Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 15
1.1. Морфологические и молекулярно-генетические формы рака молочной железы 15
1.2. Химиотерапия как один из методов лечения рака молочной железы 19
1.3. Феномен множественной лекарственной устойчивости 22
1.4. Семейство ABC-транспортеров: структура, функции и роль в развитии феномена множественной лекарственной устойчивости
1.4.1. Роль подсемейства ABCB в возникновении резистентности к химиотерапии 26
1.4.2. Роль семейства ABCC в возникновении резистентности к химиотерапии 30
1.4.3. Роль семейства ABCG в возникновении резистентности к химиотерапии 36
1.5. Роль активации ферментов системы глутатиона в возникновении феномена множественной лекарственной устойчивости 39
1.6. Связь между изменениями генов, контролирующих апоптоз, и возникновением феномена множественной лекарственной устойчивости
1.6.1. Мутация гена ТР53 и развитие феномена множественной лекарственной устойчивости 42
1.6.2. Семейство белков Bcl и их влияние на возникновение резистентности к химиотерапии 44
1.7. Заключение 46
ГЛАВА 2. Материалы и методы 47
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 62
3.1. Влияние клинико-морфологических параметров на эффективность проводимой неоадъювантной химиотерапии у больных инвазивным раком молочной железы 62
3.2. Изучение параметров пролиферативной активности и апоптоза на эффективность НАХТ у больных инвазивным раком молочной железы 71
3.3. Оценка влияния экспрессии белков лекарственной устойчивости на эффективность НАХТ у больных инвазивным раком молочной железы 75
3.4. Анализ эффективности НАХТ в зависимости от сочетания различных систем химиорезистентности у больных инвазивным раком молочной железы. Создание математической модели прогнозирования полной морфологической регрессии 83
Обсуждение результатов 91
Выводы 104
Практические рекомендации 106
Список литературы
- Семейство ABC-транспортеров: структура, функции и роль в развитии феномена множественной лекарственной устойчивости
- Семейство белков Bcl и их влияние на возникновение резистентности к химиотерапии
- Изучение параметров пролиферативной активности и апоптоза на эффективность НАХТ у больных инвазивным раком молочной железы
- Анализ эффективности НАХТ в зависимости от сочетания различных систем химиорезистентности у больных инвазивным раком молочной железы. Создание математической модели прогнозирования полной морфологической регрессии
Семейство ABC-транспортеров: структура, функции и роль в развитии феномена множественной лекарственной устойчивости
Современные подходы лечения РМЖ отличаются мультимодальностью и комплексностью, в основе лечения лежит использование комбинации местной и общей терапии. К местному лечению относится использование лучевой терапии и оперативного лечения. Общая терапия включает комбинированное или изолированное использование следующих компонентов: химиотерапии, гормональной терапии, лечении моноклональными антителами и бисфосфонатами [21, 24, 25, 28, 65, 69, 91, 286]. Химиотерапия в последние годы является одним из ведущих методов лечения онкологических заболеваний, в том числе и при раке молочной железы [21, 24, 25, 65, 69, 91, 210, 286]. Особое значение имеет неоадъювантная химиотерапия, поскольку её проведение позволяет не только уменьшить размер опухоли для облегчения проведения хирургического лечения, но и определить чувствительность к той или иной схеме химиотерапии [28, 65, 98, 106, 210, 286]. Адъювантная химиотерапия направлена на исключение рецидивирования опухоли и развития отдаленных метастазов [120, 184, 286]. Наиболее эффективными при раке молочной железы являются следующие группы химиотерапевтических препаратов: алкилирующие агенты (широко используется циклофосфамид), антрациклины (доксорубицин, эпирубицин), антиметаболиты (5-фторурацил, метотрексат), таксаны (Таксол или паклитаксел, Таксотер или доцетаксел, интаксел), реже используются винкаалкалоиды (винкристин, винбластин, навельбин) и препараты платины (цисплатин, оксалиплатин) [24, 25, 69, 91, 106, 120, 135, 184, 204, 267].
