Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Патогенез, иммуноморфологическая характеристика и механизмы опухолевой прогрессии лимфом (обзор литературы) 11
1.1. Патогенез и иммуноморфологическая характеристика лимфом 13
1.2. Апоптоз и механизмы опухолевой прогрессии лимфом 32
1.3. Применение метода проточной цитометрии для прогнозирования течения опухолевого процесса при некоторых злокачественных новообразованиях 42
ГЛАВА 2. Клиническая характеристика материала и методов исследования 46
2.1. Общая оценка клинических данных 46
2.2. Методы исследования 59
2.3. Общие классификационные подходы, критерии прогноза 66
2.4. Методы статистической обработки данных 72
ГЛАВА 3. Цитологическая и функциональная характеристика гемопоэтических клеток, особенности их апоптоза и пролиферативной активности при лимфомах 75
3.1. Результаты цитологического исследования костного мозга больных лимфомами 75
3.2. Исследование плоидности мононуклеаров костного мозга больных лимфомами методом проточной цитометрии 84
3.3. Характеристика параметров клеточного цикла мононуклеаров костного мозга больных лимфомами 91
3.4. Сравнительная характеристика результатов проточной цитометрии мононуклеаров костного мозга больных I и II групп 96
3.5. Медикаментозная коррекция апоптотических процессов в культуре клеток костного мозга больных лимфомами 108
ГЛАВА 4. Корреляционно-регрессионный анализ в прогнозировании течения лимфом 115
4.1. Корреляционный анализ параметров апоптотической и пролиферативной активности, кинетики клеточного цикла мононуклеаров костного мозга больных лимфомами 115
4.2. Регрессионный анализ и оценка выживаемости больных лимфомами 121
4.3. Оценка риска развития прогрессирования заболевания у больных первичными лимфомами с поражением костного мозга на основе модели логистической регрессии 136
Заключение 139
Выводы 146
Практические рекомендации 147
Список литературы
- Применение метода проточной цитометрии для прогнозирования течения опухолевого процесса при некоторых злокачественных новообразованиях
- Общие классификационные подходы, критерии прогноза
- Характеристика параметров клеточного цикла мононуклеаров костного мозга больных лимфомами
- Регрессионный анализ и оценка выживаемости больных лимфомами
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Понятие лимфома объединяет широкий спектр новообразований, характеризующихся злокачественной пролиферацией лимфоидных клеток, и различающихся по клинико-морфологическим и молекулярно-биологическим характеристикам.
За последние десятилетие заболеваемость злокачественными лимфомами имеет неуклонную тенденцию к росту во всем мире. В России с 2003 по 2013 года уровень заболеваемости вырос на 20,93% (Каприн А.Д., Старинский В.В., Петрова Г.В. 2014). В 2013 году заболеваемость лимфомой Ходжкина (ЛХ) в России составила 2,1 случая на 100 тыс. населения в год (3 164 впервые диагностированных больных), 2,2 – в странах Европейского союза и 2,8 – в США. Заболеваемость различными видами неходжкинских лимфом (НХЛ) колебалась в пределах 4-7 на 100 тыс. населения в год (Поддубная И.В., Савченко В.Г., 2013).
Одно из ведущих направлений поиска молекулярно-биологических критериев прогностической оценки опухолевой прогрессии тесно связано с учением об апоптозе. Так, например, уровень экспрессии Bcl2 может в значительной мере предопределять высоко резистентный или высокочувствительный к терапии фенотип, а маркер пролиферативной активности Ki67 - злокачественный потенциал образования.
