Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Матричные металлопротеиназы и их ингибиторы: общая биологическая роль и участие в прогрессии рака мочевого пузыря (обзор литературы)
1.1. Современные представления о распространенности и прогностических
маркерах рецидива рака мочевого пузыря
1.2. Роль ферментов семейства матричных металлопротеиназ в регуляции состояния экстрацеллюлярного матрикса опухолевой ткани 24
1.3. Роль матричных металлопротеиназ в опухолевой прогрессии .30
1.4. Матричные металлопротеазы и их тканевые ингибиторы как прогностические маркеры роста опухоли у пациентов с РМП 33
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 39
2.1. Дизайн исследования 39
2.2. Общая характеристика больных 44
2.3. Методы исследования .48
2.4. Тактика лечения пациентов клинической группы 55
2.5. Статистическая обработка результатов 56
Глава 3. Генетические аспекты и особенности экспрессии ферментов протеолиза внеклеточного матрикса и базальной мембраны в ткани мочевого пузыря и в моче у больных немышечно-инвазивным раком мочевого пузыря 58
3.1. Содержание в моче ферментов протеолиза внеклеточного матрикса и их ингибиторов у больных раком мочевого пузыря з
3.2. Особенности экспрессии ферментов протеолиза внеклеточного матрикса и их ингибиторов в ткани мочевого пузыря у больных раком мочевого пузыря 67
3.3. Особенности экспрессии у2 цепи ламинина-5 в ткани мочевого пузыря у больных раком мочевого пузыря 77
3.4. Генетические аспекты активности ферментов внеклеточного протеолиза у больных раком мочевого пузыря 80
ГЛАВА 4. Особенности активности ферментов эндогенного внеклеточного протеолиза в ткани и моче в предоперационном периоде и в динамике послеоперационного периода у больных немышечно-инвазивным раком мочевого пузыря в зависимости от раннего рецидивирования заболевания 84
4.1. Содержание металлопротеиназ и их ингибиторов в моче у больных немышечно-инвазивным раком мочевого пузыря до и после операции в зависимости от рецидива заболевания 84
4.2. Экспрессия ферментов внеклеточного протеолиза и их ингибиторов в ткани мочевого пузыря у больных немышечно-инвазивным раком мочевого пузыря до и после операции в зависимости от рецидива заболевания 94
4.3. Оценка прогноза рецидива рака мочевого пузыря по активности ферментов тканевого внеклеточного протеолиза 110
Заключение 116
Выводы 124
Практические рекомендации 126
Список литературы
- Роль ферментов семейства матричных металлопротеиназ в регуляции состояния экстрацеллюлярного матрикса опухолевой ткани
- Тактика лечения пациентов клинической группы
- Особенности экспрессии ферментов протеолиза внеклеточного матрикса и их ингибиторов в ткани мочевого пузыря у больных раком мочевого пузыря
- Экспрессия ферментов внеклеточного протеолиза и их ингибиторов в ткани мочевого пузыря у больных немышечно-инвазивным раком мочевого пузыря до и после операции в зависимости от рецидива заболевания
Роль ферментов семейства матричных металлопротеиназ в регуляции состояния экстрацеллюлярного матрикса опухолевой ткани
Ткань интерстиция и экстрацеллюлярный матрикс является резервуаром разнородных белков, которые могут вступать во взаимодействие со многими клетками. Разные ферменты (миелопероксидаза, матричные металлопротеиназы, эластаза, лизосомальные ферменты, коллагеназы, дезоксирибонуклеаза и липазы) и белки, секретируемые клетками иммунной системы, опухолевыми и нормальными клетками эпителия, активно модифицируют внеклеточный матрикс (Бережная Н.М., 2009; Kanayama 2001; Nutt J.E. 2003, Rodriguez F.O. et al., 2012; Vandooren J et al., 2013; Yan Y et al., 2014). В пространстве интерстиция происходят как взаимодействия между клетками, так и взаимодействия разных клеток с молекулами экстрацелюллярного матрикса (Jiang Y. et al., 2001; Kanayama 2001; Bogusiewicz M. et al., 2003;). Нарушения в этом взаимодействии (что очень характерно дл опухолей) вызывают генерацию новых молекул матрикса. В итоге создаются благоприятные условия ля изменения активности рецепторов различных клеток и приводит к нарушениям в секреции цитокинов, факторов роста и может менять функциональную активность клеток (Birkedal-Hansen Н. et al., 1993; Blasi F. et al., 1998; Kanayama 2001; Szarvas et al. 2011; Vandooren J et al., 2013).
