Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Введение 12
1.2. Лабораторные методы диагностики отдаленных метастазов РПЖ 15
1.3. Роль микроРНК в диагностике отдаленных метастазов РПЖ 20
1.4. Роль микроРНК в качестве молекулярно-генетических маркеров 24
1.4.1. Внеклеточные и внутриклеточные микроРНК 24
1.4.2. Локализация аппарата, осуществляющего РНК-сайленсинг в
клетке 30
1.4.3. Все ли микроРНК входят в RISC? 38
1.4.4. Внеклеточные микроРНК и механизмы их секреции 42
1.4.5. Межклеточные взаимодействия посредством микроРНК 45
1.5. Заключение 52
ГЛАВА 2. Материалы и методы 55
2.1. Методики получения плазмы и выделения и анализа циркулирующих РНК плазмы крови 55
2.1.1. Получение плазмы 55
2.1.2 Выделение тотальной РНК из плазмы крови 55
2.1.3 Анализ профиля представленности микроРНК с помощью микрочипов Affymetrix GeneChip miRNA 4.0 57
2.2. Анализ профилей представленности микроРНК в плазме крови 58
2.2.1. Изучение профиля микроРНК пациентов без злокачественных новообразований 58
2.2.2. Изучение профиля микроРНК пациентов с локализованной и метастатической формами РПЖ 60
2.3. Анализ вклада изучаемых микроРНК в развитие процесса метастазирования рака предстательной железы 62
2.3.1. Создание клеточной линии DU-145 со стабильным нокдауном гена CD46 62
2.3.2. Характеристика клеточной линии DU-145 c инактивированным геном CD46 67
2.3.3. Создание ксенографтной модели РПЖ человека в мыши с
использованием линии DU-145 c инактивированным геном CD46 68
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 75
3.1. Характеристика коллекции плазмы крови 75
3.2. Анализ экспрессии отдельных микроРНК при сравнении метастатической и локализованной формы РПЖ 76
3.3. Пары микроРНК, позволяющие дифференцировать локализованной и метастатической форм РПЖ 85
3.4. Определение генов-мишеней 91
3.5. Экспериментальное исследование роли выявленных микроРНК в патогенезе рака предстательной железы на ксенографтных моделях 92
3.6. Влияние снижения экспрессии CD46 в линии DU-145 на характеристику клеточной линии, а также метастатический потенциал ксенографтов 95
Заключение 104
Выводы 109
Практические рекомендации 110
Список сокращений и условных обозначений 111
Список литературы
- Лабораторные методы диагностики отдаленных метастазов РПЖ
- Анализ профиля представленности микроРНК с помощью микрочипов Affymetrix GeneChip miRNA 4.0
- Анализ экспрессии отдельных микроРНК при сравнении метастатической и локализованной формы РПЖ
- Экспериментальное исследование роли выявленных микроРНК в патогенезе рака предстательной железы на ксенографтных моделях
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Рак предстательной железы (РПЖ) является вторым по частоте возникновения и пятым по показателю смертности злокачественным новообразованием у мужчин в мире [Siegel, Miller, Jemal, 2015], а в Российской Федерации смертность от РПЖ стоит на третьем месте среди всех злокачественных опухолей мужчин [Каприн А. Д. и др., 2015].
В большинстве случаев на доклинической стадии РПЖ является медленно прогрессирующим заболеванием, однако и в этих случаях встречаются наблюдения агрессивного развития РПЖ, сопровождающегося ранним формированием отдаленных метастазов. В настоящий момент остается не вполне ясным, какими конкретно молекулярно-генетическими механизмами можно объяснить данные особенности опухоли. Как следствие, клинической практике недостает надежных методов оценки степени злокачественности РПЖ и вероятности его метастазирования, а также диагностических лабораторных ресурсов для выявления групп риска наличия метастазов. Адекватное стадирование РПЖ, необходимое для назначения правильного лечения, является важным клиническим вопросом.