С другой стороны, поиск дополнительных критериев прогнозирования
опухолевой прогрессии неразрывно связан с изучением жизненного цикла клетки
(КЦ). Связь между плоидностью, процентным содержанием клеток
пролиферативного пула (S+G2M) и риском прогрессирования или рецидива заболевания, остается не в полной мере, доказанной (Богатырев В.Н., 1991; Chassevent A., Jourdan M.L., Romain S., et al., 2001; Шмаров Д.А., 1997). Данных об изучении плоидности и кинетики КЦ клеток гемопоэтической ткани при гемобластозах крайне мало. Известно, что при исследовании КЦ костного мозга (КМ) практически здоровых лиц кинетические показатели гемопоэтических клеток имели достаточно высокую устойчивость, что свидетельствовало о стабильности процессов нормального кроветворения. Исследование КЦ КМ,
4 проведенное больным различными видами анемий, миелодиспластическим синдромом и острым лейкозом выявило существенный разброс индивидуальных параметров КЦ, что отражало, прежде всего, неэффективную природу гемопоэза и доказало, что параметры плоидности и кинетики КЦ гемопоэтической ткани могут служить маркерами степени злокачественности заболевания, а также иметь прогностическое значение для оценки общей выживаемости больных (Шмаров Д.А., Кучма Ю.М., Козинец Г.И., 1997; Span L.F., Dar S.E., Shetty V., et al., 1998; Ружинская Е.Э., Исакова Л.М., Третьяк Н.Н., 2007).
Противоречивые данные о прогностической роли показателей плоидности и кинетики КЦ, ограниченность информации в литературе об изучении этих показателей у больных лимфомами обусловливают актуальность проведенного нами научного анализа.
Цель исследования: определить значение некоторых
иммуноморфологических и биологических факторов в прогрессии лимфом.
Задачи исследования
1. Провести комплексную сравнительную оценку цитологических и
иммуноморфологических параметров мононуклеаров пораженного и интактного
костного мозга больных лимфомами.
2. Провести корреляционно-регрессионный анализ основных клинико –
гематологических параметров, параметров апоптотической активности,
плоидности и кинетики клеточного цикла мононуклеаров пораженного и
интактного костного мозга больных лимфомами;
3. Изучить в условиях in vitro показатели спонтанного и индуцированного
цитостатиками, моноклональными антителами и иммунопрепаратами апоптоза
(некроза) мононуклеаров пораженного и интактного костного мозга больных
первичными и прогрессирующими лимфомами;
4. Изучить в условиях in vitro влияние препарата пентоксифиллин на
мононуклеары костного мозга больных лимфомами;
5 5. Выявить предикторы и возможные патогенетические механизмы прогрессирования лимфом путем разработки прогностического алгоритма на основе методов логистической регрессии.
Научная новизна работы.
Полученные данные дополняют известные сведения о молекулярно-клеточных механизмах формирования опухолевой прогрессии, химиорезистентности и способах ее преодоления. В диссертационной работе впервые:
-
Проведена комплексная статистическая оценка цитологических и иммуноморфологических параметров мононуклеаров пораженного и интактного костного мозга больных злокачественными лимфомами.
-
Изучена корреляционная зависимость параметров апоптотической активности, плоидности, кинетики клеточного цикла мононуклеаров пораженного и интактного костного мозга больных лимфомами от распространенности патологического процесса, особенностей клинического течения, развития прогрессирования или рецидива заболевания.
-
Проведена оценка влияния препарата пентоксифиллин на мононуклеарыкостного мозга больных лимфомами.
-
Разработан алгоритм прогнозирования риска развития прогрессирования патологического процесса, основанная на многостороннем статистическом анализе показателей апоптотической активности, плоидности и кинетики клеточного цикла мононуклеаров костного мозга с опухолевой экспансией больных лимфомами.
-
Подана заявка на изобретение «Способ прогнозирования течения злокачественных лимфом» (№ 2012108895/15(013334), приоритет от 07.03.2012).
Практическая значимость работы. Разработанный в ходе исследования алгоритм может быть использован в рутинной практике для прогнозирования и профилактики прогрессирования заболевания при первичных лимфомах с поражением костного мозга.
6 Внедрение результатов исследований в практику. Данные, полученные в результате исследования, используются в работе отделения гематологии ФГБУ «РНИОИ» Минздрава России.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Уровень экспрессии маркеров апоптотической и пролиферативной активности, показатели плоидности и кинетики клеточного цикла мононуклеаров костного мозга больных лимфомами с лейкемизацией являются универсальными дополнительными прогностическими критериями степени злокачественности заболевания.
