Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Клинико-морфологические и молекулярно генетические аспекты клинически наследственного РМЖ (обзор литературы). 11
1.1. Распространенность РМЖ при генетических мутациях 11
1.2. Особенности анамнеза больных РМЖ при мутациях в генах BRCA1/2 14
1.3. Структура генов BRCA1/2 и региональная распространенность 18
1.4. Молекулярно-биологические особенности НРМЖ у женщин при носительстве генетических мутаций BRCA1/2 23
1.5. Особенности лечения и прогноза заболевания у носительниц мутаций в генах ВRCA1/2 31
Глава 2. Общая характеристика методов исследования и клинического материала 35
2.1. Клиническая характеристика групп больных 35
2.2. Клинико-эпидемиологические методы исследования 38
2.3. Иммунногистохимические, морфологические исследования, методы ДНК-проточной цитометрии, определение сывороточных белков СА 15-3 и HER-2/neu 39
2.4. Молекулярно-генетические исследования 43
2.5. Статистические методы 44
Глава 3. Анализ встречаемости BRCA1 и BRCA2 мутаций в Ростовской области 46
Глава 4. Сравнительная клинико-анамнестическая характеристика больных клинически наследственным и спорадическим РМЖ 53
4.1 Клинико-анамнестические характеристики больных с наследственным и спорадическим РМЖ 53
4.2 Способ определения риска наследственной детерминированности РМЖ по анамнестическим данным 73
Глава 5. Иммуногистохимические особенности клинически наследственного РМЖ 80
Глава 6. Уровни некоторых сывороточных белков у больных клинически наследственным и спорадическим РМЖ 95
Глава 7. ДНК-цитометрические характеристики клинически наследственного и спорадического РМЖ 104
Заключение 116
Выводы 130
Практические рекомендации 131
Список сокращений 132
Список литературы 133
- Молекулярно-биологические особенности НРМЖ у женщин при носительстве генетических мутаций BRCA1/2
- Клинико-анамнестические характеристики больных с наследственным и спорадическим РМЖ
- Иммуногистохимические особенности клинически наследственного РМЖ
- ДНК-цитометрические характеристики клинически наследственного и спорадического РМЖ
Молекулярно-биологические особенности НРМЖ у женщин при носительстве генетических мутаций BRCA1/2
Отличия в молекулярном патогенезе между клинически НРМЖ и BRCA-ассоциированным раком предполагают, что эти ЗНО могут различаться по клиническому течению и морфологическим признакам (Беспалов В.Г. и соавт., 2015). Герминальные мутации BRCA1/2 можно отнести к числу молекулярно-генетических маркеров, имеющих прогностическое значение (Balmana J. et al., 2011; Kang E. et al., 2013). У BRCA1-ассоциированных опухолей обычно имеются отрицательные РП, РЭ и в большинстве случаев они Her-2/neu негативны. Также отмечается повышенная частота мутаций denovoТР53 (Кит О.И. и соавт., 2014). Тройной негативный рак молочной железы (ТНР) определяется у большей части BRCA1+ больных (Нелюбина Л.А., 2014; Ferguson N.L. et al., 2013; Anestis A. et al., 2015). А опухоли с мутацией BRCA2 обычно экспрессируют РП и РЭ и для них характерной картиной является тенденция к экспрессии Her-2/neu и более высокой дифференцировке (Carey L. et al., 2010; Xie M., et al., 2015). Следовательно, явно выявлена связь патоморфологических характеристик опухоли с BRCA-генотипом. Прогноз и течение заболевания являются индивидуальными генетическими особенностями каждой пациентки (Батенева Е.И. и соавт., 2015; Del Prete A. et al., 2011; Morrow M. et al., 2015).
BRCA1-ассоциированные опухоли имеют определенные характеристики, такие как высокая степень злокачественности, тройной негативный рецепторный статус, низкая степень дифференцировки, гиперэкспрессия р53, низкая экспрессия циклина D1, p27 и высокий ядерный индекс Блэка, а также преобладание по гистотипу опухоли инфильтрирующего протокового рака (De Jong M. et al., 2002; Lynch H.T. et al., 2008). Напротив, экспрессия гена BRCA2 повышает риск возникновения высокодифференцированных форм РМЖ с положительным рецепторным статусом и низким митотическим индексом до 85%, а по гистотипу опухоли отмечается преобладание долькового и тубулярного рака в 52% случаев (Wilson A.R. et al., 2013). Немаловажным остается тот факт, что носители BRCA-мутаций имеют повышенную тенденцию к развитию первичных ипсилатеральных и контратеральных опухолей молочных желез (Захарова Н.А. и соавт., 2015; Graeser M.K. et al., 2009).