Перспективным направлением в диагностике метастатических форм
РПЖ является качественная и количественная оценка циркулирующих
молекул микроРНК [Schaefer et al., 2010b]. МикроРНК — это малые
некодирующие РНК длиной 17-25 нуклеотидов, играющие важную роль в
посттрансляционной регуляции экспрессии генов. Данные молекулы
стабильны в биологических жидкостях и детектируются даже в малом
количестве. Среди пациентов с впервые идентифицированным
метастатическим РПЖ около двух третей больных имели метастатическую
болезнь высокого объема, то есть наличие висцеральных метастазов и/или не
менее четырех метастазов в кости, при этом объем метастатических опухолей
больше, чем у первичного очага [Sweeney et al., 2015]. Это означает, что
масса опухолевой ткани при развитии метастазов на порядок выше, чем при
локализованной форме, что способствует возрастанию уровня опухоль-
специфичных микроРНК в плазме крови. При РПЖ активно изучается роль
микроРНК в качестве биомаркеров для диагностики, стадирования и оценки
прогноза течения заболевания [Fabris et al., 2016]. В 2008 г. было
опубликовано исследование, в котором достоверно отличались уровни
циркулирующих микроРНК у пациентов с метастатической формой РПЖ по
сравнению со здоровыми людьми [Mitchell et al., 2008]. С тех пор интерес к
циркулирующим микроРНК при РПЖ неуклонно растет. Есть несколько
публикаций, в которых miR-141 предлагается в качестве маркера
распространенного и метастатического рака [Selth et al., 2012], однако в
других публикациях miR-141 представляется маркером ранней диагностики
РПЖ [Hao et al., 2015]. МикроРНК miR-21 дифференциально
экспрессирована при локализованных и метастатических формах, однако
данный маркер дифференциальной диагностики уступает классическому ПСА [Watahiki et al., 2013]. В двух работах miR-375 предлагается использовать для дифференциальной диагностики РПЖ и нормального состояния предстательной железы [Kachakova et al., 2015; Wach et al., 2015]. Однако в других исследованиях предполагается использовать miRNA как маркер метастатического рака [Watahiki et al., 2013].
Вышеперечисленные данные наглядно демонстрируют необходимость дальнейшего поиска новых микроРНК-маркеров метастатической формы РПЖ. Для повышения достоверности, специфичности и чувствительности данной методики перспективным путем является создание панелей микроРНК.
Цель работы
Оптимизация выбора лечебной тактики у больных РПЖ на основе выявления микроРНК, ассоциированных с метастазированием.
Задачи исследования
-
Создать коллекцию плазмы пациентов с локализованным и метастатическим РПЖ.
-
Провести высокопроизводительный анализ микроРНК в плазме из созданной коллекции с помощью полногеномных микрочиповых технологий.
-
Выполнить биоинформатический анализ полученных данных и выявить микроРНК плазмы крови, ассоциированные с метастатическими формами РПЖ.
-
Проанализировать научную литературу и выявить гены-мишени микроРНК, ассоциированных с метастазированием РПЖ.
-
Исследовать биологическую роль генов-мишеней в метастазировании РПЖ с помощью ксенографтных моделей РПЖ человека у иммунодефицитных мышей.
Научная новизна
Впервые проведен анализ уровней микроРНК в плазме крови пациентов с метастатическим и локализованным РПЖ с использованием микрочипов высокой плотности Affymetrix GeneChip miRNA 4.0 Array.
Впервые подобрана панель микроРНК, характерных для пациентов с метастатическим РПЖ.
Впервые изучена роль гена CD46, являющегося геном-мишенью выявленных микроРНК, в развитии отдаленных метастазов на ксенографтной модели РПЖ у иммунодефицитных мышей.
Теоретическая и практическая значимость результатов
Проведено сравнение состава и уровня циркулирующих микроРНК в крови пациентов с локализованным и метастатическим РПЖ. Установлен ген-мишень (CD46) для отобранных микроРНК и исследована его вовлеченность в механизм метастазирования РПЖ. Разработана панель
микроРНК для малоинвазивной дифференциальной диагностики
локализованных и метастатических форм РПЖ, которая может быть использована в практической медицине и лабораторной диагностике. Планируется внедрение на базе отдела трансляционной онкологии МНИОИ им. П.А. Герцена — филиала ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России.
Основные положения, выносимые на защиту
-
При метастатической форме РПЖ в плазме крови повышен уровень семи микроРНК в сравнении с локализованной формой РПЖ.