-
Препарат пентоксифиллин проявляет апоптогенные свойства в культуре клеток пораженного опухолью костного мозга первичных больных В-клеточными неходжкинскими лимфомами.
Апробация работы. Апробация диссертации состоялась на заседании Ученого Совета ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» МЗ РФ 2 июля 2015 года
Соответствие диссертации паспорту специальности
Основные научные положения и выводы, описанные в диссертационной работе, соответствуют паспорту специальности 14.01.12 - онкология, пункту 2 области исследования (изучение этиологии и патогенеза злокачественных опухолей, основанные на достижениях ряда естественных наук (генетики, молекулярной биологии, морфологии, иммунологии, биохимии и других)).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них 5 в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 179 страницах, состоит из введения, обзора литературы, главы характеристики материала и методов исследования, двух глав собственных результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы, включающего 71 отечественный и 244 зарубежных источника, иллюстрирована 46 таблицами и 50 рисунками.
Применение метода проточной цитометрии для прогнозирования течения опухолевого процесса при некоторых злокачественных новообразованиях
Лимфомы возникают из B-клеток примерно в 85% случаев, в то время как оставшиеся 15% являются производными от Т-клеточной линии. Ключевой концепцией понимания генеза лимфом является выяснение отношения между этими опухолями и уникальными изменениями ДНК, которые происходят в нормальных лимфоцитах для обеспечения производства антител в В-клетках и кодирования Т-клеточных рецепторов Т-клеток. (Liu M. et al. 2008, Cheng H.L. et al. 2009., Pasqualucci L. et al. 2011).
B-лимфоциты происходят из плюрипотентных стволовых клеток в костном мозге, где предшественники В-клеток сначала собирают локус тяжелой цепи своих иммуноглобулинов, затем локусы легких цепей посредством специфического процесса расщепления и воссоединения известного под названием V(D)J рекомбинация (Bassing C.H., Swat W., Alt F.W. 2002, Gatto D.., Brink R. 2010). Клетки, не экспрессирующие функциональный рецептор антигена элиминируются в пределах костного мозга, в то время как B-клетки предшественницы, которые успешно перестроили гены антител, отбираются для переноса в периферические лимфоидные органы (Rajewsky K. 1996). В большинстве B-клетки в последующем своем созревании связаны с гистологической структурой именуемой зародышевым центром, высоко специализированной микросредой, которая способствует встрече наивных В -клеток с чужеродным антигеном, вместе с сигналами от CD4+ T-лимфоцитов и антиген - презентирующих клеток (Klein U, Dalla-Favera R. 2008).
Развитие зародышевого центра происходит в два этапа. Первоначально клетки поступают в темную зону зародышевого центра, которая состоит из быстро пролиферирующих центробластов со временем удвоения менее 12 часов. В этой фазе центробласты изменяют различные регионы своих Ig генов в процессе соматических гипермутаций, который сводится, в основном, к однонуклеотидным заменам, а также делециям и дупликациям с целью изменения их аффинности к антигену (Rajewsky K. 1996, Wagner S.D., Neuberger M.S. 1996). Центробласты экспрессируют повышенный уровень транскрипционного репрессора BCL6 (Shaffer A.L. et al. 2000), который отрицательно регулирует широкий набор генов, в том числе, участвующих в: BCR и CD40 сигнализации; T-клетками опосредованной активации B-клеток; индукции апоптоза; ответе на повреждения ДНК путем модуляции генов, вовлеченных в оформление ответов на повреждение ДНК; цитокиновых и хемокиновых сигнальных путей ( Linterman M.A. et al. 2010, Zotos D. et al. 2010); плазматической дифференцировки клеток через подавление PRDM1/BLIMP1 регулятора (Phan R.T., Dalla-Favera R. 2004). Транскрипционная программа предполагает, что функция BCL6 имеет решающее значение для установления пролиферативного статуса центробластов, допуская выполнение процессов модификации ДНК без реакции на повреждение ДНК и предотвращая преждевременную активацию и дифференциацию предварительно отобранных для выживания клеток, вырабатывающих высоко афинные антитела (Basso K., Dalla-Favera R. 2012).
