Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 13
1.1. Биологические свойства низкомолекулярных ДНК-тропных соединений 13
1.1.1. ДНК-связывающие алкилирующие агенты 15
1.1.2. Интеркаляторы 22
1.1.3. Узкобороздочные лиганды 28
1.1.4. Соединения со смешанным типом взаимодействия с ДНК 35
1.2. Поли(АДФ-рибоза)-полимеразы: строение, свойства, биологическая функция 36
1.2.1. Семейство белков PARP 36
1.2.2. PARP1: строение, свойства 38
1.2.3. Роль белка PARP1 в функционировании репарации ДНК 40
1.2.4. Другие функции белка PARP1 42
1.2.5. Противоопухолевые препараты – ингибиторы белка PARP1 45
2. Материалы и методы 48
2.1. Реактивы 48
2.2. Растворы и буферные системы 48
2.3. Приборы и методы 49
2.3.1. Методы работы с D.melanogaster 49
2.3.2. Методы работы с ДНК 50
2.3.3. Методы работы с E.coli 54
2.3.4. Методы работы с белком PARP1 56
3. Результаты 57
3.1. Изучение механизма бластомогенности УБЛ Hoechst 33352 и Hoechst 33248 с использованием теста SMART на гетерозиготах D.melanogaster wts/TM3 и wts/mus309 57
3.2. Изучение сиквенс-специфичности узкобороздочных лигандов при помощи футпринтинга ДНКазой I 60
3.3. Применение двойной репортерной системы для изучения свойств узкобороздочных лигандов 71
3.4. Исследование влияния узкобороздочных лигандов на функционирование белка PARP1 78
4. Обсуждение результатов 88
4.1. Рекомбиногенный механизм бластомогенной активности УБЛ 88
4.2. Изучение физико-химических свойств узкобороздочных лигандов 91
4.3. Биологическая активность узкобороздочных лигандов 98
4.4. Узкобороздочные лиганды как ингибиторы белка PARP1 101
Заключение 105
Список сокращений 108
Список литературы 109
- ДНК-связывающие алкилирующие агенты
- Методы работы с ДНК
- Применение двойной репортерной системы для изучения свойств узкобороздочных лигандов
- Узкобороздочные лиганды как ингибиторы белка PARP1
ДНК-связывающие алкилирующие агенты
Алкилирующие агенты – это соединения, способные присоединять алкильную группу по различным позициям гетероциклических оснований ДНК, в качестве которых чаще всего выступает N7-атом гуанина (рисунок 1). Алкилиряторы представляют собой электрофилы, взаимодействующие с нуклеофильными группами гетероциклических оснований ДНК, в результате чего происходит перенос алкильной группы и (или) образование аддуктов [32]. Алкилирование может идти как со стороны малой бороздки ДНК, так и со стороны большой бороздки ДНК, что обусловлено способностью соединений взаимодействовать с ними. Реакция алкилирования зависит от природы самого алкилирующего агента и стерических эффектов [33, 34] и чаще всего проходит по N7, N2 и O6 положениям гуанина, N1 и N3 положениям цитозина N3, однако другие положения гетероциклических оснований ДНК также могут взаимодействовать c электрофильными агентами (рисунок 1). Цитотоксический эффект чаще всего связан с влиянием на репликацию и (или) транскрипцию посредством алкилирования ДНК.
Алкилированные основания ДНК восстанавливаются различными системами репарации в зависимости от типа алкилирования [35]. В некоторых случаях, при нарушении какой-либо системы репарации, цитотоксическое действие алкилятора обусловлено неспособностью функционирующих систем репарации исправить повреждения алкилированных оснований ДНК.
Первым алкилирующим агентом, который был использован для химиотерапии, был хлорметин (chlormethine) [36]. Препарат успешно использовали против лейкемии [36] в 1942 году. С тех пор синтезировано множество производных соединения. Многие из этих соединений, в том числе и сам хлорметин, применяют до сих пор [37].
В данном обзоре мы остановимся на соединениях с двояким типом связывания, то есть соединениях, способных помимо алкилирования связываться с ДНК нековалентно, – таких как митомицины, иллидины, таллимустин, бромсталлицин, тетрогидрохинолин и диокармицин (и его производные: CC-1065, бизелезин, адозелезин, карзелезин).
