазивного клеточного роста 16
1.3 Центральные молекулы, определяющие механизмы инвазивного клеточного роста 20
1.4 Виды инвазивного роста 26
1.4.1 Амебоидный механизм инвазивного клеточного роста 27
1.4.2 Мезенхимальный механизм инвазивного клеточного роста 30
1.4.3 Коллективная клеточная инвазия 32
1.4.4 Амебоидно-мезенхимальный и мезенхимально-амебоидный переходы 35
1.4.5 Коллективно-индивидуальные переходы 37
1.5 Внутриопухолевая гетерогенность при раке молочной железы 41
1.6 Связь инвазивного роста с прогрессированием заболевания при раке молочной железы 43
Заключение 50
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования
2.1 Материалы исследования 52
2.2 Методы исследования 54
ГЛАВА 3. Собственные исследования
3.1 Характеристика морфологического строения инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы 81
3.2 Особенности экспрессии маркеров, характеризующих инвазивные свойства опухоли при раке молочной железы, в зависимости от морфологических параметров опухоли 92
3.3 Особенности экспрессии маркеров, характеризующих инвазивные свойства опухоли при раке молочной железы, в зависимости от клинических параметров пациенток 129
3.4 Характеристика лимфогенного метастазирования в зависимости от особенностей морфологического строения опухоли при инвазивной карциноме неспецифического типа молочной железы 143
3.5 Исследование лимфогенного метастазирования в зависимости от особенностей экспрессии маркеров, характеризующих инвазивные свойства опухоли при раке молочной железы 150
Обсуждение 163
Выводы 186
Практические рекомендации 189
Список сокращений и условных обозначений 191
Список литературы
- Виды инвазивного роста
- Внутриопухолевая гетерогенность при раке молочной железы
- Особенности экспрессии маркеров, характеризующих инвазивные свойства опухоли при раке молочной железы, в зависимости от морфологических параметров опухоли
- Исследование лимфогенного метастазирования в зависимости от особенностей экспрессии маркеров, характеризующих инвазивные свойства опухоли при раке молочной железы
Виды инвазивного роста
Физиологические прототипы инвазивного клеточного роста Известно, что клетки злокачественных опухолей, распространяясь в окружающие ткани и отдаленные органы, воспроизводят механизмы и типы миграции, свойственные для здоровых, неопухолевых клеток в условиях протекания физиологических процессов. Клетки опухоли способны активировать эти механизмы для изменения своей формы, создания условий для перемещения, а также для ремоделирования окружающих тканей с целью формирования путей для осуществления миграции. Главная проблема заключается в том, что опухолевые клетки, в отличие от здоровых, не имеют физиологических «стоп-сигналов» для остановки этих процессов. Вероятнее всего, это и приводит к закреплению механизмов миграции и способствует прогрессированию и распространению опухоли [61, 78, 80].
Установлено, что злокачественно измененные клетки для реализации процессов, определяющих инвазивный рост опухоли и возможность метастазирования, используют генетически заложенные в организме программы. Так, передвижение одиночно мигрирующих клеток наблюдается в ходе эмбрионального развития, при протекании реакций в рамках иммунологического контроля в организме, например, при миграции лейкоцитов. Такой же механизм распространения характерен для опухолевых клеток при прогрессировании опухоли и развитии метастазов [80].
Наряду с одиночной миграцией, возможно развитие коллективной клеточной миграции в виде прочно соединенных между собой групп опухолевых клеток [79, 113]. Такой вариант движения является признаком тканевой перестройки и лежит в основе процессов, протекающих во время эмбрионального морфогенеза, а также является неотъемлемым компонентом при заживлении раневых поверхностей. Важным моментом в этом вопросе является то, что в процессах инвазивного роста и метастазирования механизмы как коллективной, так и одиночной клеточной миграции активно используются опухолевыми клетками в качестве физиологических прототипов [33, 81, 239].