В светлой зоне центробласты прекращают пролиферацию и дифференцируются в центроциты, видоизменяющиеся, через взаимодействие с CD4+ T-клетками и фолликулярными дендритными клетками (Klein U, Dalla-Favera R. 2008, Nurieva R.I. et al. 2009). Центроциты, экспрессирующие ВCR с уменьшенным сродством к антигену элиминируются путем апоптоза, в то время как клетки с высоким сродством стимулируются с помощью различных сигналов, включая привлечение своими ВCR антигена на себя и активацию рецептора CD40 лигандом CD40, присутствующим на CD4+ T-клетках (Johnston R.J. et al. 2009). Данные сигналы отрицательно регулируют BCL6, производя арест пролиферации, так, что B-клетки могут быть отобраны для выживания и дифференциации в клетки памяти (Bende R.J. et al. 2007) и плазматические клетки (Lin K.I., Tunyaplin C., Calame K. 2003, Phan T.G. et al. 2006). В зародышевом центре центроциты подвергаются класс-переключающей рекомбинации, событию ремоделирования ДНК, которое наделяет эффекторными функциями антитела (Stavnezer J., Guikema, J.E., Schrader, C.E. 2008). Как соматические гипермутации, так и класс-переключающие рекомбинации зависят от деятельности индуцирующего активацию фермента цитидин дезаминазы (Muramatsu M. et al. 2000. Luo Z. et al. 2004., Bhutani N. et al. 2010) и являются специфическими функциями B-клеток, которые изменяют геном клетки с помощью механизмов, связанных с одиночными или двойными разрывами (Revy P., et al. 2000., Allen C.D. et al. 2007), важными в понимании механизмов генерации генетических изменений в B-клеточных НХЛ (Franco S., Alt F.W., Manis J.P. 2006).
В описанной схеме полезно обратить внимание на две ключевых концепции понимания патогенеза B-клеточных НХЛ. Во-первых, активность соматических гипермутаций, которыми внесены необратимые изменения ДНК в геноме, позволила заключить, что большинство типов B-клеточных НХЛ происходят из клеток герминативного центра, так как они содержат гипермутированные Ig V последовательности (Kuppers R. et al. 1999). Кроме того, клональная экспансия тоже происходит в зародышевом центре, поэтому злокачественные клоны содержат в основном одинаковые мутации, поддерживая происхождение от единственной клетки (Pasqualucci L. et al. 2008). Во-вторых, наиболее частые онкогенные события в B-клеточных НХЛ, а именно хромосомные транслокации и аберрантные соматические гипермутации есть результат ошибок в механизме, который обычно разнообразит Ig гены в ходе дифференцировки В-лимфоцитов и служит дополнительной поддержкой гипотезы происхождения большинства B-клеточных НХЛ в зародышевом центре (Klein, U. et al. 2003). Наконец, определение двух различных фаз в процессе развития зародышевого центра отражает этапы B-клеточной дифференциации и функции, что выявляется в разных подтипах B-клеточных НХЛ (Kuppers R. 2005).
Общие классификационные подходы, критерии прогноза
При помощи флюоресцентно меченных моноклональных антител на основе реакции «антиген-антитело» определяли тип и функциональное состояние клеток костного мозга по наличию определенного набора клеточных маркеров, кластеров дифференцировки (cluster of differentiation antigens, CD) на поверхности или внутри клетки. Флюоресцентную метку обнаруживали с помощью проточного цитофлюориметра FACS CantoII (Becton Dickinson, USA). Мониторинг стабильности работы прибора осуществлялся с помощью калибровочной системы 7-color Setup Beads (Becton Dickinson, USA). Доля клеток, положительных по тому или иному маркеру вычислялась в процентах от общего числа. Для проведения иммунофенотипирования (ИФТ) костного мозга больных лимфомами, костный мозг в количестве 0,5-1 мл забирался в пробирки Vaсutainer (BD, USA) с сухим ЭДТА. Подготовка проб была осуществлена по методике окрашивание - лизис -отмывка с использованием прибора Lyse - Washassistant. Кроме диагностической для лимфом панели антител, включающей маркеры основных линий дифференцировки, были использованы маркеры апоптоза и пролиферативной активности (Ki67 и Bcl2).