В течение многих лет рекомендации по назначению химиотерапии основывались на классических анатомических и патологических факторах, таких как размер опухоли, наличие метастатического поражения лимфатических узлов, степень злокачественности новообразования и др. [120, 184].
В настоящее время используются в основном поликомпонентные схемы химиотерапии, для лечения рака молочной железы наиболее актуальны следующие комбинации, применяющиеся как для неоадъювантного, так и адъювантного лечения: AC – сочетание доксорубицина и циклофосфамида, AC-P – AC плюс паклитаксел, AC-D – AC плюс доцетаксел, EC – сочетание эпирубицина и циклофосфамида, FAC – 5-фторурацил, доксорубицин и циклофосфамид, FEC – 5-фторурацил, эпирубицин, циклофосфамид, CMF – сочетание циклофосфамида, метотрексата и 5-фротурацила и часто применяющаяся в последние годы схема CAX – сочетание циклофосфана, адриамицина и капецитабина (кселоды) [21, 24, 25, 69, 91, 106, 120, 135, 184, 204, 267].
Классические факторы зачастую не дают полного представления о целесообразности проведения химиотерапии. Некоторые женщины не нуждаются в лечении, либо потому что имеют низкий риск рецидива, либо биология их опухоли такова, что делает ее менее чувствительной к химиотерапии и больше подходит для гормональной терапии [45]. В настоящее время актуальность проведения химиотерапии, как неадъювантной, так и адъювантной, основывается на определении молекулярно-генетического подтипа опухоли, т.е. изучении рецепторного статуса и экспрессии HER2/neu, Ki-67 в ткани злокачественного новообразования [2, 3, 59, 98, 134, 202, 216, 253, 287].
При люминальном А типе отмечается высокая чувствительность к доксирубицину, паклитакселу, фторурацилу, циклофосфамиду [18, 77, 98, 201]. Такие типы как люминальный В, трижды-негативный, чувствительны к стандартным химиотерапевтическим схемам, включая антрациклин- и таксан-содержащие [18, 70, 98]. При HER2-позитивном типе предпочтение отдается лечению моноклональными антителами, а именно трастузумабу, так как при гиперэкспрессии HER2/neu развивается устойчивость опухоли к ряду цитостатиков, в связи с тем, что данный протеин влияет на фосфорилирование апоптотических белков [38, 59, 98, 217, 253]. Базолюминальные опухоли в своей структуре имеют клоны клеток, по-разному реагирующие на проводимую терапию, что необходимо учитывать при назначении химиопрепаратов [157].
Пролиферативная активность опухоли, определяемая на основании экспрессии маркера Ki-67, также влияет на чувствительность к химиотерапии. Имеются данные ряда клинических исследований, свидетельствующие о том, что высокие показатели различных маркеров опухолевой пролиферации в сочетании с III степенью злокачественности ассоциированы с большей вероятностью полного регресса опухоли в ответ на химиотерапию [98, 206]. При этом было отмечено, что опухоли с высоким митотическим индексом и показателем Ki-67 часто ассоциированы с мутацией гена р53, что сопровождалось низким эффектом неоадъювантной химиотерапии и ухудшением отдаленных результатов лечения [3, 147, 172]. Таким образом, подход к назначению химиотерапии, учитывающий совокупность классических прогностических факторов и молекулярно-генетического типирования, позволяет избежать ненужных побочных эффектов и персонализировать схему лечения для каждого конкретного случая. В химиотерапии у пациенток с распространенным раком молочной железы используются комбинации с антрациклинами и таксанами, при метастатическом поражении костей эффективна комбинация ингибиторов ароматазы (антиэстрогеновых препаратов) с доксорубицином и со схемой, содержащей бисфосфонаты, так как такое сочетание снижает риск патологических переломов, способствует репаративным процессам в костях и уменьшает болевой синдром. У больных с метастазами РМЖ в головной мозг показаны к применению алкилирующие производные нитрозомочевины: ломустин, кармустин, нидран [120, 286].