Коллективная миграция, как характерный признак эмбрионального морфогенеза, детально изучается с помощью генетических методов исследования в рамках экспериментальных работ [80, 81, 165]. Основной моделью для исследования данных процессов служит D. melanogaster. Так выявлено, что в процессе овогенеза у D. melanogaster пограничные клетки формируют плотно упакованные кластеры, состоящие из 6 – 10 фолликулярных клеток, окружающих две наименее подвижные полярные клетки, и таким образом мигрируют вдоль вспомогательных клеток в яйцевую камеру [81, 165]. Пограничные клетки образуют на переднем крае одной или двух клеток Rac-зависимые, богатые актином выступы, а также генерируют тракционные силы для осуществления движения путем прямых Е-кадхерин опосредованных межклеточных взаимодействий со вспомогательными окружающими клетками. В результате этого под влиянием миозина II происходит скоординированное перемещение вперед заднего края. Во время такого движения пограничные клетки мигрируют к ооциту под сочетанным воздействием двух классов лигандов – EGF (эпидермальный фактор роста), PVF1 (тромбоцитарный фактор и фактор роста эндотелия сосудов VEGF, связанный с фактором 1) и PVF2, которые вырабатываются яйцеклеткой, способствуя возникновению градиента диффузии. Экспериментальные данные показали, что изначально одна из клеток такого кластера становится лидером в процессе передачи сигналов через рецепторы EGF. Позднее полярность кластера устанавливается коллективно посредством различий в абсолютных уровнях сигнализации между клетками. Таким образом, клетки с постоянным высоким уровнем сигнальной активности EGF-рецепторов имеют конкурентное преимущество и становятся лидирующими в процессе миграции [81, 165].
Другим примером коллективной клеточной миграции служит образование разветвлений трахеи во время морфогенеза. Этот процесс начинается с образования инвагинации эллипсоидного эктодермального плакода, который происходит под влиянием FGF лигандов. Клетки плакода, ближе всего расположенные к данным лигандам, впоследствии приобретают роль «наконечника» или роль «клеток-лидеров» в коллективно движущейся клеточной группе, начинается процесс образования динамических выступов цитоскелета – псевдоподий и филоподий. Далее происходит миграция по направлению к источнику высокой сигнализации FGF. Таким образом, клетки лидирующего края формируют первичные ветви трахеальной сети, и процесс повторяется в последующих этапах ветвления. [81, 165].
В период полового созревания молочная железа развивается в результате образования морфогенетических разветвлений терминальных конечных почек. Этот процесс также является проявлением коллективной миграции клеток. В ходе развития каждая почка отходит от первичных протоков посредством синхронной коллективной миграции двух различных типов клеток: люминальных эпителиальных клеток, которые формируют верхушку почки, и миоэпителиальных, стабилизирующих стволовую часть почек. Последние клетки имеют наименее прочные связи друг с другом, в то время как соединения между люминальными более прочны. Данный факт объясняет возникновение базально-апикальной полярности в процессе прорастания [79]. Развитие и распространение терминальных конечных почек отличается от других типов морфогенетических ветвлений трубчатых органов тем, что у них отсутствуют четкие клетки-лидеры на верхушке (или на ведущем крае), имеющей тупой П-образный выступ, в котором клетки постоянно меняют свое расположение. Ветвления при развитии молочной железы также зависят от экспрессии FGF рецепторов [81].
Внутриопухолевая гетерогенность при раке молочной железы
Представительство альвеолярных структур в инфильтративном компоненте определялось по 3-х балльной системе, где 1 баллом (мало) обозначали случаи, в которых альвеолярные структуры составляли менее чем 30% от всех видов структур, 2 баллами (умеренно) – 30-70%, 3 баллами (много) – более чем 70% от всех видов структур.
Кроме того, в альвеолярных структурах по 3-х балльной системе определялась выраженность полиморфизма опухолевых клеток. 1 баллом (слабо выраженный полиморфизм) обозначали случаи, в которых клетки были округлыми, средних размеров, имели округлые нормохромные ядра и умеренно выраженную цитоплазму, митозов не было. 2 баллам (умеренно выраженный полиморфизм) соответствовали случаи, в которых клетки были округлыми, средних размеров, имели округлые гиперхромные ядра, и умеренно выраженную цитоплазму, встречались митозы. 3 баллами (резко выраженный полиморфизм) обозначались случаи, в которых клетки были неправильной формы, крупных размеров, имели крупные гиперхромные ядра неправильной формы, выраженную цитоплазму, выявлялись неправильные митозы.