В настоящее время прогрессирование опухолевого роста при НРМЖ зависит от гена-супрессора р53 (Колядина И.В. и соавт., 2013; Houchens N. et al., 2008; McLaughlin R., O Hanlon D., McHale T. et al., 2011). Однако в литературных источниках так и не пришки к единому знаменателю по поводу частоты встречаемости опухолей при наличии мутации в гене р53 (Fang Q. et al., 2011). Раньше считалось, что мутации в данном гене связаны лишь с 1% всех наследственных форм РМЖ, но по данным мировой статистики за последние годы на их долю приходится значительно большее колличество случаев НРМЖ, и следует отметить, что болезнь возникает в более молодом возрасте – до 30 лет. Если в гене р53 находится герминальная мутация, то риск развития РМЖ повышается на 30–40% (Chen C. et al., 2014). Мутантный ген р53 характеризуется плохим прогнозом течения заболевания: в 13–20% случаев экспрессируется при протоковом раке in situ, в 25% – при инвазивном раке и в 50% – при метастатическом РМЖ (Шуров Н.Ф., 2014; Оксанчук Е.А. и соавт., 2015).
Установлено, что у пациенток с мутациями в гене р53 РМЖ представлен дольковым и медуллярным гистологическими вариантами, что характеризуется низкой экспрессией стероидных рецепторов и высокой степенью злокачественности (Pharoah P.D. et al., 1999; Bozovic-Spasojevic I. et al., 2014). Сам опухолевый узел в клинической практике имеет большой размер и обладает резистентностью к химиотерапии, что обусловливает неблагоприятный прогноз (Сытенкова К.В. и соавт., 2011; 2012; Petitjean A., 2007). S.R. Lakhani (2005) в своем исследовании представил, что в опухолевой ткани РМЖ у больных с мутациями BRCA1 не содержатся Her-2/neu, РЭ и РП, но присутствует повышенная экспрессия р53. А вот при наличии BRCA2-мутации в опухоли у больных не имеется никаких различий по сравнению с опухолями спорадического РМЖ (Carey L. et al., 2010). Отличительными особенностями спорадического РМЖ от НРМЖ являются: возникновение данной патологии у женщин старше 60 лет, по наследству не передается, отличается низким риском возникновения метахронного рака, характеризуется экспрессией РП и РЭ, а по гистологическому строению преобладают инфильтрирующий дольковый и смешанный варианты РМЖ (Поспехова Н.И., 2011; Meindl A. et al., 2011). При спорадическом РМЖ герминальные мутации встречаются редко, но снижение экспрессии BRCA1 имеет место (Апанович Н.В. и соавт., 2011; Dyrstad S.W. et al., 2015). Опухоли молочной железы обладают разнообразными морфологическими и клиническими чертами, часть из которых имеет прогностическое значение (Пак Д.Д. и соавт., 2012; Кит О.И. и соавт., 2014; Хант К., 2015; Bastien R.R. et al., 2012). Наличие базальноподобного рака у больной моложе 50 лет повышает шанс обнаружения мутации BRCA1 в 10 раз (Тюляндин С.А. и соавт., 2010; Крылов А.Ю. и соавт., 2017). Также несколько исследований показало, что при наличии мутации BRCA1 чаще встречается ТНР, чем при ее отсутствии (Франк Г.А. и соавт., 2013; Игнатова Е.О. и соавт., 2014; Hammond M. et. al., 2011). В рутинной практике «золотым стандартом» принято считать ИГХ-исследование с определением экспрессии РП и РЭ, уровень экспрессии Her2-neu и маркер пролиферативной активности Ki 67. Однако экспрессию РА, Е-кадгерина, топоизомеразы-II-альфа (Topo2) и Bcl-2 также можно рассматривать в качестве предикторов РМЖ (Одарченко С.П. и соавт., 2012; Cheang M.C.U. et al., 2009; Ly A., Lester S.С., Dillon D., 2012).