Семейство белков Bcl и их влияние на возникновение резистентности к химиотерапии
Инвазивная карцинома неспецифического типа молочной железы. Строма в опухоли выражена слабо (1 балл), резко выраженная воспалительная инфильтрация (3 балла). Окраска гематоксилином и эозином (ув. х200) Иммуногистохимическое исследование осуществлялось по стандартной методике. Применялись антитела фирмы «Dako» к рецепторам эстрогена (клон 1D5, RTU, мышиные), к рецепторам прогестерона (клон PgR636, RTU, мышиные), к онкопротеину c–erbB-2 (HER2/neu статус) (рабочее разведение 1:500, кроличьи), к Ki-67 (клон MIB-1, RTU, мышиные); фирмы «Novocastra» к р53 (клон CM1, рабочее разведение 1:150), к bcl-2 (клон bcl2/100/D5, рабочее разведение 1:80), к глутатион-S-трансферазе (клон NCL-GSTpi-438, рабочее разведение 1:400); фирмы «Abcam» к P-гликопротеину (клон JSB-1, рабочее разведение 1:40), к MRP1 (клон MRPr1, рабочее разведение 1:20), к MRP2 (клон M2 III-6, рабочее разведение 1:200), к BCRP (клон BXP-21, рабочее разведение 1:20).
Оценка экспрессии рецепторов к половым гормонам проводилась количественным методом гисто-счета (Histo-Score). При этом подсчитывался процент позитивных клеток и показатель экспрессии в баллах (Петров С.В., 2012). HER2/neu негативными считались случаи с отсутствием окрашивания или слабым прерывистым мембранным окрашиванием. К HER2/neu позитивным относили случаи с интенсивным непрерывным мембранным окрашиванием более чем в 30% клеток. Случаи с умеренным непрерывным мембранным окрашиванием более чем в 30% клеток или интенсивным непрерывным мембранным окрашиванием менее чем в 10% клеток, требующие выявления наличия амплификации гена HER2/neu методом FISH или CICH/SISH, не включали в исследование.
Экспрессию р53 (рис. 5), bcl-2 (рис.6), Ki-67 (рис.7) оценивали в процентном содержании положительно окрашенных клеток в каждом варианте структур паренхиматозного компонента первичной опухоли. Оценивалось отсутствие или наличие экспрессии bcl-2, р53 в клетках воспалительного инфильтрата и стромы опухоли (0 баллов – отсутствие; 1 балл – наличие экспрессии).
Экспрессия bcl-2 в клетках инвазивной карциномы молочной железы и клетках воспалительного инфильтрата. ИГХ-реакция. Окраска диаминобензидином и гематоксилином (ув. х200) На основании сочетания экспрессии рецепторов к эстрогенам, прогестерону, HER2/neu статуса и Ki-67 определялись 4 основных молекулярно-генетических типа: люминальный А (позитивная экспрессия рецепторов к эстрогенам и/или к прогестерону, негативный HER2/neu статус, экспрессия Ki-67 20%), люминальный В (позитивная экспрессия рецепторов к эстрогенам и/или к прогестерону, негативный HER2/neu статус, экспрессия Ki-67 20%), трижды-негативный (негативная экспрессия рецепторов к эстрогенам, к прогестерону, негативный HER2/neu статус), тип с гиперэкспрессией HER2/neu (негативная экспрессия рецепторов к эстрогенам, к прогестерону, позитивный HER2/neu статус). В исследование были включены пациентки с трижды-негативным раком молочной железы – 65 (71%), и с люминальным В типом – 26 больных (29%). Экспрессия белков лекарственной устойчивости: P-гликопротеина (рис. 8), MRP1 (рис. 9), MRP2 (рис. 10), BCRP (рис 11), и глутатион-S-трансферы (рис. 12) оценивалась в процентном содержании положительно окрашенных клеток в каждом варианте структур паренхиматозного компонента первичной опухоли (в 10 полях зрения на 1000 клеток при увеличении х400).