Маркеры апоптоза и пролиферативной активности: Bcl-2, Ki 67 Для оценки ДНК использовали CycleTESTTMPLUS DNA Reagent Kit (кат. №340242, Becton Dickinson). После центрифугирования суспензии клеток 5 минут при 250g, концентрацию доводили до миллиона клеток в миллилитре. Образцы (не менее 50000 клеток) после окрашивания пропидиум йодидом (PI), анализировались на проточном цитофлуориметре BD FACS CantoII, оборудованном модулем дискриминации дуплетов. Для тестирования и подтверждения оптимальной работы проточного цитометра использовали универсальные биологические частицы DNA QC Particles (BD, кат. №349523). Полученные данные обрабатывались с помощью компьютерной программы ModFit LT, позволяющей анализировать плоидность и распределение клеток в фазах S и G2+М. Долю клеток с различным содержанием ДНК на гистограмме вычисляли как процент от общего числа исследованных клеток. Диплоидными опухолями считали те, у которых пик G0/1 находился в пределах контрольного пика диплоидных стандартов (был равен 1,0). В анеуплоидных клетках он был больше или меньше 1,0. Долю клеток в разных фазах клеточного цикла выражали в процентах. Степень анеуплоидии клеток костного мозга характеризовали, используя индекс ДНК, который вычисляли как отношение интенсивности флуоресценции пика анеуплоидных клеток (номер канала) к диплоидному пику.
Экспериментальная часть работы была проведена с целью изучения спонтанного и индуцированного апоптоза в культуре клеток костного мозга больных лимфомами in vitro. Пунктат костного мозга в объеме 7-10 мл помещали в пробирку с гепаринизированной средой 199 с соблюдением правил асептики. В качестве соединения, маркирующего клетки, находящиеся на стадии апоптоза, использовали рекомбинантный белок аннексин V, конъюгированный с флуоресцентным красителем FITS. Принцип флуоресцентного окрашивания состоит в следующем: на ранней стадии апоптоза происходит изменение в плазматической мембране клетки, а именно транслокация мембранного фосфолипида - фосфатидилсерина с внутренней стороны плазматической мембраны на ее внешнюю сторону. Аннексин V, Са2+ - зависимый фосфолипид 65 связывающий протеин, имеющий высокую аффинность к фосфатидилсерину, связывается с клетками, экспрессирующими фосфатидилсерин (Van Engelend M., et al, 1998). Аннексин V конъюгированный с флуорохромами сохраняет высокую аффинность к фосфатидилсерину и таким образом используется для анализа апоптотических клеток. Поскольку транслокация фосфатидилсерина наблюдается на ранней стадии апоптоза (целостность клеточной мембраны сохранена), окрашивание клеток с помощью аннексин + флуорохром позволяет выявить раннюю стадию апоптоза. Оценку поздних стадий апоптоза и некроза, для которых характерно нарушение целостности клеточной мембраны, проводили с помощью пропидиум йодида. Таким образом, окрашивание мононуклеаров пропидиум йодидом (для выявления некроза) и аннексин V – флуорохромом (для выявления апоптоза) позволяло одновременно определить количество апоптотических и некротических клеток в данной культуре (клетки, находящиеся на ранней стадии апоптоза, положительные по аннексину V и отрицательные по пропидиум йодиду; клетки на поздней стадии апоптоза или уже погибшие – положительные и по аннексину V и по пропидиум йодиду; некротизированные клетки – отрицательные по аннексину V и положительные по пропидиум йодиду). Образцы (не менее 50000 клеток) после окрашивания анализировались на проточном цитофлуориметре BD Facs Cantoo.