Трабекулярными называли структуры, представляющие собой либо один ряд мелких достаточно мономорфных клеток, либо структуры, состоящие из 2–3 рядов клеток средних размеров с умеренно выраженной цитоплазмой, с округлыми нормохромными или гиперхромными ядрами (рисунок 4). Рисунок 4 - Трабекулярные структуры в инфильтративном компоненте инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х400. Тубулярными считали однорядные структуры с просветом, образованые достаточно мономорфными клетками с нормохромными округлыми ядрами (рисунок 5). Рисунок 5 - Тубулярные структуры в инфильтративном компоненте инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х400. Солидными считали структуры, представляющие собой различные по размеру и форме поля, состоящие или из мелких клеток с умеренно выраженной цитоплазмой и мономорфными ядрами или из крупных клеток с обильной цитоплазмой и полиморфными ядрами (рисунок 6).
Группами клеток называли скопления от 1 до 4 клеток различных по своему строению (рисунок 7). В большинстве случаев инфильтративный компонент опухоли имел смешанное строение, при котором широко варьировало сочетание разных типов перечисленных структур (рисунок 8). Рисунок 8 - Инфильтративный компонент инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы смешанного строения. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х400. В каждом случае подсчитывалось количество разных типов структур в инфильтративном компоненте, которое варьировало от одного до пяти соответственно. В каждом из пяти перечисленных выше типов структур инфильтративного компонента определялось наличие такого морфологического признака как краудинг. Краудингом обозначается феномен увеличения количества клеток в единице объема вследствие преобладания процессов пролиферации над процессами апоптоза клеток. Морфологически феномен краудинга в различных структурах инфильтративного компонента опухоли в гистологическом срезе определялся в виде двух вариантов - краудинг по типу изолированного «скучивания» и краудинг по типу сочетания «скучивания» и «наслоения» опухолевых клеток. Под «скучиванием» понимали более «близкое» расположение клеток и соответственно их ядер друг к другу в структуре по сравнению с характером расположения клеток в остальных участках той же структуры опухоли. При краудинге по типу сочетания «скучивания» и «наслоения» клеток понимали более «близкое» расположение клеток в структуре в сочетании с наслоением ядер этих клеток друг на друга (рисунок 9 - 12). Кроме того, также в разных структурах оценивалась выраженность краудинга полуколичественным методом по 3-х балльной системе. При этом 1 баллом (слабо выраженный краудинг) обозначали случаи, в которых краудинг присутствовал менее чем в 30% определенного типа структур, 2 баллами (умеренно выраженный краудинг) – от 30 до 70% определенного типа структур, 3 баллами (резко выраженный краудинг) – более чем в 70% определенного типа структур.
Краудинг в тубулярной структуре инфильтративного компонента инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х400. Рисунок 10 – Солидная структура инфильтративного компонента инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы без краудинга. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х400. Рисунок 11 – Краудинг в структурах инфильтративного компонента инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы по типу изолированного «скучивания» клеток. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х400. Рисунок 12 – Краудинг в структурах инфильтративного компонента инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы по типу сочетания «скучивания» и «наслоения» опухолевых клеток. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х400.
Вокруг каждого из изучаемых типов структур инфильтративного компонента определялось наличие ретракции. Ретракцией считали артефициальную «щель» между клетками структур паренхиматозного компонента и окружающей стромой. Выраженность ретракции оценивали по 3-х балльной системе полуколичественным методом. При этом 1 баллом (слабо выраженная ретракция) обозначали случаи, в которых ретракция определялась вокруг менее чем 30% определенного типа структур, 2 баллами (умеренно выраженная ретракция) – от 30 до 70% определенного типа структур, 3 баллами (резко выраженная ретракция) – вокруг более чем 70% определенного типа структур инфильтративного компонента (рисунок 13). Рисунок 13 – Ретракция вокруг структур инфильтративного компонента инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х400. В строме опухоли оценивались наличие и выраженность гиалиноза и воспалительной инфильтрации по 3-х балльной системе (1 балл – слабо, 2 балла – умеренно, 3 балла – резко выражен) (рисунок 14, 15).