Как правило, BRCA1-ассоциированные опухоли молочной железы в 80% случаев являются трижды негативными, лишь 10% ранних трижды негативных опухолей являются BRCA1 – позитивными (Нефедова Н.А. и соавт., 2013; Young S.R. et al., 2009). А вот большая часть опухолей при BRCA2-мутации экспрессирует рецепторы РП, РЭ и HER2/neu (Mavaddat N. et al., 2012). Наиболее пристальное внимание ученых привлекают изменения при злокачественных опухолях, связанные с энзимом Topo2, но в литературных источниках о предиктивном и прогностическом значении экспрессии Topo2 мнения авторов расходятся (Шатова Ю.С. и соавт., 2015; 2016; Оlszewski W. et al., 2014). Основная направленность проводимых исследований – это установление прогностического значения и роли Topo2 в отношении чувствительности к химиотерапии РМЖ (Brase J. et al., 2010; Fountzilas G. et al., 2012; Susini T. et al., 2014). У 1/3 больных РМЖ отмечается гиперэкспрессия Topo2 (36,0–61,4%). Есть данные о гиперэкспрессии Topo2 у 93,1% Her2neu+ больных (Knoop A. et al., 2005; Hannemann J. et al., 2006; Oakman C. et al., 2009; Engstrm M. et al., 2014). Y. Du et al. (2011) в 13 исследованиях подтвердил положительную реакцию на препараты антрациклинового ряда при Topo2+.
Bcl-2, он же регулятор апоптоза (Apoptosis regulator Bcl-2) – внутриклеточный белковый фактор (рисунок 1.4) – основной представитель семейства Bcl (Райхлин А.Н., 2002; Павленко И.А. и соавт., 2012; Зборовская И.Б., 2014; Veis D.J. et al., 1993; Oakes S.R. et al., 2012).
Как считают многие авторы, повышенная экспрессия Вcl-2 ассоциируется с увеличением выживаемости пациенток после проведения адъювантной химиотерапии (Семиглазов В.Ф. и соавт., 2012; Crawford A. et al., 2011; Hasnan J. et al., 2012; Hwang Kiae et al., 2012; Rostamizadeh L. et al., 2013). Корреляционная связь отмечается при Bcl-2+ между биологическими подтипами РМЖ (люминальный А), возрастом, постменопаузой, размером опухоли, но и установлена отрицательная корреляция между экспрессией антигена bcl-2 и степенью гистологической злокачественности опухолей (Кириллина М.П. и соавт., 2014; Кит О.И. и соавт., 2014; Bozovic-Spasojevic I. et al., 2014).
Наименее изученным предиктором в ИГХ-исследовании является E-кадгерин – мембранный белок, гликопротеин из надсемейства кадгеринов, который обеспечивает межклеточную адгезию (Мнихович М.В. и соавт., 2015; Berx G. et al., 1995; Meng W. et al., 2009; Singhai R. et al., 2011). Известно, что ряд карцином человека, в частности, протоковые карциномы молочной железы, могут сохранять экспрессию Е-кадгерина, что свидетельствует о существовании механизмов запуска инвазии, не связанных с угнетением экспрессии Е-кадгерина (Tang D. et al., 2012; Vered M. et al., 2012; Rakha E.A. et al., 2013). Значительное увеличение экспрессии Е-кадгерина также характерно для отечно-инфильтративной формы РМЖ – самой неблагоприятной по клиническому прогнозу и течению заболевания, при котором отмечается выраженная лимфоваскулярная инвазия с формированием микроэмболов опухолевых клеток в лимфатические сосуды (Глушанкова Н.А. и соавт., 2014; Tang D. et al., 2012). В ряде исследований отмечена корреляционная связь между изменением экспрессии Е-кадгерина, отрицательной экспрессией РЭ в первичной опухоли, высокой степенью злокачественности и способностью к метастазированию (Brzozowska A. et al., 2012; Weissenbacher T. et al., 2013). При РМЖ изменение экспрессии Е-кадгерина обнаруживалось в 51,9% (Batlle E. et al., 2000). Еще в ряде проведенных исследований была выявлена корреляция экспрессии Е-кадгерина и РА (Tang D. et al., 2012; Singhai R. et al., 2015).