Митомицины – семейство соединений, содержащих азиридин.
Азиридиновый цикл выступает в качестве алкилирующего агента, взаимодействуя с N3-атомом аденина или N2-атомом гуанина, при этом трехчленный гетероцикл раскрывается – (рисунок 2, Г) и, в зависимости от условий, может образовываться аддукт или поперечные сшивки, что вызывает остановку клеточного цикла и апоптоз [38, 39]. Митомицин С (mitomycin C) (рисунок 2, A) применяется для лечения многих видов аденокарциномы желудка, поджелудочной железы, толстой кишки, прямой кишки, молочной железы и мочевого пузыря [36]. Сам mitomycin С не является УБЛ, но на его основе были синтезированы соединения, имеющие сродство к малой бороздке, однако эти соединения показали более низкую цитотоксичность против опухолевых клеток, чем митомицин [40, 41].
Таллимустин (tallimustine) представляет собой полиамидит дистамицин с остатком хлорметина в качестве алкилирующего агента. Алкилирование этим соединением проходит по N3-атому аденина. Предположительно, полиамидная часть позволяет соединению связываться с AT-богатыми участками промоторов генов OTF-1 и NFE1, что приводит к ингибированию уровня их экспрессии [42, 43]. Метод, основанный на остановке синтезы цепи ДНК Taq-полимеразой (Taq polymerase stop assay), показывает, что алкилирование идет главным образом по сайту TTTTGA [44, 45]. Похожим соединением является бросталлицин (brostallicin), однако в этом случае вместо остатка хлорметина используется бромакрилоил. Последний активен только при участии тиольных групп белков, а алкилирование при этом проходит по последовательности AAAG [46]. Соединения обладают терапевтическим действием при лечении опухолей, дефектных по системе репарации мисмэтчей (ошибочно спаренных нуклеотидов) – mismatch repair (MMR) [47]. Существенным недостатком описанных соединений является их высокая гепатотоксичность, причина которой до конца неизвестна.
Иллидины (illudin) – природные терпены, выделенные из грибов Clitocybe illuden [48] в 1950-е годы. При действии данных соединений алкилирование происходит по N2- или N3-атому аденина и N7-атому гуанина, что в дальнейшем приводит к апуринизации [49]. Повреждения репарируются при помощи эксцизионной репарации нуклеотидов, что в дальнейшем влечет за собой накопление большого количества одноцепочечных разрывов ДНК за счет активности соединений, что лежит в основе цитотоксического действия этих агентов. Однако при этом селективности действия на опухоли не наблюдается и, несмотря на обнаруженную высокую биологическую активность, иллидины не вошли в практику из-за высокой токсичности. Для повышения селективности действия были предприняты попытки придать данным соединениям свойства узкобороздочных лигандов, однако синтезированные аналоги также не проявили желаемых свойств, и несмотря на увеличение специфичности данных молекул к определенным последовательностям ДНК, селективность их действия к опухолевым клеткам повысить не удалось [50]. Тем не менее поиск новых иллидинов продолжается до настоящего времени, что связано со схожестью их механизма действия алкилирования с механизмом действия других эффективных противоопухолевых препаратов тетрогидрохинолинов.
Тетрогидрохинолины были впервые обнаружены в 1960-е годы в рамках программы скрининга противоопухолевых соединений Национального института онкологии США (National Cancer Institute, NCI, USA). Смесь соединений была получена из асцидий Ectenascidia turbinata. Тогда было показано, что они могут ингибировать пролиферацию ксенотрансплантатов и культур опухолевых клеток [51]. Однако самое активное соединение – эктенасцидин 743 (ecteinascidine 743, ET-743, Trabectedin, Yondelis) (рисунок 3) было охарактеризовано спустя 20 лет [52]. Впоследствии его стали получать полусинтетическим путем из вещества циносафрацин B (cynosafracin B) [53].
В 2007 г. Et-743 был одобрен Европейским агентством лекарственных средств (European Medicines Agency, EMEA) для лечения сарком мягких тканей, а в 2009 г. – для лечения рецидивов рака яичников. Данному соединению было присвоено коммерческое название трабектедин. Другие его производные, lurbinectedin и zalypsis, показывали схожую цитотоксичность in vitro [54], однако доклинические исследования выявили их цитотоксичность также по отношению к раку легких, молочной железы, поджелудочной железы, множественной миеломе и саркоме Юинга. В данный момент эти соединения проходят клинические испытания.