-
Анализ уровня представленности в плазме крови микроРНК в паре hsa-miR-149-3p и hsa-miR-7110-5p, а также hsa-miR-6724-5p и hsa-miR-7110-5p позволяет дифференцировать локализованный и метастатический РПЖ с чувствительностью 88,9% и 80,6%, специфичностью 73,5% и 75,0% соответственно.
-
Ген CD46 ассоциирован с метастатическим потенциалом РПЖ, т.к. подавление трансляции мРНК этого гена увеличивает миграционную и инвазивную активность клеток РПЖ человека линии DU-145 in vitro и in vivo в ксенографтных моделях.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы в научных изданиях, рецензируемых ВАК Министерства образования и науки РФ.
Структура диссертации
Диссертация изложена на 137 страницах компьютерной верстки, иллюстрирована 4 таблицами и 20 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, двух глав, посвященных материалам и методам и собственным наблюдениям, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, содержащего 252 литературных источника, включая 11 работ отечественных авторов.
Лабораторные методы диагностики отдаленных метастазов РПЖ
Маркеры костного метаболизма представляют интерес для прогнозирования течения и диагностики РПЖ, поскольку известно, что кости являются одним из основных органов для формирования метастазов, а костные метастазы обнаруживаются у 60% больных РПЖ [Брызгунова, Власов, Лактионов, 2007]. У мужчин молодого возраста более 80% всех метастазов наблюдаются в костях [Ganov, Varlamov, Lazarev, 2014]. Таким образом, диагностика этого типа поражения при диссеминации заболевания особенно важна. Практически единственный маркер, который широко используется в клинической практике для диагностики метастатических поражений костей - щелочная фосфатаза (ЩФ). Еще в 1938 г. было отмечено значительное повышение уровня кислой фосфатазы сыворотки крови у мужчин с метастазами РПЖ [Gutman, Gutman, 1938]. Известно, что уровень ЩФ повышается уже при ранних метастазах в костную ткань [Tamada et al., 2001; Brown, Singh, 2006]. Повышенный уровень ЩФ означает наличие метастатического поражения костной ткани в 79% случаев [Wolff et al., 1999 ], а его совместное определение с ПСА значительно увеличивает эффективность диагностики [Lorente et al., 1996]. Однако ЩФ может повышаться не только при метастазах, но и в результате остеопороза, развивающегося на фоне андрогенной депривации [Daniell, 2001]. Исследовались и другие показатели костного метаболизма. Так, Yoshida с соавт. обнаружили, что концентрация PICP (Procollagen Type I Carboxyterminal Propeptide) в сыворотке крови значительно выше у пациентов с РПЖ с костными метастазами, чем у пациентов с РПЖ без генерализации процесса. Концентрация ICTP (Celopeptide of type I collagen) в сыворотке значительно выше у пациентов с РПЖ, чем у пациентов с доброкачественной гиперплазией ПЖ [Noguchi, Yahara, Noda, 2003], а совместное измерение в сыворотке ICTP и ЩФ позволяет определить наличие костных метастазов [Tamada et al., 2001]. Еще одним маркером костных метастазов при РПЖ может служить костный морфогенетический протеин 6 (BMP6): известно, что его экспрессия значительно возрастает у пациентов с метастатическим поражением скелета [Thomas, Hamdy, 2000]. К числу маркеров костного метаболизма относятся также остеопротегерин (OPG), рецептор активатора NFkB (RANK) и его лиганд (RANKL), которые принадлежат к белкам семейства TNF. Показано, что экспрессия RANKL/RANK/OPG коррелирует с развитием метастазов при РПЖ [Брызгунова, Власов, Лактионов, 2007; Chen et al., 2006].