Клинико-анамнестические характеристики больных с наследственным и спорадическим РМЖ
Сравнительный анализ клинико-анамнестических характеристик больных РМЖ проводили в трех группах: 1 группа включала 27 больных с клинически НРМЖ BRCA+, 2 группа – 33 пациентки с клинически НРМЖ BRCA- и 3 группу составляли 30 больных со спорадическим РМЖ.
Было проанализировано распределение пациенток клинических групп по биологическому подтипу опухоли (таблица 4.1)
В 1 группе люминальный А РМЖ встречался в 3 (11,1%), во 2 группе в 6 (18,2%) и в 3 группе – в 9 (30%) наблюдениях. То есть, люминальный А РМЖ, для которого характерен наиболее благоприятный прогноз, достоверно реже (p 0,05) наблюдался в 1 группе больных в сравнении со 2 группой и, тем более, с 3 клиническими группами, что соответствует данным литературы (Davis A.A. et al., 2012). Несколько чаще, но достоверно реже по сравнению с 3 группой, он был отмечен у больных 2 клинической группы (p 0,05). Люминальный В РМЖ также реже встречался в 1 группе больных (44,4%) по сравнению со 2 (63,6%) и 3 (63,3%) группами (p 0,05). HER2neu+ РМЖ был редким по частоте во всех трех группах без формирования статистически значимых различий: 11,1, 6,1 и 3,3% соответственно. Логичным являлся и тот факт, что ТНР с самым неблагоприятным прогнозом, в противоположность люминальным опухолям, достоверно чаще (p 0,05) встречался в первых двух группах (33,3% при BRCA+ и 12,1% при BRCA-) по сравнению со 3 группой (3,3%). Полученные данные соответствуют данным литературы о большей частоте встречаемости мутаций BRCA1/2 у больных с ТНР (Колядина И. В. и соавт., 2015; Гришина К.А. и соавт., 2016; Kwan M.L. et al., 2009; 2010; Ferguson N.L. et al., 2013). Тем не менее, следует отметить, что частота встречаемости ТНР среди больных 2 группы также достаточно высока по сравнению с 3 группой (p 0,05).
Для люминального В-подтипа РМЖ тактика лечения и его эффективность зависит от наличия либо отсутствия амплификации или гиперэкспрессии гена HER2-neu.Анализ частоты вариантов люминального B подтипа в клинических группах представлена в таблице 4.2.
В 1 группе у всех 12 пациенток с люминальным В-подтипом гиперэкспрессия или амплификация гена HER2-neu отсутствовала. Во 2 группе чаще наблюдался люминальный В HER2-neu- вариант – 54,5% против 9,1% (от общего объема группы). И только в 3 группе случаи с отрицательным и положительным фактом гиперэкспрессии или амплификации гена HER2-neu у пациенток с люминальным В РМЖ распределились равномерно – 9 (30%) и 10 (33%) больных соответственно. Итак, HER2-neu+ статус опухоли не был ассоциирован ни с мутацией BRCA 1/2, ни с клинически НРМЖ.
На первом этапе оценивали антропометрические данные. Различий по росту и весу среди женщин трех подгрупп не наблюдалось (p 0,05) (таблица 4.3).
Так, в 1, 2 и 3 группах средний рост составлял 163,6±1,5, 163,6±1,0 и 162,7±1,1 см, а вес – 68,6±2,5, 70,7±2,3 и 72,1±1,9 кг соответственно.
В 1 группе число больных с астеническим типом телосложения – 6 (22,2%) было выше по сравнению с 2 (6,1%) и 3 (3,3%) группами за счет снижения доли пациенток с гиперстеническим типом телосложения, вероятнее это отличие было из-за более молодого возраста входящих в эту группу больных (таблица 4.4). Распределение больных трех групп с нормостеническим типом телосложения было равномерным.
Распределение больных клинических групп по типам ожирения отражено в таблице 4.5. Во всех подгруппах превалировал смешанный тип ожирения. Различия не достоверны (p 0,05).