Методы работы с ДНК
Получение флуоресцентно-меченых ДНК-дуплексов [223] ДНК-дуплексы получали, используя ПЦР. В качестве матриц были использованы плазмиды. Реакцию проводили в аликвотах по 50 мкл 1 x буфера Б («Синтол», Россия) в термоциклере PTC-100 (MJ Research Inc., Канада). Реакционная смесь содержала 1 нг плазмидной ДНК, праймеры (0,4 мкМ), один из которых содержал флуоресцентную метку в 5 -конце, четыре дезоксирибонуклеозид-трифосфата (0,2 мМ), Pfu-полимеразу (2,5 ед. акт.), а также хлорид магния, количество которого подбиралось индивидуально для каждой пары праймеров. Для проведения ПЦР использовали программу: 1 цикл – 94С (2 мин); 29 циклов – 95С (30 с), 56С (1 мин), 72С (40 с); 1 цикл – 72С (5 мин). После ПЦР-амплификации реакционные смеси объединяли.
Для ПЦР использовали следующие олигонуклеотиды со следующими концентрациями магния: 159-звенный фрагмент ДНК – плазмида pRFPCer, концентрация MgCl2 – 2 мМ FAM/ROX/TAMRA/Cy3/Cy5,5)TCGGGAAACAGCTATGACCATG, TGTGCTGCAAGGCGATTAAG, 200-звенного фрагмент ДНК – плазмида pUC19, концентрация MgCl2 – 1,5 мкМ, TGTGCTGCAAGGCGATTAAG; (TAMRA)ATATTTTCCCGACTGGAAAGCGGG.
Осаждение ДНК
Растворенные низкомолекулярные вещества удаляли высаливанием, используя твердый перхлорат лития, доводя его до 2 М концентрации в конечном растворе, центрифугировали, отбирали раствор – удаляли осадок солей. ДНК осаждали добавлением ацетона к раствору ДНК в отношении 4:1. Полученные смеси центрифугировали на центрифуге Univarsal 320 R (Hettich, Германия) при 14000 об/мин (24400 G) при 4C в течение 10 минут на угловом роторе 30x4g 1620a. Затем аккуратно отбирали раствор от осадка ДНК-дуплекса, добавляли ацетон и снова центрифугировали 10 мин при 4С, отбирали ацетон и сушили осадок ДНК при комнатной температуре (примечание: осадок нельзя оставлять недосушенным, т.к. это приводит к неточностями в измерении концентрации ДНК, в то же время пересушивание может привести к деградации ДНК). Полученные ДНК-дуплексы очищали методом электрофореза в плоском 10x8x0,15 см полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях (методом «разделения» в геле).
Электрофорез ДНК-белковых комплексов в неденатурирующих условиях
Метод «торможения» в геле проводили в плоском 20x18x0,15 см ПААГ, содержащем 8% акриламида, 0,4% N,N -метиленбисакриламида в TBE-буфере при напряженности поля 8,5 В/см. Пробы наносили на гель в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 10–20%-й глицерин.
Выделение ДНК из ПААГ
После проведения гель-электрофореза участки геля, содержащие ДНК-дуплекс, вырезали (полосы флуоресцентно-меченых ДНК-дуплексов видны при дневном свете, в случае использования малых количеств ДНК ее можно детектировать в УФ-свете длиной волны 260 нм). Из геля ДНК элюировали в 2 М растворе перхлората лития в течение ночи, на следующий день элюцию повторяли, части объединяли и высаживали в ацетоне, как описано выше.
Полученный флуоресцентно-меченый ДНК-дуплекс денатуировали и ренатурировали (нагревали до 90С и медленно охлаждали до комнатной температуры («отжиг») в буфере, используемом для футпринтинга (примечание: процедуру нельзя проводить в воде, т.к. это может привести к неправильному отжигу цепей).