Метастаз-ассоциированный протеин (MTA1) впервые упоминается в работе, посвященной изучению экспрессии генов при РМЖ, в 1994 г. [Toh, Pencil, Nicolson, 1994]. Его функция окончательно не выяснена, но исследователи предполагают, что он может участвовать в активации транскрипции. Есть исследования, в которых установлено, что экспрессия белка MTA1 возрастает при наличие метастазов рака. Как маркер распространенных форм РПЖ рассматривается с 2004 г. [Аляев и др., 2006]. Интересно, что увеличение экспрессии МТА1 соответствует снижению рисков развития рецидивов после проведения радикальной простатэктомии [Hofer et al., 2004]. Как известно, метастазирование при РПЖ наблюдается поздно и сопровождает уже местно-распространенный процесс. Однако характеристики, которые в дальнейшем будут способствовать распространению опухолевых клеток, закладываются уже на ранних этапах развития опухоли [Аляев и др., 2006]. Важной является способность злокачественной клетки к двигательной активности, осуществляющейся через каскад биологических реакций, включающих в себя полимеризацию/деполимеризацию актина. Для обеспечения однонаправленного роста фибриллярного актина (F-актина) концентрация мономера (G-актина) на его (-)-конце должна быть ниже, чем на противоположном, полимеризующемся участке, что реализуется путем связывания мономеров со специальным белком — тимозином -15, высокоспецифичным для аденокарциномы предстательной железы [Аляев и др., 2006] [Chakravatri et al., 2000]. Увеличение экспрессии тимозина -15 коррелирует с вероятностью метастазирования, и оценка ее уровня может быть использована для определения агрессивности опухоли [Hutchinson et al., 2005].
В последние годы были разработаны и внедрены в клиническую практику несколько тест-систем для определения агрессивности течения и прогнозирования РПЖ, в том числе для определения вероятности развития отдаленных метастазов в течение определенного времени наблюдения. Принцип работы данных тест-систем основывается на оценке уровня экспрессии мРНК вовлеченных в жизненно важные клеточные процессы. В настоящий момент зарегистрированы и одобрены 3 коммерческих теста: Decipher, Oncotype DX, Prolaris. Decipher оценивает риск развития метастазов после проведения радикальной простатэктомии. Эта тест-система была разработана на основе анализа 1,4 миллиона молекул, включая кодирующие и некодирующие РНК. В итоговую версию вошли 22 мРНК, которые вовлечены в различные сигнальные пути и участвуют в клеточной дифференцировке, пролиферации, адгезии и подвижности, иммуномодуляции, регуляции клеточного цикла и являются частью андрогенного сигнального пути [Erho et al., 2013]. Результат теста представляет собой шкалу от 0 до 1, где 1 соответствует наибольшему риску развития метастазов РПЖ в течение 5 лет.
Oncotype DX наиболее известен в качестве тест-системы для определения прогноза течения РМЖ. Это система основана на количественной ОТ-ПЦР-РВ 12 онкоассоциированных генов, входящих в состав различных сигнальных путей, в том числе реакция стромы (BGN, COL1A1 и SFRP4), андрогенный сигнальный путь (AZGP1, KLK2, SRD5A2 и FAM13C), пролиферация (TPX2) , поддержания нормальной структуры клетки (FLNC, GSN, GSTM2 и TPM2) и 5 референсных генов (ARF1, ATP5E, CLTC, GPS1 и PGK1) [Knezevic et al., 2013]. Результат оценивается по шкале с диапазоном от 0 до 100, в которой наибольшее значение коррелирует с наибольшей вероятностью развития неблагоприятных исходов при РПЖ у пациентов с низким или средним риском. Это позволяет выбрать правильную тактику лечения: от активного наблюдения до радикального лечения. Рекомендация NCCN включает в себя проведение этого исследования для пациентов с низким и очень низким риском с ожидаемой продолжительностью жизни 10-20 лет [Mohler et al., 2016]. Prolaris - прогностический тест, основанный на оценки уровня экспрессии 31 гена, вовлеченного в регуляции клеточного цикла и 15 генов домашнего хозяйства. Результат представлен в виде пролиферативного индекса, выраженного в баллах [Cuzick et al., 2011]. Этот тест выполняется на биопсиях, полученных от мужчин с низким и очень низким риском, для принятия решения о необходимости назначения немедленного активного лечения или возможности наблюдения. Этот прогностический анализ оценивает вероятность развития в будущем биохимического рецидива и вероятность наступления смерти от РПЖ. NCCN рекомендует использовать этот тест для прогнозирования течения РПЖ, при постановке диагноза отнесенного к группе низкого и очень низкого риска, у пациентов с ожидаемой продолжительностью жизни не менее 10 лет [Mohler et al., 2016].