Для оценки индуцированного апоптоза мононуклеары костного мозга обрабатывали следующими препаратами, разведенными изотоническим раствором хлорида натрия в концентрации 10-6/мл: преднизолон (рrednisolonum), кладрибин (сladribine), бортезомиб (bortezomib), ритуксимаб (rituximabum), иммуноглобулин человека нормальный (immunoglobulin human normal), пентоксифиллин (pentoxifylline). В качестве контроля использовали эквивалентный объем среды 199. Длительность инкубации с препаратами и со средой при 370С составила 45 минут. Набор исследуемых химиопрепаратов соответствовал перечню препаратов, применяемых для лечения гемобластозов. В качестве препарата, потенциально обладающего химиосенсибилизирующими свойствами, нами был выбран пентоксифиллин (pentoxifylline). Механизм действия данного препарата связывают с процессами угнетения фосфодиэстеразы и накоплением циклической аденозин монофосфорной кислоты (ЦАМФ) и АТФ со снижением концентрации внутриклеточного кальция, преимущественно в гладкомышечных клетках и в форменных элементах крови (тромбоциты и эритроциты). ЦАМФ - соединение, осуществляющее каскадное усиление ответа клеток на действие экзо - и эндогенных факторов, а также регулирующее синтез нуклеиновых кислот, увеличение концентрации которых рассматривается как молекулярная основа гипертрофии и пролиферации клеток (Лакин В.В., 1982; Bartfai, 1982). Все вышеописанное позволило предположить наличие у препарата свойств повышать чувствительность клеток к химиотерапии.
Характеристика параметров клеточного цикла мононуклеаров костного мозга больных лимфомами
Таким образом, параметры КЦ мононуклеаров непораженного КМ как при ЛХ, так и при ВНХЛ, в целом характеризуются стабильностью, что отражает относительное постоянство гемопоэза и степень сохранности пула нормальных гемопоэтических клеток, в отличие от пациентов с поражением КМ, где эти параметры отличаются значительным разбросом значений. Полученные данные не противоречат результатам различных отечественных и зарубежных биомедицинских исследований (Riccardi A, Montecucco C.M., et al 1986; Шмаров Д.А, Кучма Ю.М., 1997; Ермолаев О.Ю., 2003; Тюрин Ю.Н., Макаров А.А., 1995; Ружинская Е.Э., 2007).
Нами проведена комплексная сравнительная характеристика параметров проточной цитометрии мононуклеаров КМ больных лимфомами. Данные из совокупностей с нормальным распределением сравнивались с помощью t-критерия Стьюдента для независимых выборок (t – тест). Проверка равенства дисперсий проводилась с помощью критерия Фишера. Сравнение данных из совокупностей с распределением, отличающимся от нормального, проводилось с применением критерия Манна – Уитни (Mann-Whitney U Test).
Сравнительная характеристика содержания мононуклеаров диплоидного и анеуплоидного клонов КМ первичных больных по фазам КЦ приведена в таблице 3.13.
Данные таблицы 3.13 свидетельствуют об отсутствии статистически значимых различий в параметрах содержания клеток по фазам цикла диплоидного и анеуплоидного клонов у больных I группы, однако намечена тенденция увеличения доли мононуклеаров по всем фазам КЦ в диплоидном клоне.
В таблице 3.14 содержатся данные о содержании клеток диплоидного и анеуплоидного клонов пораженного КМ больных II группы по фазам КЦ. Как и у первичных пациентов, статистически значимых различий содержания клеток по фазам цикла в диплоидном и анеуплоидном клонах не отмечено. Таблица 3.14
Сравнительная характеристика параметров клеточного цикла диплоидного и анеуплоидного клонов костного мозга больных II группы с поражением костного мозга Критерий Манна – Уитни (Mann-Whitney U Test) Показатель (%) Сумма рангов (диплоидн.) Сумма рангов (анеуплоидн.) U Диплоидный клон Анеуплоидный клон p