Электрофорез в денатурирующих условиях
Пробы анализировали в денатурирующих условиях в плоском 20x20x0,04 или 10x 8x0,15 см 8–15% (m/v) ПААГ, содержащем 24:1 – акриламида : N,N -метиленбисакриламида (примечание: акриламид и N,N -метиленбисакриламид должны быть бесцветными, даже незначительная желтизна раствора говорит об их непригодности), 7 М мочевину и 20% формамид, в TБE-буфере при напряженности поля 8 В/см (напряжение выставляется исходя из нагрева геля, благоприятная температура для денатурации ДНК в условиях электрофореза составляет 50–60С). Пробы наносили в гель на дно ячеек без предварительной обработки (примечание: для получения четкого профиля расщепления рекомендуется промыть ячейки геля перед нанесением и промыть ячейки после 10–20 секунд электрофореза (для напряженности электрического поля 2 В/см) после нанесения; данная процедура позволяет избавиться от нежелательных солей, которые могут содержаться в буфере; соли, проникая в гель, ухудшают профиль футпринтинга. ДНК, являясь полианионом, проникает в гель значительно быстрее, чем однозарядные анионы, поэтому при промывании ячеек ДНК уже находится в геле, в то время как примеси, главным образом, удаляются.
Футпринтинг с использованием ДНКазы I
Перед проведением футпринтинга комплексов лигандов с ДНК подбирали оптимальную концентрацию (активность) ДНКазы I в условиях, аналогичных условиям реакции связывания ДНК молекулой ДНК-связывающего лиганда (примечание: буфер, температура и другие условия для реакции связывания выбираются в зависимости от ДНК-связывающей молекулы). Реакцию связывания проводили в 10 мкл буфера, содержащего 2,5 мM MgCl2, 1 мM CaCl2, 10 мM Tris-HCl, pH 7,5, смешивали 18 мкл 0,2 мкМ флуоресцентной ДНК и 2 мкл ДНК-связывающей молекулы и инкубировали 15 минут при 37С (время инкубации подбирается в зависимости от типа молекулы). Затем добавляли 1,5 мкл 0,5 мкЕА/мкл ДНКазы I (концентрацией, полученной из предыдущего шага), инкубировали 15 минут при 37С (примечание: время инкубации всех образцов должно быть одинаково во избежание разного характера расщепления). Реакцию останавливали добавлением 15 мкл формамида и нагреванием до 95С в течение 5 минут. Пробы хранили в темноте.
Электрофорез ДНК в агарозном геле
Разделение фрагментов ДНК проводили в 0,8–1,5 % агарозном геле. Для этого соответствующее количество агарозы смешивали с 1x раствором TBE. Смесь нагревали, периодически перемешивая, до полного растворения агарозы до 60–70C, избегая кипения. Затем охлаждали при постоянном перемешивании до 40–50С, добавляли при необходимости раствор бромистого этидия и заливали в каретку, предварительно выровняв ее по уровню. Наносили пробы в 10% глицерине. Проводили электрофорез при напряжении 7 В/см, в качестве контроля разделения использовали бромфеноловый синий и ксиленцианол. Фрагменты ДНК визуализировали при помощи УФ-лампы или флуоресцентного сканера Thyphoon 9410.
Выделение ДНК из агарозного геля
ДНК выделяли из агарозного геля, экстракцию проводили при помощи набора для выделения фрагментов ДНК из агарозного геля Thermo Scientific GeneJET Gel Extraction Kit фирмы Fermentas, используя прилагающийся протокол. Участки геля, содержащие ДНК-дуплекс, вырезали и растворяли в Binding Buffer при 55С до полного растворения геля. Полученный раствор фильтровали через колонку для выделения ДНК, затем два раза промывали колонку 700 мкл Wash Buffer. Связанную с мембраной ДНК элюировали с 50 мкл Elution Buffer либо другим буфером в зависимости от назначения выделенной ДНК. Концентрацию ДНК определяли по поглощению при 260 нм, используя прибор GE Healthcare NanoVue.
Применение двойной репортерной системы для изучения свойств узкобороздочных лигандов
Для дальнейшего изучения сиквенс-специфичности УБЛ, а также исследования их влияния на экспрессию генов в зависимости от последовательности нуклеотидов в промоторных областях, была использована двойная репортерная система флуоресцентных белков.