Анализ профиля представленности микроРНК с помощью микрочипов Affymetrix GeneChip miRNA 4.0
Клеточная линия DU-145 была получена из Немецкой Коллекции Микроорганизмов и Клеточных Культур. Культивирование клеток осуществляли в стандартных условиях в соответствии с рекомендациями поставщика (5% CO2 и 37C в культуральной среде DMEM с добавлением 10% FBS). Жизнеспособность клеток определяли при помощи окрашивания трипановым синим красителем и прямого подсчета окрашенных (т.е. жизнеспособных) клеток. Для последующих экспериментов использовали только препараты, имеющие не менее 95% жизнеспособных клеток. Для получения нокдауна использовали недавно разработанный подход, основанный на явлении интерференции РНК (RNAi) [Siomi, Siomi, 2009]. Суть подхода заключается во введении в исследуемые клетки двухцепочечной РНК (dsRNA). По аналогии с микроРНК последовательность RNAi гомологична участку мРНК-мишени и разрезается на фрагменты siRNA длиной 12-23 пар оснований, которые связываются клеточными белками и формируют индуцируемые РНК-сайленсерные комплексы (RISC). Эти комплексы специфическим образом связываются с мРНК-мишенями и приводят к деградации последних [Zamore et al., 2000]. Для получения стабильного нокдауна целевого гена важно, чтобы dsRNA продолжала оставаться в клетке. С этой целью клетки трансфецируют векторами, обеспечивающими стабильную экспрессию РНК в виде маленькой шпильки (shRNA), содержащей требуемую dsRNA.
Для экспериментов была использована лентивиральная векторная система pLVX (Clontech), адаптированная для введения в нее коротких последовательностей шпилек при помощи коммерчески синтезируемых олигонуклеотидов. Экспрессия shRNA осуществляется под контролем промотора U6 РНК-полимеразы III человека. Вектор содержит ген устойчивости к пуромицину, используемый для позитивной селекции клонов.
Последовательность мРНК гена CD46 получали из базы данных NCBI/Genbank. Далее ее использовали для подбора потенциальных siRNA с помощью онлайн-ресурса Clontech RNAi Target Sequence Selector (http://bioinfo.clontech.com/rnaidesigner/sirnaSequenceDesignInit.do). Верификацию и проверку последовательностей на эффекты offarget проводили с использованием программного обеспечения «Blast» на сайте NCBI. В результате отбирали последовательность, затрагивающую только целевой ген: GTCCTAGGCCTACTTACAA. В качестве неспецифического контроля использовали RNAi против гена люциферазы светляка — клеточная линия shControl. Далее конструировали последовательности shRNA длиной 65-66 пар оснований с помощью онлайн-ресурса Clontech shRNA Designer tool (http://bioinfo.clontech.com/rnaidesigner/oligonucleotideDesigner.do). Для клонирования использовали сайты эндонуклеаз рестрикции EcoRI и BamHI. Клонирование олигонуклеотидов shRNA в вектор осуществляли по стандартным общепринятым методикам [Wicklein, 2012]. Смешивали олигонуклеотиды, соответствующие верхней и нижней цепочке RNAi, в концентрации 100 мкМ и соотношении 1:1 и отжигали путем нагревания до 95С в течение 30 с с последующими инкубациями при 72С, 37С и 25С по 2 мин каждая. В результате получали дуплекс с концентрацией 50 мкМ. Полученные образцы разводили свободной от ДНКаз и РНКаз водой в 100 раз до концентрации 0,5 мкМ. Реакционная смесь для проведении лигирования состояла из 1 мкл плазмидного вектора pLVX-shRNA1, предварительно обработанного эндонуклеазами рестрикции EcoRI и BamHI, 1 мкл предварительно подготовленных олигонуклеотидов (0,5 M), 1,5 мкл 10X буфера для T4 DNA ligase, 10,5 мкл воды без нуклеаз и 1 мкл T4 DNA лигазы (400 Ед/мкл). Реакционная смесь инкубировалась 3 ч при комнатной t. Для трансформации размораживали на льду хемокомпетентные клетки E. coli, добавляли весь объем смеси для лигирования и аккуратно смешивали пипетированием. Инкубировали в течение 30 минут на льду, а затем в течение 90 с при 42С, после чего помещали на лед и выдерживали еще 10 мин. Добавляли 5 мл LB-среды (без добавления антибиотиков) в каждый образец и инкубировали при 37С в течение 30 мин. Помещали клетки E. coli на 1 мл LB-агара, содержащего 10 мкг/мл ампициллина, и инкубировали при 37С в течение ночи. Снимали одну колонию и высевали в 5 мл LB среды (100 мкг/мл ампициллина) и инкубировали при 37С в течение ночи при интенсивном помешивании. После подготавливали плазмиду из 1 мл среды, используя QIAprep Miniprep Kit («Qiagen») согласно протоколу производителя. Элюировали в 50 мкл элюирующего буфера. Аналогичным образом было выполнено клонирование олигонуклетотидов против гена люциферазы светляка.
