Содержание к диссертации
Введение
Глава I Обзор литературы 11
1.1 Свободнорадикальное окисление и механизмы защиты клеток от окислительного повреждения 11
1.2 Образование и биологическая роль оксида азота 21
1.3 Роль окислительного стресса в нарушении системы гемостаза 27
1.4 Применение природных антиоксидантов при нарушении антиоксидантной защиты у онкологических больных 30
Глава 2. Общая характеристика клинических наблюдений и методы исследования 34
2.1 Клиническая характеристика больных 34
2.2 Методы исследования 42
2.3 Статистический анализ 49
Глава 3 Результаты исследования 51
3.1 Особенности состояния перекисного окисления липидов, антиоксидантной защиты и системы гемостаза у больных колоректальным раком 51
3.1.1 Состояние системы ПОЛ-АО защиты и системы гемостаза в плазме крови у больных колоректальным раком 51
3.1.2 Состояние системы ПОЛ - АО защиты в тромбоцитах больных КРР 61
3.1.3 Динамика показателей перекисного окисления липидов, антиоксидантной защиты и системы гемостаза до операции и в раннем послеоперационном периоде у больных КРР 67
3.2 Особенности состояния показателей перекисного окисления липидов, системы антиоксидантной защиты и системы гемостаза в плазме крови и тромбоцитах у больных колоректальным раком с метастатическим поражением печени 71
3.2.1 Состояние системы перекисного окисления липидов, системы антиоксидантной защиты и системы гемостаза в плазме крови и тромбоцитах больных колоректальным раком, поступивших для хирургического удаления метастазов печени. 71
Глава 4. Коррекция нарушений перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты в плазме крови и тромбоцитах у больных колоректальным раком в раннем послеоперационном периоде 75
4.1 Влияние препарата с антиоксидантными свойствами в коррекции нарушений в системе перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты в плазме крови больных, оперированных по поводу метастазов колоректального рака в печени 75
4.2 Влияние препарата с антиоксидантными свойствами в коррекции нарушений в системе перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты в тромбоцитах больных, оперированных по поводу метастазов колоректального рака в печени 79
Заключение 82
Выводы 95
Практические рекомендации 96
Список литературы 97
Список сокращений 114
- Образование и биологическая роль оксида азота
- Состояние системы ПОЛ-АО защиты и системы гемостаза в плазме крови у больных колоректальным раком
- Состояние системы перекисного окисления липидов, системы антиоксидантной защиты и системы гемостаза в плазме крови и тромбоцитах больных колоректальным раком, поступивших для хирургического удаления метастазов печени.
- Влияние препарата с антиоксидантными свойствами в коррекции нарушений в системе перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты в тромбоцитах больных, оперированных по поводу метастазов колоректального рака в печени
Образование и биологическая роль оксида азота
В биологии произошло крупное событие: установлено, что простейшее химическое соединение – оксид азота (NO) - непрерывно продуцируется ферментативным путём в организме животных и человека, выполняет функции одного из универсальных регуляторов клеточного метаболизма.
В настоящее время нет никаких сомнений относительно высокой значимости оксида азота (NO) для биологии и медицины. Открытие и изучение роли NO как высокоэффективного регулятора в сердечно - сосудистой системе было отмечено в 1998г. нобелевской премией в области физиологии и медицины. Лауреатами премии стали исследователи из США Роберт Фурчгот (Robert F.Furchgott), Ферид Мурад (Ferid Murad) и Льюис Игнарро (Louis J.Ignarro).
Оксид азота (NO) был известен главным образом как токсический газ в атмосфере и рассматривался преимущественно с точки зрения проблем экологии [141]. Однако исследования последующих лет в области сосудистой физиологии, патофизиологии, неврологии, биохимии, фармакологии, иммунологии и других областях биологии и медицины убедительно показали, что этот газ синтезируется в низких и умеренных концентрациях в организме млекопитающих и обладает широким спектром биорегуляторного действия [112]. Уникальные свойства оксида азота обусловили необходимость изучения его эффекта на различные органы и системы организма в норме и при патологии [25].