Особенности экспрессии маркеров, характеризующих инвазивные свойства опухоли при раке молочной железы, в зависимости от морфологических параметров опухоли
Ряд маркеров, имеющих отношение к инвазивному клеточному росту, демонстрировали выраженный гетерогенный характер экспрессии во всех исследованных случаях. Это относится к таким маркерам как Twist, Rac1, интегринам 1 и 3, MMP9. Гетерогенная экспрессия виментина отмечалась в многоклеточных структурах опухоли более чем в 80% случаев. Гетерогенность экспрессии остальных исследуемых маркеров колебалась от 30 до 50% случаев. Наименьший процент случаев с гетерогенной экспрессией наблюдался при оценке экспрессии RhoA.
При сравнении частоты встречаемости гетерогенного характера экспрессии изучаемых маркеров в разных структурах опухоли обнаружено, что солидные структуры отличаются от остальных. В них чаще всего наблюдалась гетерогенная экспрессия Snail, катенина и CK14 (таблица 44).
В ходе данного исследования проводилось изучение особенностей экспрессии маркеров, связанных с коллективной инвазией, в многоклеточных структурах опухоли, а именно в альвеолярных, тубулярных, трабекулярных и солидных структурах. Гетерогенность экспрессии маркеров позволяла говорить о наличии фронта инвазии в данных структурах. Судить об этом можно было по наличию более выраженной экспрессии или, наоборот, по ее отсутствию в клетках инвазивного фронта. Не обнаружены изменения экспрессии Snail, Twist, Rac1, CK14, которые можно было бы интерпретировать как наличие фронта инвазии в исследуемых структурах опухоли. Исключение составляли солидные структуры, в которых этот признак наблюдался в 4% случаев по экспрессии Snail и в 3% случаев по экспрессии CK14. В противоположность этому, усиление экспрессии в одном из сегментов структур таких маркеров как RhoA, интегрина 1 и FGFR1 наблюдалось в большинстве случаев во всех многоклеточных структурах (более 90%) (таблица 45).
Наличие усиления экспрессии маркеров (фронта инвазии), в разных структурах инфильтративного компонента инвазивной карциномы неспецифического типа молочной железы
Интересным представлялась оценка особенностей экспрессии маркеров инвазивного роста опухоли в зависимости от наличия экспрессии Snail в дискретных группах опухолевых клеток. Известно, что отдельные группы опухолевых клеток практически полностью лишены межклеточных соединений, а это означает, что проявления ЭМП в данном типе структур инфильтративного компонента опухоли, вероятно, должны быть выражены в наибольшей степени. В результате исследования было выявлено, что в новообразованиях с наличием в группах опухолевых клеток экспрессии Snail чаще обнаруживались дискретные группы опухолевых клеток с позитивной экспрессией CK14 по сравнению с новообразованиями, в которых экспрессия Snail в группах клеток отсутствовала (43% и 13% соответственно; р=0,02) (таблица 49).
В новообразованиях с наличием позитивной экспрессии Snail в дискретных группах опухолевых клеток определялся более высокий процент экспрессии Rac1 и интегрина 3 в данном типе структур, при этом отмечался более низкий процент экспрессии MMP9 и виментина (таблица 50). Таблица 50 - Процент экспрессии маркеров, характеризующих инвазивные свойства опухоли, в дискретных группах клеток в зависимости от наличия экспрессии Snail в группах опухолевых клеток
Локализация экспрессии Процент экспрессии, M±S.D. Отсутствие экспрессииSnail в группахопухолевых клеток Наличие экспрессииSnail в группахопухолевых клеток
Сопоставление особенностей экспрессии изучаемых маркеров со степенью злокачественности новообразования позволило выявить следующую картину. Позитивная экспрессия интегрина 1 реже выявлялась при второй степени злокачественности, чем при первой. В отношении экспрессии интегрина 3 наблюдалась диаметрально противоположная ситуация. Позитивная экспрессия интегрина 3 чаще определялась в опухолях со второй степенью злокачественности и значимо реже - с первой.
Позитивная экспрессия СК14 была более характерной для первой степени злокачественности. Позитивная экспрессия виментина в опухолевых клетках реже наблюдалась при первой степени злокачественности по сравнению со случаями с третьей степенью злокачественности опухоли (таблица 51).