Одним из ведущих фактором, влияющим на состояние внеклеточного матрикса, является система ММП, относимых к семейству цинксодержащих кальций-зависимых эндопротеиназ (Спирина Л.В. с соавт., 2008, 2008а, 2008б). Продуцировать их могут все раковые клетки (Спирина Л.В. с соавт., 2009, 2009а). Влияние ММП на рост и развитие опухоли сложно переоценить благодаря их уникальной способности учствовть во вех стадиях е прогрессии (Kanayama 2001; Lynch С.С. et al., 2002; Nutt J.E. 2003; Wiegand S. et al., 2005; Mohammed et al., 2013; Vandooren J et al., 2013). Данные белки гидролизуют основные структурные протеины базальной мембраны и внеклеточного матрикса, а значит благоприятствуют метастазированию и инвазивному росту рака (Андреева Ю.Ю., 2009; Данильченко Д.И., 2009, Szarvas et al. 2011;
Помимо этого, белки системы ММП регулируют механизмы взаимоотношения экстрацеллюлярного микроокружения опухолевых клеток (Франк Г.А., 2009, 2009а; Vandooren J et al., 2013), что влияет, в частности, а х апоптоз, миграцию пролиферацию, процессы неоангиогенеза и реакции иммунной системы на новообразование. (Hofmann U., 2000; Lynch С.С, 2002; Wiegand S., 2005; Rundhaug J.E., 2005, Offersen B.V et al., 2010; Xu J et al., 2012).
Кроме того, имеются указания на связь между синтезом ММП и их ингибиторов и развитием химио- и радиорезистентности (Кондакова И.В. с соавт., 2008; Powell et al., 1999; Kumar A. et al., 2002).
Выделено около 20 ферментов семейства ММП (таблица 1.1). Большая часть ММП синтезируется клетками в неактивной форме. В норме в ткани находят незначительные количества ММП, а х активация вызывает протеолитическое разложение белков, окружающих клетку (Kleiner D.E. et al., 1993; Werb Z., 1997, Kanayama 2001; Nutt J.E. 2003; Vandooren J et al., 2013). Эту активацию запускают протеазы активатора плазминогена урокиназного типа и протеазы типа плазмина (Kleiner D.E. et al., 1993; Wallard et al., M.J 2006). Малая часть матриксных металлопротеаз могут активировать друг друга. Существует механизм биологического сдерживания протеолиза тканей активными ММП в форме выделения клетками стромы тканевых ингибиторов металлопротеаз. Это белки малого размера, которые могут сформировать нековалентные комплексы со многими представителями ММП (Tibor S. et al., 2011).
В таблице 1.1 приводится несколько произвольная классификация ММП на основе субстратной специфичности в пять подгрупп, потому что истинные физиологические субстраты для ММП на настоящий момент до конца не определены. Но все же возможно выделить группу коллагеназ, гидролизирующих коллагены интерстиция I, II и III типов (Liabakk N.B. et al., 1996; Sand et al., 2013 ) и группу желатиназ, гидролизующих коллаген IV типа (Kodate М. et al., 1997; Sand et al., 2013). Молекулы из этих подсемейств запускают процессы инвазии, поскольку базальные мембраны содержат коллаген IV типа, а экстрацеллюлярный матрикс содержит в основном фибриллярные коллагены I-III типов.