Сравнительная характеристика параметров клеточного цикла мононуклеаров пораженного костного мозга больных II группы в зависимости от степени злокачественности лимфомы Критерий Манна – Уитни (Mann-Whitney U Test) Показатель (%) Сумма рангов Индолентные Сумма рангов Агрессивные U Индолентны е n Агрессивные n p
В таблице 3.19 приведены данные сравнительной оценки параметров КЦ и экспрессии маркеров Ki67 и Bcl2 пациентов I группы с поражением КМ в зависимости от уровня ЛДГ, содержания лейкоцитов и гемоглобина в ПК, наличия или отсутствия бластоза в ПК. Выявлено, что среднее содержание клеток анеуплоидного клона в фазе G0-1 было выше у пациентов с содержанием ЛДГ в ПК более 500 Ед/л с уровнем значимости р 0,05. Среднее содержание клеток в фазе G2M анеуплоидного клона и цитокинетический показатель (S+G2M)/G0-1 в анеуплоидном клоне не отличались у пациентов с различным уровнем ЛДГ, поскольку разность дисперсий была статистически значима (F=293,3 и F=35,5 соответственно при рдисперсий=0,001). Процент клеток КМ, экспрессирующих Bcl2, был выше у пациентов с количеством лейкоцитов ПК более 15 х 109/л (р 0,05). Показатель (S+G2M)/G0-1 в диплоидном клоне был выше у пациентов с наличием бластных клеток в ПК более 5%, однако считать это различие статистически значимым не представлялось возможным с учетом наличия высокой разницы дисперсий (F=144,8 при рдисперсий=0,0002). Отмечена тенденция к увеличению содержания клеток в G2M - фазе диплоидного клона у пациентов с наличием анемии различной степени выраженности, однако высокая разница дисперсий (F=21,8 при рдисперсий=0,0002) не позволяет считать эту разницу значимой. У пациентов с наличием анеуплоидии в КМ содержание ЛДГ в ПК и процент клеток, экспрессирующих Bcl2 были значимо выше (F=1,2 при рдисперсий=0,04).
В ходе анализа результатов проточной цитометрии мононуклеаров КМ больных II группы с поражением КМ выявлено статистически значимое увеличение доли клеток в фазе - G2М (U=4,5 р=0,008) и показателя отношения пролиферации к полиплоидизации - G2M/S (U=4,0 р=0,008) при повышении уровня ЛДГ ПК более 500Ед/л. Так же параметр G2M/S был выше у больных с повышенным СОЭ в ПК более 15 мм/ч (U=6,0 р=0,02). Возраст пациентов II группы с наличием анеуплоидии в костномозговом пунктате в среднем был выше чем у больных с отсутствием анеуплоидии (U=0,5 р=0,001).
Сравнительный анализ параметров КЦ, маркеров апоптотической и пролиферативной активности мононуклеаров КМ больных I группы с поражением КМ и без, выявил статистически значимое увеличение доли клеток, экспрессирующих Bcl2 (2,7±1,8% 28,9±4,0% разность дисперсий F=2,11 рдисперсий=0,07), клеток в фазах G0-1 (U=25, р=0,004), G2М (U=16, р=0,0005) и S (U=34, р=0,02) у пациентов с поражением КМ. Доля клеток пролиферативного пула (S+G2M U=28, р=0,007) соответственно также была выше у данной когорты больных. Поражение КМ влекло за собой статистически значимое повышение цитокинетического параметра (G2M+S)/G0-1 (U=27, р=0,006). Статистически значимых отличий по показателям экспрессии маркера пролиферативной активности Ki67 и отношения пролиферации к полиплоидизации G2M/S у пациентов обеих групп не выявлено (таблица 3.20).
Регрессионный анализ и оценка выживаемости больных лимфомами
Вклад отдельных предикторов выражали величиной статистики Вальда (Wald Chi – Square). Ниже представлен список критических значений наиболее значимых предикторов риска развития рецидива (прогрессирования) заболевания: Bcl2 – 28% WS10,8 р=0,0009; тип поражения КМ (1-лимфоцитарный, 2 – бластный, 3- смешанный) WS 6,24 р=0,01; БК в ПК (%) WS 6,02 р=0,01; Ki67 – 5,21% WS 5,65 р=0,02; пол (1 – мужской; 2 – женский) WS 4,53 р=0,03; лейкоцитоз в ПК более 15 х 109 /л WS 3,8 р=0,05; S+G2M - 2% WS 3,69 р=0,05; S -3% WS 3,59 р=0,06; анеуплоидный клон (1 – наличие анеуплоидии; 2- отсутствие) WS 3,34 р=0,05; (S+G2M)/G0-1 - 5,8% WS 3,21 р=0,05; G2M/S - 42% WS 2,83 р=0,06.