Громадный интерес к биологии оксида азота позволил редакции журнала «Science» ещё в 1992г. провозгласить её молекулой года. Биологическое действие оксида азота было общепризнано после обнаружения его свойств как фактора релаксации сосудов. Было установлено, что спазмолитическое действие лекарственных препаратов, основу которых составляют различные нитрозо - и нитросоединения (в частности, нитроглицерин, нитропруссид и другие нитровазодилататоры), зависит от их способности генерировать в организме NO [7].
Оксид азота – регулятор клеточного метаболизма
Особый интерес представляет способность оксида азота экспрессировать синтез ряда важнейших белков и ферментов как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции: это стресс-белки, ферритин, белки антиоксидантной защиты, белки рецепторов трансферрина, ядерный белок р53, ответственный за блокаду злокачественных новообразований, и др. [5].
В результате многочисленных исследований было установлено, что оксид азота (NO) обладает широким спектром биологического действия. Показано, что этот метаболит участвует в различных биохимических процессах. Регулирует тонус кровеносных сосудов как антагонист адренергической нервной системы. По эфферентным нервам этот агент регулирует деятельность органов дыхательной системы, желудочно-кишечного тракта и мочеполовой системы [33; 36; 37; 47]. В иммунной системе способствует уничтожению опухолевых и бактериальных клеток [8; 126], сердечно-сосудистой и других системах, тормозит агрегацию тромбоцитов и их адгезию нейтрофилов к эндотелию сосудов [19; 33; 41; 66; 76; 95; 118; 130], участвует в развитии боли [17], респираторной функции [18], а также участвует в регуляции апоптоза [1]. Синтез этого соединения фагоцитирующими клетками связывают с микробицидным и противоопухолевым действием [19; 27; 66]. NO обеспечивает способность макрофагов убивать опухолевые клетки и бактерии. Отмечается влияние NO и на функционирование секреторных тканей и клеток [24].
NO - нетипичная сигнальная молекула, являющаяся неорганическим газообразным соединением со свойствами радикала (N=O), имеет неспаренный электрон, что придаёт ему высокую реакционную способность [6; 118].
NO может реагировать в биологических системах с кислородом, супероксидным анион-радикалом (O2) и ионами металлов переходной валентности. В связи с этим функциональный ответ клетки на действие NO многообразен и в значительной степени зависит не только от клетки – мишени, а, что очень существенно, от количества NO в клетке, редокс - состояния самого NO и окружающих его молекул. Малые размеры и отсутствие заряда, хорошая растворимость в воде и липидах обеспечивают высокую проницаемость через плазматические мембраны клеток и субклеточных структур. Время существования оксида азота не превышает 6 - 10с, после чего он при участии кислорода и воды превращается в нитраты (NO2) и нитриты (NO3) (рис.1) [45; 50].
Для NO среднее время жизни в тканях составляет 5,6 с , в ткани почек - 6,4 с, в миокарде – 0,1 с, в изотоническом растворе NaCl – от 6 до 30 с, а в воде без кислорода NO может сохранить несколько суток. При метаболизме NO образуются азотсодержащие соединения, в которых валентность атома N может быть разной. Наличие в молекуле NO неспаренного электрона определяет его взаимодействие его с активными формами O2. NO активно взаимодействует с гемсодержащими белками, а также с низкомолекулярными соединениями Fe. Способность NO к быстрым окислительно-восстановительным реакциям с образованием нитро - и нитрозосоединений обуславливает цикличность его формирования и деструкции.
Синтазы оксида азота
Синтез оксида азота осуществляется при участии одноименной NO -синтазы, которая имеет три изоформы:
нейрональная (nNOS)
эндотелиальная (еNOS)
индуцибельная (iNOS)
Фермент катализирует пятиступенчатое окисление L - аргинина до L цитруллина и NO. В качестве кофакторов выступает НАДФН, тетрагидробиопротеин (ВН4), флавинадениндинуклеотид и флавинмононуклеотид [13].