Данная модельная система представляет собой набор штаммов E.Coli, несущих различные плазмиды. Каждая из плазмид содержит гены двух флуоресцентных белков (Cerulean и RFP). Последовательность промотора гена RFP постоянна, тогда как последовательность промотора Cerulean (далее Cer) вариабельна. При этом другие ключевые элементы транскрипции и трансляции, такие как рибосом-связывающий сайт и последовательность терминации, для каждого из генов одинаковы. Меняя промотор гена Cer и обрабатывая бактерии узкобороздочными лигандами, можно оценить влияние УБЛ на экспрессию гена под определенным промотором путем оценки соотношения уровней экспрессии гена RFP, находящегося под контролем константного промотора, и экспрессии Cer, находящегося под контролем вариабельного промотора.
На первом этапе выполнения данной части исследования для проверки системы и выбора оптимальных условий проведения эксперимента были подобраны: концентрация узкобороздочных лигандов, время инкубации, возможность использования определенных промоторов для эксперимента.
Сначала для всех тестируемых УБЛ были подобраны нетоксичные для клеток E.coli концентрации. Для этого клетки E.coli выращивались в среде LB, содержащей УБЛ в разных концентрациях, пример подбора нетоксичной концентрации показан на рисунке 25, А, нетоксичные концентрации для каждого соединения приведены в таблице (рисунок 25, Б).
Далее мы подобрали оптимальное время регистрации сигнала флуоресценции растущих на чашке Петри колоний. На рисунке 26 представлены графики абсолютных значений флуоресценции Cer и RFP для промотора T5. Следует отметить, что динамика экспрессии и созревания белков была неодинакова. Так, увеличение уровня флуоресценции белка Cer наблюдается только в первые 48 часов и далее не увеличивалось, тогда как нарастание флуоресценции RFP регистрировалось в течение всего эксперимента (72 часа). Исходя из этих данных, оптимальным временем регистрации результата был выбран период 24 часа.
На следующем этапе мы исследовали влияние УБЛ на созревание (экспрессию/трансляцию/созревание) каждого из флуоресцентных белков. В этой серии экспериментов мы изучили зависимость отношений абсолютных уровней флуоресценции белков (Cer/RFP) от концентрации УБЛ. При этом экспрессия обоих генов находилась под контролем промотора T5. Обработку проводили следующими соединениями – Hoechst 33258, Hoechst 33342, DAPI, Pentamidine, Diminazene, CBL0137 и типичного представителя серии DBP – DBP-2, в концентрациях 1,25; 2,5; 5; 10; 20; 40 мкМ.
Анализ полученных данных свидетельствует о том, что при увеличении концентрации соединений изменяется соотношение флуоресценции белков. Так как белки имеют одинаковые отвечающие за экспрессию элементы, то изменение соотношения уровня флуоресценции белков, по всей видимости, свидетельствует о влиянии соединений на процесс созревания белков. В то же время при слишком низкой концентрации соединения не оказывают существенного влияния на соотношение экспрессии белков. В большинстве случаев зависимость относительной флуоресценции белков (Cer/RFP) от концентрации УБЛ описывается функцией линейной регрессии (R2 0,7), хотя зависимость уровня флуоресценции каждого из белков от концентрации каждого из УБЛ описывается полиномиальной функцией (рисунок 27).
DAPI в концентрациях от 1,25 до 20 мкМ оказывает влияние на созревание белков, зависимость соотношения уровня экспрессии Cer/RFP от концентрации DAPI, описывается линейной зависимостью (рисунок 27, А). При более высокой концентрации (40 мкМ) происходит значительное угнетение синтеза обоих белков, что, по-видимому, обусловлено цитотоксичностью данной концентрации. В случае DBP-2 наблюдается влияние на созревание, однако зависимость в этом случае не удается выявить в связи с высоким уровнем ошибки измерений (рисунок 27, Б). Для Diminazene (рисунок 27, В) характерно слабое влияние на созревание белков, описываемое линейной зависимостью. Pentamidine (рисунок 27, Г) почти не влияет на созревание и не обладает цитотоксичностью во всех исследованных концентрациях. Hoechst 33258 оказывает относительно слабое влияние на созревание белков (рисунок 27, Д), в то время как Hoechst 33342 (рисунок 27, Ж) оказывает довольно сильное действие, влияние описывается линейной зависимостью в диапазоне концентраций от 0 до 20 мкМ, при концентрации 40 мкМ соединение проявляет значительную цитотоксичность. CBL0137 (рисунок 27, Е) даже в высоких концентрациях почти никакого влияния на созревание белков не оказывает.