Обработка полученных данных выполнялась с использованием пакета программ «Statistica 10.0». При анализе полученных данных были применены методы описательной статистики, дисперсионный анализ (среднее значение М, стандартное отклонение ). Для расчета достоверности различий применялись непараметрический критерий 2, использовался корреляционно регрессионный анализ по Спирмену (коэффициент ранговой корреляции r), логистический регрессионный анализ. Обсуждаются результаты с достоверностью различий при р 0,05 и с тенденцией различий при р 0,1.
Изучение параметров пролиферативной активности и апоптоза на эффективность НАХТ у больных инвазивным раком молочной железы
Проведенное исследование позволило выявить взаимосвязь ряда клинико-морфологических и молекулярно-биологических параметров первичного очага при инвазивном раке молочной железы, связанных с ответом опухоли на проводимую неоадъювантную химиотерапию. В соответствии с имеющимися рекомендациями для проведения неоадъювантной и адъювантной химиотерапии при лечении рака молочной железы препаратами выбора являются таксаны, но также широко применяется классическая схема FAC. При лечении местно распространённого инвазивного РМЖ предпочтение в выборе отдается схеме CAX, как современной методике, включающей в себя капецитабин [21, 23, 24, 69, 91, 106, 120, 135, 184, 190, 204, 267]. Согласно результатам нашего исследования, также было показано, что лучший ответ на проведение НАХТ у больных с инвазивной карциномой молочной железы, в виде достижения полных морфологических регрессий, был сопряжен с использованием схемы химиотерапии CAX. Данное обстоятельство, вероятнее всего, связано с тем, что в исследовании преобладали пациентки с трижды-негативным молекулярно-генетическим подтипом рака молочной железы (65 из 91), который, согласно имеющимся данным, чувствителен к капецитабину [69, 190, 204].
Общеизвестным фактом является то, что ответ опухоли на проводимое лечение зависит от количества курсов полихимиотерапии [69, 106, 120, 135, 204, 267]. Полученные в нашем исследовании результаты также демонстрируют подобную зависимость. Было показано, что наибольшая частота полной и частичной морфологической регрессии новообразования наблюдалась в группе пациенток, которые получили 4 курса НАХТ, соответственно: 80% и 55%.
Помимо выбранной схемы полихимиотерапии и количества проведенных курсов, клинико-морфологические характеристики и молекулярно-биологические параметры первичной опухоли могут оказывать существенное влияние на эффект проводимого лечения. Результаты нашего исследования показали, что в случаях с трижды-негативным молекулярно-генетическим подтипом РМЖ достижение полной регрессии опухоли чаще было отмечено в возрастной группе пациенток до 40 лет, при этом частичная регрессия – у пациенток в возрасте старше 50 лет. Подобного рода закономерности отмечены рядом авторов и могут быть объяснены тем, что для данного молекулярно-генетического подтипа характерно развитие опухоли в более раннем возрасте и высокая чувствительность к НАХТ [69, 190, 204]. Нельзя исключить, что полученные результаты, являются отражением патогенетических различий в проявлении и течение рака молочной железы у пациенток разных возрастных групп [3, 5, 7,16, 130, 287].
Также следует подчеркнуть, что была показана связь чувствительности опухоли с характером роста новообразования. У пациенток с мультицентрическим характером роста была отмечена тенденция к меньшей частоте случаев с полной морфологической регрессией и большая частота случаев с прогрессированием, но при этом у них чаще наблюдается частичная регрессия первичной опухоли по сравнению с пациентками, рост опухоли у которых был представлен только одним узлом. Вероятнее всего полученные данные дополняют сведения об имеющихся клинико-морфологических различиях рака молочной железы в зависимости от характера роста [7] и требуют дальнейшего изучения с позиций оценки эффективности проводимого лечения.