Тактика лечения пациентов клинической группы
При оценке морфологических форм РМП использовали рекомендации гистологической классификации опухолей мочевого пузыря (ВОЗ, 2004). Иммуногистохимический метод оценки тканевой экспрессии 2-пептидной цепи ламинина 5 в опухоли
Для проведения иммуноморфологического исследования использовали парафиновые блоки операционных биоптатов. Парафиновые срезы толщиной 1-2 мкм наносили на адгезивные предметные стекла SuperFrost Plus, депарафинировали и регидратировали по стандартной методике. «Демаскировку» антигенов проводили в PT-Link Thermo. Протокол включал в себя предварительный нагрев до 65С, восстановление антигена в течение 20 минут при температуре 97С и дальнейшее охлаждение до 65С. Затем стекла промывались в течение 1-3 минут TBS-буфером (Dako) и помещались в автостейнер Thermo Scientific для окрашивания в автоматическом режиме. С целью оценки экспрессии 2 ламинина 5 были использованы мышиные моноклональные антитела анти-ламинин 5 (2 цепь) (1/50 разведение, Chemicon, Temecula, CA, USA). Срезы обрабатывали во влажных камерах при температуре 23-25С течение 30 минут. Для визуализации иммуногистохимической реакции использовали систему детекции Reveal Polyvalent HRP-DAB Detection System. Срезы докрашивали гематоксилином Майера, для заключения использовали бальзам Bio-Mount. Оценку результатов окрашивания проводили с применением светового микроскопа фирмы «Leica» (Германия) под увеличением х10, х20, х40. В исследовании применяли следующие критерии оценки маркера: 1) опухоль считали отрицательной по цепочке 2 ламинина 5, если в ткани отсутствовала реакция с антителами или количество окрашенных клеток было менее 10%, и положительной, если число окрашенных клеток более 10% (Oka T. et al., 2009). Качественные показатели экспрессии маркеров изучали как минимум на 10 случайно выбранных полях зрения микроскопа гистологических срезов.
Иммуногистохимический метод оценки тканевой экспрессии ММП, ТИМ и Кі-67 в опухоли
Для проведения иммуногистохимических реакций депарафинированные срезы операционных биоптатов толщиной 4-5 мкм располагали на стеклах, покрытых APES - слоем. Демаскировку антигенов для последующего проведения ИГХ реакций проводили в СВЧ печи PT-Link Thermo. При этом стекла погружали в цитратный буфер с pH 6,0, затем нагревали в СВЧ печи при мощности 600 Вт в течение 15 мин. На следующем этапе стекла остывали ри комнатной температуре 20 мин. Далее стекла ля предотвращения высыхания помещали во влажные камеры и в них же проводили инкубацию с 3% раствором перекиси водорода в течение 15 мин, ополаскивали стекла в фосфатном буфере (pH 7,0-7,6), инкубировали с 1% раствором альбумина течение 30 минут. По окончания инкубации излишнее количество альбумина удаляли и при помощи микропипетки наносили первичные антитела. В качестве первичных антител использовали моноклональные антитела к ММР-2 (LabVision, readyo-use), ММР-9 (LabVision 1:50), ММР-14 (LabVision, readyo-use), TIMP-1 (LabVision, ready to use, 7 ml), ТИМ-2 (LabVision, readyo-use). Инкубацию срезов с первичными антителами проводили в течение от 30 до 60 минут с учетом инструкции фирмы производителя. Отмывание срезов от несвязанных антигенами первичных антител осуществляли в фосфатном буфере pH 7.0 7.6. Затем срезы обрабатывали вторичными антителами (Ultra V HRP polymer KIT LabVision) и инкубировали во влажных камерах в течение 60 мин с последующим ополаскиванием в фосфатном буфере с pH 7.0-7.6. Для визуализации локусов связывания антигена с антителом использовали метку - пероксидазу хрена в присутствии субстрата пероксида водорода и колориметрического реактива с 3,3-диаминобензидином (DAB substrate + chromogen LabVision). Нерастворимый в органических растворителях конечный продукт реакции визуализировался виде коричневого окрашивания. Докраску дер гематоксилином после ополаскивания дистилированной воде использовали для облегчения визуализации антигенов в тканях. Затем стекла проводили по батарее спиртов возрастающей крепости (дистилированная вода, однократно 70 спирт, 80 спирт, двух кратно 95 спирт, абсолютный спирт, трехкратно ксилол). Далее срезы заключали в бальзам Bio-Mount.
Для контроля качества ИГХ исследования реакции ставили на срезах от фирмы-производителя с известным распределением маркера (положительные контрольных реакции) и на срезах тканей без специфических первичных антител (отрицательные контрольные реакции). Оценку результатов окрашивания роводили с применением светового микроскопа фирмы «Leica» (Германия), анализатора изображения «Leica Q550» под увеличением х10, х20, х40.