Исходя из полученных данных для тестируемых соединений были выбраны максимальные концентрации, в которых влияние УБЛ на созревание белков RFP и Cer минимально. При этом концентрация DAPI составила 5 мкМ, Pentamidine – 10 мкМ, Hoechst 33342 – 2,5 мкМ, Hoechst 33258 – 2,5 мкМ, CBL0137 – 40 мкМ. На рисунке 28 представлены соотношения уровня экспрессии белка Cer к белку RFP, находящиеся под одним и тем же промотором T5. Как видно, соотношение уровня экспрессии белков при обработке тестируемыми соединениями отличается от уровня экспрессии белков без обработки.
Факт влияния УБЛ на созревание белков не позволяет использовать двойную репортерную систему для количественного сравнительного анализа, т.е. определения последовательности максимальной аффинности УБЛ, но тем не менее свидетельствует о принципиальном влиянии УБЛ на экспрессию генов в зависимости от последовательности нуклеотидов в промотере. Для выявления этого влияния соотношения уровней экспрессии Cer/RFP в присутствии УБЛ были нормированы на соотношения уровней экспрессии Cer/RFP в отсутствие УБЛ (рисунок 29). Из диаграмм видно, что для некоторых промоторов нормированное соотношение интенсивности флуоресценции I/I0 статистически значимо отличается от нормированного соотношения I/I0 (T5), что говорит о разном влиянии УБЛ на экспрессию белков в зависимости от промотора. DAPI оказывает влияние на экспрессию при промоторах MetN и GadA. Pentamidine оказывает влияние только при промоторе GadA. Hoechst 33258 оказывает влияние при промоторах MetN и GadA. Hoechst 33342 и кураксин CBL0137 в выбранной концентрации не оказывают влияния ни при одном из изученных промоторов.
Узкобороздочные лиганды как ингибиторы белка PARP1
Ингибирование активности PARP1 в настоящее время рассматривается как один из перспективных подходов к созданию препаратов для адьювантной химиотерапии опухолей в качестве сенситизаторов опухолевых клеток к основному цитотоксическому или лучевому воздействию. Прежде всего это обусловлено участием данного белка в активации эксцизионной репарации (см. раздел Обзор литературы) [287].
На данный момент функции белка PARP1 в клетке достаточно хорошо изучены [288], в то же время нет полных данных об активирующих белок субстратах. Так, показано, что PARP1 может связываться с тупыми и липкими концами ДНК, одноцепочечными разрывами, AT-богатыми участками ДНК, гистонами, нуклеосомами, для некоторых из этих субстратов продемонстрирована их способность в той или иной степени активировать поли-АДФ рибозилирующую активность PARP1 [289]. Для исследования функциональной активности PARP1 in vitro D. Neuhaus и соавторами была предложена модель гантелеобразного дуплекса с одноцепочечным ником и без него. В работе было продемонстрировано, что PARP1 связывается с ДНК-дуплексами двумя цинковыми пальцами ДНК-связывающего домена белка исключительно при наличии одноцепочечного разрыва (ника) [290], в то же время активации поли АДФ-рибозилирования продемонстрировано не было [291]. В связи с этим на первом этапе данной части работы мы впервые продемонстрировали, что при наличии одноцепочечного разрыва активация белка происходит значительно активнее, чем при его отсутствии, что полностью согласуется с вышеупомянутыми данными.
Ранее нами было показано, что узкобороздочные лиганды способны ингибировать PARP1, при этом УБЛ специфически действуют на ДНК-зависимую активацию PARP1, разобщая связь фермента с ДНК-активатором по конкурентному механизму [232].