Нейрональная NO - синтаза участвует в регуляции роста и дифференцировки клеток центральной нервной системы и, предположительно, в их восстановлении после локальных ишемических повреждений головного мозга.
Эндотелиальной NO - синтазе отводится ведущая роль в обеспечении постоянного базисного уровня оксида азота, который ассоциирует с реализацией механизмов локальной эндотелиальной цитопротекции и поддержанием сосудистого гомеостаза. Снижение активности этой изоформы приводит к нарастанию эндогенной недостаточности оксида азота и является одним из ключевых звеньев патогенеза ишемической болезни сердца. Образование NO эндотелиальной синтазой является важным компонентом регуляции тонуса кровеносных и лимфатических сосудов и предупреждения тромбообразования [27; 33; 49; 95; 118].
Состояние системы ПОЛ-АО защиты и системы гемостаза в плазме крови у больных колоректальным раком
В данном разделе представлены результаты исследований показателей ПОЛ-АО защиты и системы гемостаза у 87 больных КРР при различных стадиях заболевания (табл.10,11), наличия или отсутствия метастазов (табл.12) до лечения.
У больных КРР при всех стадиях заболевания (I-IV) до начала лечения в плазме крови выявлено достоверное снижение содержания метаболитов NOx (р 0,01). Наиболее глубокие и достоверные нарушения обнаружены у больных КРР с IV стадией заболевания, заключающиеся в повышении содержания МДА (показателя интоксикации) и СОД в 1,5 раза по сравнению с контрольной группой.
В таблице 11 представлены показатели системы гемостаза у больных КРР при различных стадиях заболевания.
Состояние системы гемостаза у больных КРР при всех стадиях заболевания (I-IV) характеризуется достоверным повышением фибриногена и Д-димера по сравнению с показателями контрольной группы (р 0,05). Наиболее глубокие и достоверные нарушения выявлены у больных КРР с IV стадией заболевания заключающиеся в увеличении содержания фибриногене и Д-димера относительно показателей больных с I и III стадиями заболевания (р 0,05). Количество тромбоцитов находилось в пределах нормальных значений. В то время как существенных изменений в показателях агрегации тромбоцитов не выявлено.
В таблице 12 представлены результаты исследования системы ПОЛ-ОА защиты у больных КРР с метастазами и без метастазов.
У 27 из 87 больных КРР были выявлены метастазы, из них у 8 (10%) в региональные лимфоузлы и у 19 (22%)- метастазы в печень. Как у больных без метастазов, так и с метастазами развитие опухолевого процесса характеризуется достоверным (р 0,05) угнетением синтеза NOx, в то время как содержание СОД достоверно увеличивалось в 1,2 раза по сравнению с показателями без метастазов, отмечено нарастание содержания – МДА. Содержание глутатиона в эритроцитах у больных ККР с метастазами в лимфатические узлы было в 1,7 раз ниже нормы (0,75±0,1 мкмоль/мл) и достоверно (р 0,01) ниже, чем у больных КРР без метастазов.
В таблице 13 представлены показатели системы гемостаза у больных КРР с наличием и отсутствием метастазов.
Состояние системы гемостаза при прогрессировании злокачественного процесса и развитием метастазов характеризовалось: достоверным повышением концентрации фибриногена (р 0,001), содержанием Д-димеров (р 0,01). Количество тромбоцитов и агрегация тромбоцитов у всех больных также было достоверно повышенным (р 0,05). Наиболее высокие и достоверные показатели системы гемостаза выявлены у больных с метастазами в печень.
В таблице 14 представлены показатели системы ПОЛ-АО защиты у больных прямой и ободочной кишки.