Анализ экспрессии отдельных микроРНК при сравнении метастатической и локализованной формы РПЖ
Также следует отметить, что каждая отдельная микроРНК, входящая в данные пары, не имеет индивидуальной диагностической ценности. Для всех трех микроРНК (hsa-miR-149-3p, hsa-miR-7110-5p и hsa-miR-6724-5p) отношение средних значений (fold-change) не превосходит 2x, а скорректированный уровень статистической значимости различия представленности (adjusted p-value) оказался выше 0,05 и составил 0,64, 0,21 и 0,47 соответственно.
В литературе упоминание о микроРНК hsa-miR-149-3p встречается в контексте использования микроРНК в диагностике и прогнозировании РПЖ [Schaefer et al., 2010a]. Известно, что уровень данной микроРНК понижен при других типах рака [Cao et al., 2016]. Также есть сведения, что данная микроРНК может участвовать в прогрессии РПЖ посредством целевых генов Ras, Rho и SCF [Zhu et al., 2015]. Данные о микроРНК hsa-miR-6724-5p и hsa-miR-7110-5p в литературе не встречаются. Таким образом, нами было подтверждено, что совместная оценка пар микроРНК, не имеющих индивидуальной диагностической ценности, может служить эффективным методом разделения образцов плазмы крови пациентов с локализованным и метастатическим РПЖ. Самых высоких показателей разделения позволили достичь две пары микроРНК hsa-miR-149-3p и hsa-miR-7110-5p, а также hsa-miR-6724-5p и hsa-miR-7110-5p, при этом для hsa-miR-149-3p ранее обнаружена возможная связь с онкопрогрессией.
Был произведен биоинформатический анализ генов-мишеней микроРНК, входящих в состав пар микроРНК, позволяющих разделять образцы локализованной и метастатической формы РПЖ и обеспечивающих чувствительность более 75%, специфичность более 60%. Анализ генов-мишеней микроРНК, вошедших в финальный классификатор, осуществлялся с помощью баз данных miRTarBase v. 6.0 [Chou et al., 2016] и DIANAarBase v7.0. Интересно, что среди генов-мишеней таких пар микроРНК достаточно часто встречается ген CD46, который кодирует мембранный кофакторный белок CD46, ингибирующий рецептор комплемента. Данный белок содержится практически во всех клетках организма за исключением эритроцитов. Нокдаун CD46 в кишечном эпителии приводит к нарушению нормальной структуры эпителия. Также молекула CD46 способна взаимодействовать с цитоплазматической частью E-кадгерина нормального кишечного эпителия, участвуя в поддержании целостности межклеточных контактов. В человеческих лимфоцитах молекула CD46 способна взаимодействовать с альфа-Е-кадгерином, участвуя в Wnt-пути, а также взаимодействовать с лигандом Jagged-1, что приводит к исчезновению CD46 с поверхности клеток и активации пути Notch [Yamamoto et al., 2013]. Перечисленные механизмы могут указывать на участие CD46 во взаимодействии с межклеточным матриксом и окружающими клетками, что в свою очередь может определять метастатический потенциал клеток РПЖ, однако роль CD46 при данной патологии в аспекте метастатической болезни при РПЖ остается неизученной. Данный факт делает перспективным дальнейшее изучение роли CD46 при метастатическом РПЖ.