Гирсутизм не выявлялся во всех трех группах.
Структура сопутствующей соматической патологии отражена в таблице 4.7. Достоверно значимых отличий между клиническими группами выявлено не было, кроме большей частоты встречаемости сопутствующей сердечно-сосудистой патологии в группе спорадического РМЖ (артериальная гипертензия (26,7%), ишемическая болезнь сердца (10,0%)). На наш взгляд, объясняется это не какими-либо специфическими особенностями этих опухолей, а с тем, что данная патология ассоциирована с возрастом больных, который максимален именно в 3 группе.
На постоянный прием лекарственных веществ в 1 группе указывали 3 (11,1%), во 2 группе – 3 (9,1%) и в 3 группе – 8 (26,7%) пациенток. В 1 группе 3 (11,1%) пациентки длительное время принимали ингибитор АПФ, во 2 группе по 1 (3%) больной в каждом случае лечились эутироксом, ингибитором АПФ бисопрололом и ингибитором АПФ эналаприлом. В 3 группе 4 (13,3%) пациенток принимали эутирокс, 2 (6,7%) – противоишемические и 2 (6,7%) – антигипертензивные препараты, 1 (3,3%) больная – сахароснижающее вещество и 1 (3,3%) пациентка – противоязвенные препараты. Таким образом, особенности постоянного приема препаратов вытекали из структуры сопутствующей висцеральной патологии.
Частой сопутствующей гинекологической патологией у больных трех групп была миома матки: в 1 группе в 11,1%, во 2 группе в 9,1% и в 3 группе в 13,3% (таблица 4.8).
В 1 группе чаще по сравнению со 2 и 3 группой встречались киста яичников (11,1%) и аденомиоз (11,1%). Однако, учитывая небольшую численность выборки, различия не носят достоверного характера. Более частая патология яичников у женщин с BRCA-ассоциированным раком по сравнению с больными со спорадическим РМЖ (20,0 и 9,2%) была отмечена и в работе Д.Е. Автомонова (2012). У больных 2 группы в единичных случаях встречались РЯ, рак тела матки, а в 3 группе – рак и полип шейки матки. Межгрупповых различий при этом обнаружено не было.
Довольно частым явлением в изучаемых группах было наличие гинекологических операций в анамнезе: в 1 группе в 44,4%, во 2 группе в 42,4% и в 3 группе в 30% (таблица 4.9).
Иммуногистохимические особенности клинически наследственного РМЖ
РМЖ является гетерогенным заболеванием с разнообразием фенотипических форм. Молекулярно-генетические и ИГХ характеристики определяют различие биологических подтипов РМЖ, которые отличаются по показателям продолжительности жизни и прогнозу заболевания. Этиопатогенетический механизм развития НРМЖ обусловлен нарушениями в генах репарации ДНК различной степени пенетраности (Кропельницкий В.А. и соавт., 2014). По гистологическим характеристикам РМЖ, ассоциированный с мутациями в генах репарации ДНК, чаще соответствует медуллярному раку высокой степени злокачественности с высокой частотой спонтанных некрозов и трижды негативному молекулярно-биологическому подтипу (Liedtke C. et al., 2013). Особенностью является низкий уровень экспрессии Ciklin D1+ при мутации BRCA1 по сравнению с носителями мутации BRCA2 и спорадическим РМЖ (30,0% против 56,0 и 79,0%) (Добренький М.Н. и соавт., 2006; Tung N. et al., 2010). РМЖ с наличием мутации BRCA1 по сравнению со спорадическим РМЖ чаще возникает из базального слоя клеток эпителия молочной железы (Atchley D.P. et al., 2008), тогда как BRCA2-ассоциированные опухоли характеризуются сходными гистологическими характеристиками со спорадическим РМЖ (Lakhani S.R. et al., 2005).
Мутация гена BRCA1 ассоциирована с повышением экспрессии генов-индукторов апоптоза и снижением уровня экспрессии генов, связанных с его подавлением (Farmer H. et al., 2005).