По данным литературы имеются сведения о связи клинико-морфологических характеристик опухоли с эффективностью химиотерапии. Так, ряд авторов указывает, что размер опухоли и состояние регионарных лимфатических узлов ассоциированы с эффективностью НАХТ у пациенток с раком молочной железы [218, 256]. Zhang B с соавторами также показали, что диаметр опухоли менее 3 см связан с положительным ответом на предоперационное лечение [272]. В нашем исследовании не было обнаружено существенной связи эффекта НАХТ от менструальной функций, размера первичного очага, количества пораженных метастазами лимфатических узлов. Одной из поставленных задач нашего исследования явился анализ сопряженности ответа НАХТ с гистологическим строением первичной опухоли, поскольку согласно данным литературы имеются контрадикторные сведения о взаимосвязи гистологических характеристик новообразования с эффективностью неоадъювантной химиотерапии. Так, в исследованиях группы авторов Rouzier R. et al., показано, что такие параметры как гистологический тип опухоли, степень злокачественности слабо ассоциированы с эффективностью НАХТ [218, 256]. В то же время имеются сведения о том, что третья и вторая степени злокачественности инфильтративного компонента ИКНТ взаимосвязаны с положительным ответом опухоли на проводимое лечение [98, 206]. Полученные нами данные показывают, что чувствительность к химиотерапии сопряжена с отмеченным параметром опухоли. Поскольку в нашем исследовании большая частота полной морфологической регрессии при проведении НАХТ наблюдалась у пациенток с III степенью злокачественности инвазивной карциномы неспецифического типа. Важно отметить, что обнаруженная зависимость была характерна как для трижды-негативного, так и для люминального В подтипов опухоли.
Детальный анализ морфологического строения инфильтративного компонента был проведен у пациенток с инфильтративной карциномой неспецифического типа, которая преобладала среди всех гистологических вариантов РМЖ. Впервые было обнаружено, что при инвазивной карциноме неспецифического типа отсутствие в инфильтративном компоненте новообразования дискретных опухолевых клеток ассоциировано с большей частотой полной морфологической регрессией первичной опухоли. Следует подчеркнуть, что указанная зависимость наблюдалась у пациенток с трижды-негативным и люминальным B подтипами рака молочной железы. Имеющиеся на сегодняшний день сведения в литературе в отношении морфологического строения ИКНТ указывают на то, что преобладание или наличие дискретных групп клеток в инфильтративном компоненте, может отражать низкую степень дифференцировки опухоли, соответственно более высокую степень злокачественности [5, 9, 51]. Полученные нами данные о связи дискретных опухолевых клеток и III степени злокачественности опухоли с эффектом НАХТ свидетельствуют о независимости указанных гистологических параметров в отношении чувствительности к химиотерапии у больных раком молочной железы.
В нашем исследовании было показано, что III и IV степень лечебного патоморфоза в первичной опухоли после проведения неоадъювантной химиотерапии наблюдается при изначально высокой пролиферативной активности клеток инвазивной карциномы у пациенток с трижды-негативным и люминальным B подтипами. Ряд исследователей указывают, что выраженная пролиферативная активность опухолевых клеток в сочетании с III степенью злокачественности ассоциированы с большей вероятностью полного регресса опухоли в ответ на химиотерапию [3, 98, 206]. Следует отметить, что данные результаты представлены в независимости от молекулярного подтипа новообразования.