Исследование лимфогенного метастазирования в зависимости от особенностей экспрессии маркеров, характеризующих инвазивные свойства опухоли при раке молочной железы
Метастатическое поражение регионарных лимфатических узлов чаще выявлялось при негативной экспрессии Snail в солидных структурах инфильтративного компонента по сравнению с наличием в указанных структурах позитивной экспрессии данного маркера (80% и 32%; 2=4,5; р=0,03) (таблица 90). Наличие лимфогенных метастазов не было связано с интенсивностью, характером распределения, процентом, а также с изменением экспрессии Snail по фронту разных типов структур инфильтративного компонента инвазивной карциномы неспецифического типа.
Интенсивность, гетерогенность и процент клеток в опухоли с позитивной экспрессией Twist не были связаны с частотой лимфогенного метастазирования. Однако, при наличии усиления экспрессии Twist по фронту солидных структур, лимфогенные метастазы выявлялись значимо чаще нежели в тех случаях, когда феномен изменения экспрессии в периферических участках указанных структур не наблюдался (100% и 29% соответственно; 2=4,1; р=0,04).
Исследование особенностей экспрессии маркеров Rac1 и RhoA, ассоциированных с инвазивным ростом при РМЖ, и их связи с параметрами лимфогенной диссеминации показало, что наличие, гетерогенность, процент и изменение их экспрессии по фронту разных типов структур в опухоли не были связаны с частотой метастатического поражения регионарных лимфоузлов.
Интересные данные были получены при сопоставлении экспрессионных характеристик интегринов семейства 1 и 3 в опухоли с параметрами лимфогенного метастазирования.
Метастазы в лимфатических узлах встречались реже при позитивной экспрессии интегрина 1 в альвеолярных (20%) и солидных (22%) структурах инфильтративного компонента по сравнению с негативной экспрессией данного маркера как в альвеолярных (48%; 2=3,5; р=0,05), так в и солидных (48%; 2=4,8; р=0,02) структурах (таблица 92).
Отмечено, что частота лимфогенного метастазирования не была связана с интенсивностью, гетерогенностью, процентом и изменением экспрессии интегрина 1 по фронту разных типов структур в паренхиме опухоли при РМЖ.
Касаемо экспрессии интегрина 3 было обнаружено, что лимфогенные метастазы наблюдались чаще при наличии позитивной экспрессии в дискретных группах опухолевых клеток в сравнении со случаями, когда экспрессия данного маркера в исследуемых структурах инфильтративного компонента была негативной (47% и 23% соответственно; 2=5,1; р=0,02) (таблица 93).
Кроме того, при наличии лимфогенных метастазов определялся больший процент экспрессии интегрина 3 в альвеолярных, трабекулярных, солидных структурах и дискретных группах опухолевых клеток. В тубулярных структурах процент экспрессии интегрина 3 был минимальным (таблица 95).
Процент экспрессии интегрина 3 в разных типах структур инфильтративного компонента опухоли в зависимости от наличия метастатического поражения лимфатических узлов
Наличие экспрессии катенина в группах опухолевых клеток в сравнении с ее отсутствием было сопряжено с большей частотой выявления лимфогенных метастазов (40% и 16% соответственно; 2=3,7; р=0,05) (таблица 96).
Наличие лимфогенных метастазов в зависимости от наличия экспрессии катенина в разных типах структур инфильтративного компонента опухоли при раке молочной железы
Интенсивность, гетерогенность, процент экспрессии, а также изменение экспрессии катенина по фронту разных типов структур не были связаны с частотой лимфогенного метастазирования.
В результате проведенного исследования были получены данные, свидетельствующие о наличии взаимосвязей между экспрессионными показателями матриксных металлопротеиназ в разных типах структур паренхиматозного компонента и определенными параметрами лимфогенной диссеминации.
При наличии позитивной экспрессии MMP2 в альвеолярных структурах инфильтративного компонента лимфогенные метастазы выявлялись чаще (42%), чем при её отсутствии (0%; 2=4,5; р=0,03) (таблица 97).
Лимфогенные метастазы также определялись чаще при выявлении интенсивной экспрессии MMP2 в трабекулярных, солидных структурах и в группах опухолевых клеток в сравнении со случаями, когда отмечалась слабо выраженная экспрессия указанного маркера в перечисленных структурах опухоли (таблица 98).