На сегоднешний день ИГХ-методы получили широкое распространение в клинике, диагностике, лечении и профилактике онкологических заболеваний, а также прочно вошли в рутинный арсенал современных научных подходов при изучении различных опухолей. Основными белками, регулирующими апоптоз, являются белки семейства BCL-2 и супрессор опухолевого роста р53. Ген p53 является одним из представителей группы генов – супрессоров опухолевого роста и отвечает за процессы репарации ДНК перед началом клеточного деления, регуляцию клеточного цикла и апоптоз. Нарушения функций p53 в результате точечных мутаций, делений, изменения локализации внутри клетки приводят к утрате супрессивных свойств и стимулируют опухолевый процесс. В результате мутаций дикого (нормального) типа p53 образуется мутантный тип, который способствует более быстрому инвазивному росту опухоли. Считается, что положительная ИГХ-реакция обусловлена наличием именно мутантного типа p53 (Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2012).
Гиперэкспрессия гена bcl-2 предотвращает характерные морфологические признаки апоптоза. Клетки, в которых гиперэкспрессия гена блокирует апоптоз, устойчивы к действию индукторов клеточной гибели и могут длительно сохранять жизнеспособность. В таких условиях ген bcl-2 является онкогеном, обуславливающим развитие злокачественных опухолей. По данным ряда авторов, опухолевый рост связан с блокированием апоптоза при сохраняющемся уровне пролиферации, что в свою очередь связано с блокированием функции гена p53 и гиперэкспрессией bcl-2 (Magnelli L., Chiarugi V., 1997).
По нашим данным, экспрессия р53 в ядрах опухолевых клеток в первой группе отмечена в 44,4% (12 из 27). При этом лимфоциты, инфильтрирующие опухоль, и клетки стромы опухоли не были окрашены антителами к р53. Разброс количества клеток, которые окрасились, находился в диапозоне от единично-окрашенных ядер до 80% ядер опухолевых клеток, в среднем составив 28,6±8,2% (рисунок 5.1).
В опухолях, относящихся ко второй клинической группе, накапливание р53 в ядрах клеток встречалось в 45,4% случаев (11 из 33). Разброс клеток по экспрессии данного маркера находился в пределах от полного отсутствия окрашивания до 40% позитивных ядер опухолевых клеток, в среднем составив 19,1±6,2% (рисунок 5.2).
Накопление р53 в ядрах опухолевых клеток третьей клинической группы отмечено такжев 33,3% (10 из 30) случаев. А разброс процента позитивных клеток по экспрессии данного маркера был в пределах от единично-окрашенных до 30%, в среднем составив 8,4±3,2% (рисунок 5.3).
Проведенное нами ИГХ-исследование выявило увеличение доли опухолей в 1 группе с гиперэкспрессией p53 в 1,3 раза в сравнении со2 и 3 клиническими группами (р 0,05) (таблица 5.1).
Достоверных различий в среднем содержании p53 позитивных клеток среди опухолей 1 и 2 группами нами выявлено не было, но отмечено их общее повышение в 3,4 раза в сравнении со спорадическим РМЖ (p0,05) (таблица 5.2).
Проведенное ИГХ-исследование выявило разнонаправленные отличия в накоплении bcl-2 в цитоплазме опухолевых клеток 1 и 2 группах, по сравнению с 3 группой (р0,05) (таблица 5.1). Так, в первой группе в 85,2% (23 из 27) случаев отмечена экспрессия bcl-2. Несколько реже, в 70% случаев, третьей группе (21 из 30). Тогда как позитивных случаев по экспрессии bcl-2 во второй группе отмечено в 1,8 и 1,4 раза меньше в сравнении с первой и третьей группами соответственно. Таких опухолей в нашем исследовании выявлено 48,5% (16 из 33).
Наиболее высокие значения отмечены для второй группы, где среднее содержание bcl-2 положительных опухолевых клеток составило 81,4±4,5%, с разбросом от 60% до 95% клеток (рисунок 5.5). Достоверно значимые минимальные значения количества опухолевых клеток, позитивно окрашенных антителами к bcl-2, нами получены в третьей группебольных (р0,05). В данной группе разброс находился в пределах от 30 до 80%, в среднем составив 53,8±5,1% (p0,05) (рисунок 5.6).