Данные пары обеспечили сходное качество классификации. Пара hsa-miR-619-5p и hsa-let-7b-5p обладает наилучшими показателями: чувствительность составила 75,2%, а специфичность 66,2%. Пара hsa-miR-4668-5р и hsa-miR-619-5р позволила достичь чувствительности 72,2% при специфичности 64,7% (совокупная доля ошибок также 23%). В обеих парах встречается микроРНК hsa-miR-619-5р. Известно, что уровень экспрессии данной микроРНК в 5 раз выше при РПЖ, чем при ДГПЖ, что может быть использовано для дифференциальной диагностики этих состояний [Knyazev et al, 2016].
РПЖ остаётся одним из наиболее распространенных видов злокачественных новообразований у мужчин в развитых странах, а метастатическая болезнь при РПЖ характеризуется низкой выживаемостью, несмотря на достигнутые успехи в лечении. Различные исследования выявили существование взаимного влияния опухоли и клеток её микроокружения, причём ранние изменения в микроокружении нормальной ткани могут влиять на канцерогенез, а клетки опухоли в свою очередь вызывают изменение свойств микроокружения. Недавно были обнаружены так называемые метастаз индуцирующие клетки, способные стимулировать клеточную трансформацию, повышать метастатическую активность и стимулировать развитие лекарственной устойчивости опухолевых клеток [Shiao, Chu, Chung, 2016]. Одним из предполагаемых механизмов действия данных клеток считают секрецию различных молекул, включая микроРНК. Так, в нескольких доклинических моделях РПЖ в мышах было показано, что доставка внеклеточных микроРНК от фибробластов, ассоциированных с опухолью, эпителию предстательной железы способна вызывать значительный опухолевый рост посредством стимуляции ЭМТ, увеличивая клеточную подвижность, инвазивность, миграционную и метастатическую активность с повышенным сродством к костной и мягким тканям [Josson et al., 2015].
Выделяемые клетками организма микроРНК способны попадать в циркуляторное русло. Это позволяет предполагать, что микроРНК являются перспективными биомаркерами для малоинвазивной диагностики развития метастатической болезни при РПЖ еще до начала клинических проявлений [Josson, Chung, Gururajan, 2015]. В то же время микроРНК осуществляют свои регуляторные функции путем влияния на экспрессию определенных генов [Patil, Magi-Galluzzi, 2015], что открывает широкие возможности для анализа возможных механизмов, задействованных в регуляции опухолевого роста и метастатического потенциала.
Экспериментальное исследование роли выявленных микроРНК в патогенезе рака предстательной железы на ксенографтных моделях
К настоящему моменту уже известно, что уровень некоторых микроРНК достоверно различается между локализованным и метастатическим РПЖ. Однако не существует единой общепринятой методики их определения; на результат таких исследований значительное влияние оказывает методика получения и обработки клинического материала, кроме того, профили значимых микроРНК могут значительно отличаться в различных популяциях, что делает исследование микроРНК в качестве маркеров различных стадий РПЖ актуальной темой.
При работе с циркулирующими микроРНК важно учитывать, что на их профиль в плазме может оказывать влияние разрушение клеточных элементов и других компонентов плазмы, поэтому во время пробоподготовки важно использовать оптимальные показатели скорости центрифугирования, температуры, количество этапов центрифугирования, а также скорость разгона и торможения. В нашей работе мы использовали центрифугирование в два этапа. Оба этапа проводились при комнатной t при средних значениях скорости разгона и торможения. На первом этапе центрифугировали при скорости 2000 g в течение 10 мин, отбирали весь объем прозрачной жидкости над клеточными фракциями, на втором этапе центрифугировали при 4000 g в течение 10 мин с последующим отбором надосадочной жидкости за исключением 15% объема у дна с клеточным детритом.
При обработке данных об уровне представленности микроРНК в разных группах исключали микроРНК, коррелирующие с уровнем гемоглобина, для исключения влияния гемолиза в образцах на результат.