Почти все исследуемые на данный момент ингибиторы PARP1, включая соединения, проходящие клинические испытания, химически являются конкурентами никотинаминовой кислоты. УБЛ же ингибируют белок PARP1 посредством нарушения его взаимодействия с ДНК. В нашей работе, при использовании гентелеобразного дуплекса с одноцепочечным разрывом, было изучено ингибирование белка классическими (DAPI, Diminazene, Hoechst 33258, Netropsin, Pentamidine) и новыми УБЛ (серии DBP и DB). Все протестированные соединения в большей или меньшей степени оказывали ингибирующее действие на белок (рисунок 34). Было установлено, что ингибирующая способность соединений увеличивается в ряду: DB(n) DBP(n) Netropsin Pentamidine Hoechst 33258 Diminazene DAPI. Относительно низкая эффективность ингибирования DB(n), DBP и Netropsin, по-видимому, обусловлена размером молекул этих соединений, не позволяющим эффективно взаимодействовать с ДНК. Мы предполагаем, что в случае Pentamidine низкая эффективность ингибирования обусловлена его низкой константой связывания с ДНК. Hoechst 33258, обладающий более высокой константой связывания и молекулярным размером, соизмеримым с Pentamidine, обладает большей ингибирующей активностью. IC50 для Hoechst 33258 соединения составляет 13,3 мкМ, что соответствует 723 п.о./УБЛ. Значительно большей ингибирующей способностью обладают Diminazene и DAPI. Концентрация полумаксимального ингибирования ферментной реакции для DAPI соединения составляет 62,5 нМ. При такой концентрации на 1 молекулу УБЛ приходится 3,4 пары оснований, что соответствует 5,3 молекулам DAPI на 1 молекулу h44. Из результатов аналогичного эксперимента с Diminazene видно, что IC50 для этого агента составляет 0,132 мкМ, что соответствует 11,3 молекулам Diminazene на 1 молекулу h44. Эти результаты согласуются с данными о том, что Diminazene обладает большей сиквенс-специфичностью и избирательностью связывания с ДНК (в том числе и с h44) по сравнению с DAPI. Diminazene и DAPI обладают достаточными концентрациями полумаксимального ингибирования, что позволяет рассматривать их как перспективные ингибиторы PARP1.
Так как согласно литературным данным и данным, полученным в ходе выполнения работы, УБЛ обладают специфичностью к AT-богатым участкам, был проведен эксперимент с гантелеобразными дуплексами ДНК, содержащими AT-богатый участок рядом (G2) и в удалении (G1) от одноцепочечного разрыва ДНК. В результате было показано, что гантелееобразный дуплекс с AT-богатым участком вблизи одноцепочечного разрыва активирует PARP1 хуже, чем ДНК-дуплекс с AT-богатым участком с удалением от одноцепочечного разрыва. Такой результат может быть обусловлен тем, что активация белка в данном ДНК-дуплексе вызвана AT-богатым участком ДНК, а не только одноцепочечным разрывом, что согласуется с известным фактом активации белка AT-богатыми последовательностями [288]. Ранее было показано, что PARP1 специфичен к некоторым последовательностям ДНК [292, 293, 294], например, TCGATC, сиквенс которой содержится в нашей модельной молекуле ДНК. Также в работе [294] было продемонстрировано, что последовательность AATT способствует увеличению гибкости молекулы ДНК. При этом константа диссоциации белка PARP1 с этим регионом в 4 раза меньше, чем константа диссоциации белка с ДНК с ником (значения константы диссоциации PARP1 при взаимодействии с ником – 23,4±4,8, при взаимодействии с AATT – 8,5±2,1).
При изучении реакции ингибирования УБЛ Diminazene (при активации ДНК-дуплексами G1 и G2) показано, что, несмотря на то что Diminazene ингибирует активность белка PARP1 на 50% эффективнее, чем при активации h44p, статистической значимости в разнице ингибирования при активации G1 и G2 не продемонстрировано. Возможно, такой эффект обусловлен тем, что в дуплексе G2 ингибирование активации главным образом проходит по AT-богатому сайту (с учетом специфичности УБЛ) и соответствует ингибированию активности приблизительно на 50% (так, участков активации два), в то время как в G1 (где и одноцепочечный разрыв, и AT-богатый находятся рядом) ингибирование идет и по одноцепочечному разрыву, и по AT-богатому сайту одновременно. Согласно эксперименту с h44p ингибирование может составлять около 50%; можно предположить, что в ДНК-дуплексе G2 приблизительно на таком же уровне. Поэтому Diminazene ингибирует активацию белка PARP1 приблизительно на 50% и дуплексом ДНК G1, и дуплексом ДНК G2.