ДНК-цитометрические характеристики клинически наследственного и спорадического РМЖ
Отличия в молекулярном патогенезе между BRCA-ассоциированными и ненаследственными ЗНО молочных железы предполагают, что эти опухоли могут в корне различаться по прогностическим и фенотипическим признакам, а мутации BRCA1/2 можно рассматривать как молекулярно-генетические маркеры, кторые имеют дальнейшее прогностическое значение (Бит-Сава Е.М., 2014; Wooster R., Bignell G., Lancaster J. et al., 1995). D. Stoppa-Lyonnet с соавт. (2001) продемонстрировал такие данные, что опухоли, в которых присутствовали мутации BRCA1, были по размеру больше, а отсутствие пораженных регионарных лимфатических узлов не уменьшало стадийность у «BRCA-носителей» (Автономов Д.Е., 2014). Отмечено, что опухоли спорадического РМЖ обладают меньшей степенью злокачественности по сравнению с опухолями, ассоциированными с мутацией в генах BRCA1/2. Другими учеными выявлен явно выраженный лимфоцитарный инфильтрат, окружающий ткань опухолей, обусловленных наличием мутаций генов BRCA1/2, что может быть причиной агрессивной реакции иммунной системы, благоприятно влияющей на дальнейший прогноз заболевания (Хмелевский Е.В., Харченко В.П., 2003; Lakbani S. et al., 1999). O. Johansson с соавт. (1998) пришел к такому выводу, что РМЖ, обусловленный BRCA2-мутациями, имел схожий прогноз с 3-й исследуемой группой, которые страдали спорадическим РМЖ, отобранных по возрастной категории. Безрецидивная 5-летняя выживаемость составила 52% для каждой группы. Для носителей герминальных мутаций BRCA2 общая выживаемость составила 74%, а для спорадических случаев – 75%. Безрецидивная выживаемость при метахронном РМЖ, обусловленная BRCA2-мутацией, была намного хуже по сравнению со спорадическим РМЖ (Verhoog L. et al., 1998).
Методом проточной цитометрии нами изучено и проанализировано распределение клеток по стадиям клеточного цикла, содержание ДНК в опухолевых клетках молочной железы, и пролиферативная активность опухоли молочной железы в 3 группе больных спорадическим раком, 2-й и 1-й клинических группах.
Исследование распределения клеток по содержанию ДНК позволяет анализировать стадии клеточного цикла, наличие анеуплоидных опухолевых клонов и апоптозных клеток. При патологии в покоящейся (неделящейся) клетке количество ДНК может отклоняться от нормального содержания (анеуплоидия) в сторону уменьшения (гипоплоидия) или чаще – в сторону увеличения (гиперплоидия) (Никитин И.С., 2016). Если на ДНК-гистограмме отмечался один пик, который соответствовал нормальному содержанию ДНК в ядрах, то опухоль можно считать диплоидной. А вот если на ДНК-гистограмме отмечался пик, который отличался от диплоидного, то опухоль считали анеуплоидной (Новикова И.А. и соавт., 2014; Шатова Ю.С. и соавт., 2016). При изучении некоторых ДНК-цитометрических параметров опухолей молочной железы в клинических группах выявлена значительная доля анеуплоидных опухолей с тенденцией к увеличению их в 1-й и 3-й группах. Так, в первой BRCA+ группе доля анеуплоидных опухолей составила 63%, где 17 из 27 опухолей молочной железы характеризовались уровнем ДНК, который отличался от 1,0, во второй BRCA- группе – 48,5% (16 из 33 опухолей), а в третьей группе – 60%, где 18 из 30 опухолей были анеуплоидными (р0,1).
Анализируя ИДНК анеуплоидных опухолей молочной железы во всех клинических группах, можно отметить, что опухоли молочной железы с ИДНК меньше 1,0 вообще не встречались ни в одной из групп. У больных первой группы ИДНК в опухоли был 1,07–1,76, при среднем показатели 1,5±0,2, во второй группе – 1,2–2, при среднем показателе ИДНК немного выше – 1,7±0,07, а в третьей группе встретились многоклоновые опухоли с ИДНК 1,06–3,14, при среднем значении 1,8±0,1. При этом достоверных различий в разнице показателей ИДНК не было ни в одной группе. Кроме того, во всех исследуемых группах выявлено преобладание опухолей с ИНДК свыше 1,5, где их доля в 1 группе составила 64,7% (11 из 17), во 2-й – 75% (12 из 16), в 3-й – 66,6% (где ИНДК от 1,5 до 2 выявлен у 8 из 18 опухолей, свыше 2 – у 4 из 18).