Было проведено сравнение уровня отдельных микроРНК в плазме крови пациентов с локализованным и метастатическим РПЖ с помощью микрочипов Affymetrix GeneChip miRNA 4.0, содержащих пробы ко всем известным микроРНК из базы данных miRBase v.20. После исключения микроРНК, достоверно коррелирующих с гемолизом, в плазме крови было обнаружено 7 повышенных микроРНК (hsa-miR-328-5p, hsa-miR-663a, hsa-miR-6126, hsa-miR 4674, hsa-miR-6816-5p, hsa-miR-22-3p, hsa-miR-6789-5p) у больных с метастатическим РПЖ по сравнению с локализованным РПЖ. Было выявлено, что для трёх микроРНК с наибольшей вероятностью общими мишенями являются гены JUNB, KMT2A и XPO6, гипоэкспрессия которых по данным литературы может быть связана с развитием, прогрессией и метастатической активностью РПЖ. Подавление данных генов с помощью hsa-miR-22-3p, hsa miR-663a и hsa-miR-4674 может играть роль в поддержании метастатического потенциала и жизнеспособности клеток РПЖ после развития метастатической болезни. Однако при оценке этих микроРНК в качестве диагностического маркера метастатической формы РПЖ мы обнаружили, что они обладают крайне низкими значениями чувствительности и специфичности. Так, для микроРНК 6789-5p чувствительность и специфичность составила 52,8 и 50% соответственно. Значение площади под ROC кривой – 0,558. Для второй лучшей микроРНК 4674 чувствительность составила 58,3%, специфичность – 44,1%. AUС – 0,545. Известно, что чем выше показатель AUC, тем качественнее классификатор, при этом значение 0,5 демонстрирует непригодность выбранного метода классификации и соответствует случайному распределению образцов между группами. Для увеличения чувствительности и специфичности предлагаемого метода было принято решение применить другой подход к стадированию РПЖ на основе микроРНК: использовали не отдельные значимо отличающиеся между группами пациентов микроРНК, а пары микроРНК, которые могли не иметь индивидуальной диагностической значимости, но при оценке в комплексе позволяли достоверно различать локализованную и метастатическую форму РПЖ. Анализ двоек микроРНК, позволяющих проводить дифференциальную диагностику локализованной и метастатической формы РПЖ, выявил две наилучшие пары: hsa-miR-149-3p и hsa-miR-7110-5p, hsa-miR-6724-5p и hsa-miR-7110-5p, которые обеспечили сходное качество классификации. Первая пара, hsa-miR-149-3p и hsa-miR-7110-5p, обеспечивает чувствительность 88,9%, специфичность 73,5%, значение AUC — 0,87 . Вторая пара, hsa-miR-6724-5p и hsa-miR-7110-5p, обеспечивает чувствительность 80,6%, специфичность 75%, значение AUC — 0,85.
Был произведен биоинформатический анализ генов-мишеней микроРНК, входящих в состав пар микроРНК, позволяющих разделять образцы локализованной и метастатической формы РПЖ и обеспечивающих чувствительность более 70%, специфичность более 60%. Среди генов-мишеней таких пар микроРНК часто встречается ген CD46. Вследствие малой изученности его вклада в развитие метастатического процесса было решено использовать его в дальнейших исследованиях.
Для изучения роли выявленных микроРНК была создана клеточная линия с нокдауном гена CD46 — shCD46, в качестве контроля использовали линию с RNAi против гена люциферазы светляка — shControl. Пролиферативная активность в обеих клеточных линиях практически не отличалась. Однако анализ способности клеток к миграции показал существенный рост при подавлении экспрессии гена CD46. Кроме того, подавление экспрессии гена CD46 привело к значительному росту инвазивности клеток.
Эксперименты на ксенографтной модели на основе иммунодефицитных мышей выявили больший по времени рост первичных опухолей и несколько больший вес первичной опухоли при подавлении экспрессии гена CD46, однако анализ циркулирующих и диссеминированных опухолевых клеток показал повышенную агрессивность таких клеток. В частности, был детектирован существенный рост числа циркулирующих опухолевых клеток в крови и диссеминированных опухолевых клеток в легких, костном мозге и головном мозге мышей.