Как видно из представленных данных в таблице 14, содержание метаболитов NOх у всех больных независимо от локализации опухоли до начала лечения было достоверно (р 0,05) снижено по сравнению с нормой и составило 24,7±1,4 мкмоль/л у больных раком ободочной кишки и 24,1±1,0 мкмоль/л раком прямой кишки.
Наиболее высокие показатели СОД выявлены у больных раком прямой кишки и были достоверно выше (p 0,02), чем у больных раком ободочной кишки. Уровень МДА был достоверно (р 0,05) выше нормы, как у больных раком ободочной и прямой кишки. Содержание глутатиона в эритроцитах у всех больных было достоверно низким (р 0,05).
Состояние системы гемостаза (табл.15) у больных раком ободочной и прямой кишки характеризуется выраженной гиперкоагуляцией – повышенным содержанием фибриногена в 1,6-1,5 раза, Д-димера - 5,8-4,7 раза, увеличением количества тромбоцитов в 1,3раза. При этом изменений в агрегационной активности тромбоцитов не установлено.
Далее мы провели исследование изменения состояния системы ПОЛ - АО защиты у больных раком прямой и ободочной кишки в зависимости от стадии заболевания представленных в таблице 16 и наличия или отсутствия метастазов -в таблице 17.
У больных раком прямой и ободочной кишки при прогрессировании процесса не получено достоверных изменений в содержании метаболитов NOx в плазме крови и глутатиона в эритроцитах. В то же время у больных раком прямой кишки III-IV стадии заболевания, несмотря на достоверное увеличение содержания СОД нарастает содержание МДА – показателя интоксикации по сравнению с I-II стадией заболевания.
У больных раком как прямой, так и ободочной кишки при генерализации процесса и развитии метастазов (III-IV стадия заболевания) показатели системы ПОЛ-АО защиты не различались и характеризовались низким содержанием метаболитов NOx в плазме крови, глутатиона в эритроцитах, при достоверном (р 0,01) увеличении содержания СОД (табл.17).
В таблицах 18, 19 представлены результаты исследования показателей системы гемостаза у больных раком прямой и ободочной кишки с различной стадией заболевания и наличия или отсутствия метастазов.
Состояние системы перекисного окисления липидов, системы антиоксидантной защиты и системы гемостаза в плазме крови и тромбоцитах больных колоректальным раком, поступивших для хирургического удаления метастазов печени.
В таблице 28 представлены дооперационные показатели процессов ПОЛ-АО защиты в плазме крови и системы гемостаза у больных КРР, поступивших для хирургического удаления метастазов в печени. У больных метастатическим раком печени в предоперационном периоде в плазме крови выявлено достоверное повышение содержания метаболитов NOх (до 35,0±1,2 мкмоль/л), что характерно для развития воспалительного процесса. При этом содержание СОД оставалось высоким до 107,0±10 нг/мл, повышение уровня МДА до 6,4±0,4 мкмоль/мл свидетельствует о значительном накоплении токсичных продуктов пероксидации в организме. Уровень фибриногена был высоким (416±35,6 мг/дл), количество тромбоцитов сохранялось на уровне 279±20 х10/л, но при этом концентрация Д-димера, одного из надежных и чувствительных маркеров тромбообразования, была в 1,6 раз выше нормы и составляла 1,62±0,86 мкг/мл.
В таблице 29 представлены показатели процессов ПОЛ-АО защиты в тромбоцитах больных КРР, поступивших для хирургического удаления метастазов в печени до операции.