Анализ среднего содержания анеуплоидных клеток в опухолях исследуемых групп выявил снижение доли анеуплоидных клеток в 1 и 2 группах (в 1,7 и 1,8 раза) в сравнении с 3 группой спорадическим РМЖ (p0,05). При этом достоверных отличий в среднем содержании анеуплоидных клеток в опухоли между 1 и 2 группами клинически НРМЖ BRCA+ и BRCA- не выявлено (таблица 7.1)
В норме для конкретной популяции клеток длительность периодов S, G2 и M относительно постоянна. Основные колебания в продолжительности клеточного цикла зависят от длительности фазы G1. Биохимические процессы, происходящие в клетках при переходе из фазы покоя в клеточный цикл, хорошо изучены – это повышение уровня матричной активности хроматина, активация синтеза рибосомных РНК и белка, в том числе негистоновых белков хроматина, нарастание объема фонда предшественников ДНК, увеличение активности ряда ферментов – тимидинкиназы, ТМФ-редуктазы, рибонуклеотидредуктазы и др. Наблюдаются также структурные и функциональные изменения в клеточных мембранах (Шмаров Д.А. и соавт., 2004).
В нашем исследовании проведен анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла диплоидных и анеуплоидных опухолей молочной железы вовсех клинических группах.
При анализе клеточного цикла диплоидных опухолей молочной железы в исследуемых группах определено, что основная масса клеток опухоли находилась в G0/1-фазе клеточного цикла. При этом максимальное содержание клеток в фазе G0/1 отмечено в 1 группе, составив 95,1±2,7%, что имело статистически достоверные различия только от 2 группы. Статистически значимых различий в содержании клеток в фазе G0/1 между 2 и 3 группами не выявлено. Данные, которые мы получили, представлены в таблице 7.2.
Как видно из таблицы 7.2, выявлены достоверно значимые различия в содержании клеток в G2+M-фаза клеточного цикла диплоидных опухолей исследуемых групп, а именно: 1 группа характеризовалась увеличением в 7,5 и 1,3 раза доли клеток в G2+M-фазе в сравнении со 2 и 3 группами соответственно (p0,05). Наименьшие достоверно значимые различия данного показателя от 3 группы отмечены во 2 группе (p0,05).
Неконтролируемый злокачественный рост с различной скоростью клеточной пролиферации является одной из важнейших характеристик опухолей. Некоторые авторы считают, что опухоли с более высоким содержанием клеток в S-фазе клеточного цикла обычно свидетельствуют о неблагоприятном прогнозе и плохо поддаются химиотерапии (Бычков М.Б., 1996). Вместе с тем, большинство исследователей считает, что связь между уровнем пролиферации, терапевтическим ответом и выживаемостью имеет гораздо более сложный характер. Причины возникающих несоответствий заключаются в том, что большинство противоопухолевых препаратов эффективно действуют именно на активно пролиферирующие клетки. Опухолевые клетки, находящиеся в G0 стадии и не поддающиеся химиотерапии, могут в последующем становиться источником злокачественных клонов. Помимо увеличения пролиферации, рост опухоли определяется также уменьшением дифференцировки клеток и процессами их элиминации (гибели, потери клеток).
Скорость пролиферации клеток – это важный показатель, который характеризует биологическое поведение опухоли и определяется по доле клеток в S-фазе. Минимальная скорость пролиферации диплоидных опухолей молочной железы в прводимом исследовании отмечена в 1 группе. Так, доля клеток в фазе синтеза в 1-й клинической группе была в 3,5 раза меньше, чем во 2-й группе, и в 1,9 раза меньше, чем в 3-й группе. Разница показателей достоверна по отношению ко 2 группе (p0,05). Достоверно значимых различий в показателе 2 и 3 группы не выявлено, хотя отмечена тенденция к увеличению его значения во 2 группе.
На рисунках 7.1–7.3 представлены гистограммы распределения опухолевых клеток диплоидных опухолей молочной железы исследуемых групп.