Результаты ИГХ реакций оценивались в баллах полуколичественным методом по количеству позитивно окрашенных клеток. Оценку проводили по 6-ти балльной системе: 2 балла - до 20% окрашенных клеток, 4 балла - от 20 до 40% окрашенных клеток, 6 баллов - более 40% окрашенных клеток (Камоева СВ., 2013).
Интенсивность реакций оценивали полуколичественным способом по шкале от 0 до 3 баллов с помощью анализатора изображения «Leica Q550», учитывая выраженность реакции: 0 - отсутствие реакции, 1 - слабая реакция, 2 - умеренная реакция, 3 - сильная реакция (Андреева Ю.Ю., 2009). Для оценки пролиферативной активности опухолевых клеток в качестве первичных специфических антител использовали моноклональные антитела к Ki-67 (LabVision, ready to use, 1:100). Оценка продукта реакции Ki-67 осуществлялась путем подсчета процента окрашенных ядер на 300 клеток (100 ядер в трех полях зрения при малом увеличении), полученные результаты выражали в процентах. Пролиферативную активность оценивали следующим образом: 0% - 20% - низкая пролиферативная активность, 21% -50% - умеренная пролиферативная активность, 51% - 100% - высокая пролиферативная активность (Андреева Ю.Ю., 2009).
Все вышеуказанные исследования выполнены на базе лаборатории молекулярной онкологии, лаборатории иммунофенотипирования опухолей, а также патологоанатомического отделения Федерального Государственного Бюджетного Учреждения «Ростовский Научно-Исследовательский Онкологический Институт» Министерства Здравоохранения Российской Федерации
Особенности экспрессии ферментов протеолиза внеклеточного матрикса и их ингибиторов в ткани мочевого пузыря у больных раком мочевого пузыря
Во группе 2 в послеоперационном периоде гистологически неизмененной ткани ни один из изучаемых ферментов не изменял своей активности (табл. 4.15). Между тем, в группе 1 экспрессия ММП-2, ММП-9, ММП-14 и ТИМ-1 повышалась через 12 месяцев после операции, что свидетельствовало о повышенном протеолитическом потенциале ферментов внеклеточного матрикса.
Таким образом, характерной чертой РМП с рецидивом был высокий протеолитический потенциал ферментов внеклеточного матрикса, адекватно неограниченный тканевыми ингибиторами. Оценка прогноза риска рецидива рака мочевого пузыря по активности ферментов тканевого внеклеточного протеолиза. Оценка изменений уровня концентрации матриксных металлопротеиназ и их специфических ингибиторов в моче и выраженности их экспрессии в гистологически неизмененной слизистой оболочке до операции послеоперационном периоде, позволили нам выделить дифференциальные точки разделения между группой рецидивом немышечно-инвазивного рака мочевого пузыря и группой безрецидивного течения. С помощью ROC-анализа для выделения группы риска развития ранних рецидивов были найдены дифференциальные точки разделения или точки cut-off для следующих показателей: 1. содержание ММП-2 в моче после операции 2. содержание в моче ММП-2 и ТИМ-2 через 6 месяцев после операции 3. уровень тканевой экспрессии ММП-2, ММП-14, ММП-9, 2 цепи ламинина 5 в опухоли на границе с ней до операции 4. уровень тканевой экспрессии в биоптатах ткани мочевого пузыря ММП-2 через 6 месяцев после операции.
Только для вышеуказанных параметров доверительная вероятность порогов была меньше критической величины (р 0,05), о свидетельствовало статистической значимости выделения группы риска по развитию ранних рецидивов РМП по указанным параметрам (табл. 4.16).