Пример 1. Графический пример зависимости беспрогрессивной выживаемости от цитокинетического индекса - ЦКИ ((S+G2M)/G0-1) представлен на рисунке 4.11. Вероятность того, что больной с показателем критического значения ЦКИ 5,8% сможет прожить без прогрессирования или рецидива заболевания более 5 месяцев равна 0,9 , более 32 месяцев равна 0,6.
Пример 3. Из переменных, влияющих на функцию выживания с большей значимостью, выбраны предикторы, обладающие наименьшей автокорреляцией между сбой. Используя модель пропорциональных рисков Кокса (таблица 4.3), проанализирована вероятность развития прогрессирования патологического процесса под влиянием нескольких независимых переменных: ЦКИ (S+G2M)/G0-1, бластоза в ПК и наличия/отсутствия анеуплоидии в КМ (рис. 4.13 и 4.14).
Анализ модели показал, что вероятность того, что пациент, у которого при обследовании выявлено наличие анеуплоидии в КМ, бластоза в ПК более 5 %, с уровнем ЦКИ, равным 7% проживет без прогрессирования заболевания более 35 месяцев равна около 0,09. При отсутствии анеуплоидии в КМ, с наличием бластов 131 в ПК, не превышающим 5% и показателем ЦКИ 5,8%, вероятность прожить без рецидива или прогрессирования составляла около 0.81.
Таким образом, анализ наиболее значимых, определяющих риск прогрессирования заболевания, признаков показал, что больные I группы с поражением КМ, у которых за период наблюдения отмечалось прогрессирование или активация процесса были преимущественно мужского пола, с повышенной экспрессией Bcl2 и Кi67, с наличием преимущественно бластно – лимфоцитарного (смешанного) типа поражения КМ, с наличием изменений в гемограмме в виде лимфоцитоза и/или бластоза, а также с повышенным процентным содержанием мононуклеаров КМ в пролиферативном пуле.
Для каждого из факторов на основании критерия 2 было сформировано пороговое значение признака, что позволило рассчитать беспрогрессивную и общую выживаемость по методу Каплана–Майера соответственно найденным пороговым значениям.
При оценке зависимости функции выживания от уровня пролиферативной активности мононуклеаров КМ первичных больных с поражением КМ выявлено статистически значимое увеличение общей и беспрогрессивной выживаемости пациентов с показателями процентного содержания мононуклеаров пролиферативного пула в КМ S+G2M 2 %, р 0,05 (рисунок 4.15 и 4.16). Кумулятивная доля выживших (Каплан - Мейер)О Завершено + Цензурир. 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,30,20,1 Л ( )—I с 9 1 0 5 10 15 20 25 30 35 4 Время наблюдения. месяцы S+G2M менее 2%0S+G2M более 2%
Показатели общей выживаемости в группе первичных пациентов с поражением костного мозга в зависимости от уровня экспрессии маркера Bcl2 При анализе данных пациентов I группы с поражением КМ выявлены статистически значимые различия показателей беспрогрессивной выживаемости в зависимости от типа поражения КМ (рисунки 4.24 и 4.25). Наиболее неблагоприятным вариантом поражения КМ с точки зрения беспрогрессивной и общей выживаемости, являлся смешанный (лимфоцитарно–бластный) вариант.
Оценивание каждого в отдельности и суммарного влияния отобранных предикторов на результативный признак производили с помощью метода максимального правдоподобия (Log-Likelihood). Сравнение правдоподобия L0 нулевой модели (Log-Likelihood of Null model), где все параметры наклона равны нулю, с правдоподобием L1 разработанной модели (Log-Likelihood of final solution) выполнялось с использованием статистики хи-квадрат (2).
Обращает на себя внимание высокая специфичность, чувствительность и диагностическая точность вышеперечисленных признаков, что соответствует прикладной направленности наших исследований и целесообразность применения их результатов для пациентов, находящихся на обследовании и лечении в стационарах онкгематологического профиля с целью планирования тактики ведения и мониторинга ремиссии.