В предоперационном периоде в тромбоцитах больных с метастатическим поражением печени обнаружено достоверное (p 0,05) снижение содержания СОД и МДА. Содержание метаболитов NOx было несколько выше (8,8±0,5 мкмоль/л) контрольного уровня, достоверного различия не обнаружено.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о более глубоких повреждениях процессов ПОЛ-АО защиты у больных метастатическим поражением печени, поступивших для хирургического лечения после первично удаленной опухоли КРР. Высокое содержание метаболитов оксида азота в плазме крови больных отражает развитие воспалительного процесса, а высокое содержание СОД в 1,8 раз указывает на нарушение защитных функций АО системы. Достоверное повышение содержания МДА в плазме крови свидетельствует об усилении окислительного стресса и нарастании эндогенной интоксикации в организме. В тромбоцитах больных метастатическим поражением печени обнаружено незначительное повышение содержания метаболитов NOх и достоверном снижение СОД в 1,4 раза и МДА в 1,6 раз.
Нашими исследованиями достоверно (p 0,01) установлено значительное снижение содержания плазменного и внутриклеточного (в тромбоцитах) глутатиона у больных КРР.
Влияние препарата с антиоксидантными свойствами в коррекции нарушений в системе перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты в тромбоцитах больных, оперированных по поводу метастазов колоректального рака в печени
В главе 4.2 представлены результаты показателей системы ПОЛ-АО защиты в тромбоцитах 31 больного, оперированного по поводу метастазов КРР в печень в раннем послеоперационном периоде. После расширенной резекции печени у них были отмечены клинические признаки печёночной недостаточности, требующие метаболической коррекции. В связи с этим после операции 15 больным в течение 5 дней дополнительно к стандартной интенсивной терапии внутривенно вводили препарат «Селеназа». 16 больных составили контрольную группу (табл.31).
Содержание метаболитов NOx в тромбоцитах больных метастатическим раком печени (в обеих группах) на 3 сутки после операции увеличилось в 2 раза по сравнению с дооперационным периодом, а к 5 суткам достоверно снизилось и составило 9,8±1,0 мкмоль/л и 10,1±1,4 мкмоль/л. Содержание СОД у всех больных на 3 сутки после операции было достоверно (p 0,05) выше в 1,6 и 2,2 раз показателей дооперационного уровня, в то время как к 5 суткам нормализовалось.
Уровень МДА на 3 сутки после операции у больных получавших селен незначительно повысился до 1,15±0,3 мкмоль/мл и к 5 суткам приходил к норме. В группе больных, не получавших селен уровень МДА на 3 сутки после операции был достоверно (p 0,05) выше показателей до операции и к 5 суткам достоверно (p 0,05) снизился в 2,4 раза относительно нормы.
Таким образом, у больных метастатическим раком печени до операции установлено снижение содержания Se в крови, снижение антиоксидантной защиты и угнетение детоксикационной функции печени - повышенная концентрация токсических метаболитов NOx и МДА. Повышенное содержание NOх явилось специфичным для данной группы больных. Накопление в крови токсических продуктов существенно ухудшает внутриклеточный метаболизм. Содержание Se остается на дооперационном уровне, а содержание NO-радикалов увеличивается на 20% (39,3±2,2 мкмоль/л), а МДА в 1,8 раз (9,8±1,2 мкмоль/мл) превышает дооперационный уровень. Ранний послеоперационный период после обширных резекций печени характеризуется угнетением как детоксикационной, так и синтетической ее функции - острым снижением содержания в крови не только протромбиновой активности и протромбинового времени, общего белка и альбумина, но и ингибиторов свертывания: антитромбина, протеина С, а также плазминогена.
Проведенные исследования показали, что увеличение уровня в крови Se до 88,2±3,2 мкг/л обеспечивает более раннее восстановление детоксикационной и синтетической функции печени после операции, что подтверждается достоверной нормализацией в крови содержания метаболитов NOх, снижением токсических МДА, снижением степени коагулопатии потребления.
Представленные результаты указывают на эффективность применения селенита натрия в раннем послеоперационном периоде для восстановления нарушенных окислительных процессов в гепатоцитах. Однако, очевидно, что продолжительность введения селенита целесообразно было бы продолжить. Дальнейшие исследования позволят разработать необходимые условия для повышения эффективности селен-содержащих препаратов и существенно улучшить адаптационные возможности организма.