Величины дифференциально-диагностических точек разделения (cut-off) и соответствующие им параметры диагностической чувствительности (ДЧ) и специфичности (ДС) у больных РМП с высоким риском развития ранних рецидивов заболевания. Показатель cut-off ДЧ ДС р Содержание ММП-2 в моче до операции 7,3 пг/мкмоль креатинина 75,5 76,2 0,006 Содержание в моче ММП-2 через 6 месяцев после операции 8,7 пг/мкмоль креатинина 77,1 79,3 0,005 Содержание в моче ТИМ-2 через 6 месяцев после операции 29 пг/мкмоль креатинина 69,2 68,6 0,04 Экспрессия ММП-2 в опухолевых биоптатах до операции 52% клеток 91,1 72,5 0,0001 Экспрессия ММП-14 в опухолевых биоптатах до операции 44% клеток 91,6 74,8 0,001 Количество клеток с позитивной экспрессией 2 цепи ламинина-5 в опухолевых биоптатах до операции (%) 75% 87,1 77,6 0,001 Экспрессия ММП-9 на границе с опухолью до операции 32% клеток 70,2 64,5 0,007 Экспрессия ММП-2 в биоптатах мочевого пузыря через 6 месяцев после операции 27% клеток 67,2 65,0 0,04 112 Из таблицы видно, что у больных немышечно-инвазивным РМП риск развития рецидивов после ТУР повышался при выявлении до операции: - роста содержания ММП-2 в моче более 7,3 пг/мкмоль креатинина с диагностической чувствительностью 75,5% диагностической специфичностью 76,2% (р=0,006); -экспрессии ММП-2 опухолевых биоптатах в более 52% клеток с диагностической чувствительностью 91,1% и диагностической специфичностью 72,5% (р=0,0001); -экспрессии ММП-14 опухолевых биоптатах в более 44% клеток с диагностической чувствительностью 91,6% и диагностической специфичностью 74,8% (р 0,001); -экспрессии 2 цепи ламинина 5 в опухолевых биоптатах в более 75% клеток с диагностической чувствительностью 87,1% и диагностической специфичностью 77,6% (р 0,001); -экспрессии ММП-9 на границе с опухолью более 32% клеток с диагностической чувствительностью 70,2% диагностической специфичностью 64,5% (р=0,007).
Следующим этапом для выделения групп высокого риска рецидива РМП явился период 6 месяцев после операции. Отнести пациентов к этим группам можно было при обнаружении через 6 месяцев после эндохирургического лечения: - повышения содержания ММП-2 в моче более 8,7 пг/мкмоль креатинина с диагностической чувствительностью 77,1% диагностической специфичностью 79,3% (р=0,005); -снижении содержания в моче ТИМ-2 менее 29 пг/мкмоль креатинина с диагностической чувствительностью 69,2% и диагностической специфичностью 68,6% (р=0,04); -экспрессии ММП-2 в биоптатах мочевого пузыря в более 27% клеток с диагностической чувствительностью 67,2% и диагностической специфичностью 65% (р=0,04).
Диагностическую значимость оценки высокого риска рецидива у больных немышечно-инвазивным РМП по показателям активности внеклеточного протеолиза проводили и сравнивали по площади под кривыми ROC-анализа (AUC), отражающими соотношение между диагностической чувствительностью иагностической специфичностью. Графическая иллюстрация кривых ROC-анализа содержания ММП-2 в моче до операции и через 6 месяцев после ТУР, а также экспрессии ММП-2, ММП-14 до операции представлена на рис. 4.16. Кривые показателей активности внеклеточного протеолиза были максимально приближены левому верхнему глу, то свидетельствовало высокой диагностической значимости именно этих факторов для прогноза развития рецидивов немышечно-инвазивного РМП.
Наибольшую диагностическую значимость для выделения группы высокого риска о рецидиву РМП имели определение до операции выраженности экспрессии ММП-2 (AUC=0,915±0,037) и экспрессии ММП 14 в биоптатах опухоли (AUC=0,843±0,049), содержание ММП-2 в моче до операции (AUC=0,813±0,062) через 6 месяцев после операции (AUC=0,811±0,048).
Экспрессия ферментов внеклеточного протеолиза и их ингибиторов в ткани мочевого пузыря у больных немышечно-инвазивным раком мочевого пузыря до и после операции в зависимости от рецидива заболевания
Содержание металлопротеиназ и их ингибиторов в моче у пациентов с немышечно-инвазивным РМП в пред- и послеоперационном периоде в зависимости от возникновения рецидива заболевания. У больных группы 1 рецидив заболевания был установлен при эндоскопическом исследовании мочевого пузыря. Из общего количества пациентов в 40,5% рецидив были выявлен к 12 мес. послеоперационного периода (табл. 4.1). Через 3 и 6 мес. рецидив диагностирован в 18,9% случаев соответственно, а ч ерез 9 мес. – в 21,7%. В первые 6 мес. после операции рецидивировали только опухоли стадии Т1.