Анализ эффективности НАХТ в зависимости от сочетания различных систем химиорезистентности у больных инвазивным раком молочной железы. Создание математической модели прогнозирования полной морфологической регрессии
Поскольку данные нашего исследования, показывают, что чувствительность опухоли к НАХТ зависела от степени воспалительной инфильтрации в строме, нами была проанализирована экспрессия параметров апоптоза и белков лекарственной устойчивости в клетках воспалительного инфильтрата у пациенток с различными эффектами НАХТ и степенью лечебного патоморфоза. Впервые нами была выявлена связь эффективности НАХТ с наличием позитивной экспрессии Pgp, MRP2 и отсутствием экспрессии bcl-2 в клетках воспалительного инфильтрата. Особенно четко данная зависимость прослеживалась для ABCC2 (MRP2): во всех случаях прогрессирования заболевания отмечалась позитивная экспрессия маркера. В отношении маркера апоптоза bcl-2 было обнаружено, что полная морфологическая регрессия первичной опухоли чаще наблюдалась при негативной экспрессии bcl-2 в клетках воспалительного инфильтрата, в то время как стабилизация и прогрессирование опухоли отмечалось при наличии bcl-2-позитивных иммунокомпетентных клеток. Указанные данные получены впервые и свидетельствуют о патогенетической связи молекулярно-биологических характеристик клеток воспалительного инфильтрата с чувствительностью к химиотерапии у больных РМЖ. Связи эффективности НАХТ с наличием экспрессии BCRP в клетках воспалительного инфильтрата не обнаружено. Однако была получена существенная корреляция между экспрессией BCRP в клетках воспалительного инфильтрата и экспрессией bcl-2 в данных клетках. Представляло интерес изучение сочетания различных систем, участвующих в возникновении лекарственной устойчивости опухоли. В нашем исследовании было показано, что эффективность проведения химиотерапии не сопряжена с количеством белков ABC-транспортеров, экспрессируемых в опухоли. Впервые было показано, что число активированных систем защиты опухолевой клетки не коррелировало с основными клинико-морфологическими параметрами такими как: возраст пациенток (p=0,26); пролиферативная активность в опухоли (p=0,45); выраженность воспалительной инфильтрации (p=0,38); степень злокачественности опухоли при ИКНТ (p=0,5). Полученные результаты возможно свидетельствую о том, что количество активированных систем защиты от химиотерапевтического воздействия в опухоли является ее изначальной биологический характеристикой. Не исключено, что количество активированных систем защиты в клетках инвазивной карциномы молочной железы может изменяться в процессе лечения. Обнаруженные данные требуют дальнейшего изучения.
Тем не менее, нами было обнаружено, что имеет значение сочетание белков различных систем, участвующих как в инактивации химиотерапевтических препаратов, так и отражающих молекулярно биологические характеристики самих опухолевых клеток. Нами было показано, что наибольшее значение при оценке чувствительности опухоли имеет состояние системы апоптоза, оцененное по экспрессии онкопротеина p53 и белков ABC-транспортеров. Большая частота развития полной регрессии опухоли по шкале RECIST была сопряжена с отсутствием одновременной гиперэкспрессии p53 и экспрессии белков ABC-транспортеров. Полученные результаты согласуются с экспериментальными данными об участии белков лекарственной устойчивости, в частности ABCB1, в регуляции апоптоза опухолевых клеток [71, 72, 105].
Результатом проведённого клинико-морфологического анализа явилось построение математических моделей, позволяющих прогнозировать вероятность полной морфологической регрессии опухоли при проведении НАХТ у пациенток в зависимости от молекулярно-генетического подтипа новообразования. Так, для пациенток с трижды-негативным подтипом новообразования разработана математическая модель, чувствительность которой составила 78%, специфичность – 91%. Из перечня анализируемых параметров в качестве независимых признаков в модель вошли: степень злокачественности опухоли, присутствие в инфильтративном компоненте дискретных групп клеток, мембранная экспрессия MRP2 в опухоли, экспрессия в клетках воспалительного инфильтрата P–гликопротеина, BCRP, MRP1 и MRP2, присутствие в воспалительном инфильтрате bcl-2-позитивных клеток, выраженность мембранной экспрессии BCRP в опухоли. Для пациенток с опухолями молочной железы, относящимися к люминальному B подтипу, разработана математическая модель включающая в себя следующие параметры: степень злокачественности, присутствие в инфильтративном компоненте опухоли дискретных групп клеток, присутствие в воспалительном инфильтрате bcl-2-позитивных клеток, наличие позитивной экспрессии P-гликопротеина в клетках воспалительного инфильтрата, наличие мембранной экспрессии в опухолевых клетках MRP2. Чувствительность модели составляет 100%, специфичность – 100%.
Таким образом, по результатам проведенного исследования были выделены клинико-морфологические и молекулярно-биологические параметры первичной опухоли, позволяющие с высокой степенью вероятности прогнозировать достижение полной регрессии новообразования при проведении неоадъювантной химиотерапии у пациенток с инвазивной карциномой молочной железы при трижды-негативном и люминальном B молекулярно-генетическом подтипе.