Ретроспективно нами были проанализированы показатели содержания ММП и их ингибиторов в моче в группах немышечно-инвазивным раком мочевого пузыря с развитием рецидива и без него до операции и в динамике послеоперационного периода. Исходно у больных группы 1 содержание в моче ММП-2 было статистически достоверно выше на 17,2% по сравнению с второй группой (7,5±0,11 против 6,4±0,13 пг/мкмоль креатинина) (р 0,05) (табл. 4.2).
Группа 1 (n=37) (М±т) 7,5±0,11 8,1±0,32 8,6±0,37 8,8±0,41 9,4±0,49 Группа 2(п=36)(М±т) 6,4±0,13 6,5±0,28 6,2±0,25 6,1±0,34 6,3±0,31 Здоровые лица (п=30) (М±т) 4,1±0,27 р гр1-зд р гр2-зд р гр1-гр2 р 0,001 р 0,001 р 0,05 р 0,001 р 0,001 р 0,05 р 0,001 р 0,001 р 0,001 р 0,001 р 0,001 р 0,001 р 0,001 р 0,001 р 0,001 Примечание: - достоверные отличия по сравнению исходными величинами при р 0,05 (определены по критерию Вилкоксона) В послеоперационном периоде содержание в моче ММП-2 в группе 1 планомерно возрастало и уже через 3 мес. достоверно отличалось от исходного уровня. Через 12 мес. концентрация ММП-2 достигало величины 9,4±0,49 пг/мкмоль креатинина (рис.4.1). Динамика ММП-2 в моче
У больных группы 2 содержание в моче ММП-2 не изменялось по сравнению с исходным уровнем, однако оставалось повышенным по сравнению с аналогичной величиной у здоровых лиц (рис.4.1). Содержание в моче ММП-2 у пациентов группы 1 было достоверно выше по сравнению с группой 2 через 3, 6, 9 и 12 мес. после операции на 24,6% (р 0,05), 38,7% (р 0,001), 44,3% (р 0,001) и 49,2% (р 0,001), соответственно. Исходная величина и динамика содержания в моче ТИМ-2 у больных немышечно-инвазивным раком мочевого пузыря после операции в зависимости от рецидива представлены в таблице 4.3. Таблица 4.3
Динамика содержания в моче ТИМ-2 (пг/мкмоль креатинина) (М±ш) у больных немышечно-инвазивным РМП после операции в зависимости от раннего рецидивирования.
Примечание: - достоверные отличия по сравнению с исходными величинами при p 0,05 (определены по критерию Вилкоксона)
Исходно содержание в моче ТИМ-2 у пациентов группы 1 (36,3±1,4 пг/мкмоль креатинина ) и Группы 2 (37,9±1,6 пг/мкмоль креатинина) не имело различий (р 0,05). Через 3 мес. после операции была отмечена тенденция к снижению уровня ТИМ-2 моче у пациентов группы 1 (с 36,3±1,4 пг/мкмоль креатинина до 33,5±2,3 пг/мкмоль креатинина), однако разница эта была статистически не достоверна (р 0,05). Через 6 мес. после операции установилась четкая направленность изменений в двух группах. У пациентов группы 1 уровень ТИМ-2 в моче снижался, а в группе 2 - повышался (рис.4.2). В результате через 6, 9 и 12 мес. после операции в группе 1 по сравнению с группой 2 концентрация ТИМ-2 была снижена на 23% (р 0,05), 35% (р 0,05) и 35% (р 0,05), соответственно. Динамика ТИМ-2 в моче 45
Сопряженная динамика изменений содержания ММП-2 и ТИМ-2 по отношению к исходному уровню (относительный градиент) у больных группы 1 после операции представлена на рис. 4.3. Нами установлено, что у пациентов при наличии раннего рецидива после операции имел место дисбаланс ферментов внеклеточного протеолиза и его ингибиторов. В ответ на повышение содержания ММП-2 в моче, уровень ТИМ-2 снижался. Таким образом, ограничения протеолиза субстрата внеклеточного матрикса возможно не происходило. Напротив, в группе 2, при отсутствии рецидива, концентрация ММП-2 в моче после операции не изменялась (рис.4.4). При этом уровень ТИМ-2 повышался с максимальным пиком через 9 месяцев, что, возможно и приводило к сдерживанию активации внеклеточных протеаз.