Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 12
1.1. Введение 12
1.2. Молекулярно-генетические маркеры рака предстательной железы 15
1.2.1. ПСА 15
1.2.2 Производные и подтипы ПСА 17
1.2.3 Другие молекулярные маркеры 19
1.2.4 Молекулярно-генетические маркеры РПЖ на уровне ДНК и РНК 24
1.3. Роль микроРНК в качестве молекулярно-генетических маркеров 28
1.3.1 Процессинг и функции микроРНК 28
1.3.2 Носители внеклеточных микроРНК 30
1.3.3 Способы секреции и возможные функции циркулирующих микроРНК32
1.3.4 Роль циркулирующих микроРНК в качестве маркеров различных физиологических и патологических состояний организма 36
1.3.5 Влияние методики выделения на определяемый профиль циркулирующих микроРНК 40
1.4. Заключение 47
ГЛАВА 2. Материалы и методы 50
2.1 Разработка методики выделения и анализа циркулирующих РНК плазмы
крови 50
2.1.1 Оптимизация протокола центрифугирования плазмы 50
2.1.2 Выделение тотальной РНК из плазмы крови 54
2.1.3 Анализ профиля представленности микроРНК с помощью микрочипов Affymetrix GeneChip miRNA 4.0 56
2.2 Анализ профилей представленности микроРНК в плазме крови 59
2.2.1 Изучение взаимосвязи гемолиза и профиля циркулирующих микроРНК 2.2.2 Изучение профиля микроРНК здоровых доноров 60
2.2.3 Изучение профилей микроРНК в плазме крови пациентов с доброкачественной гиперплазией и раком предстательной железы. 62
2.3 Анализ возможной роли клеток рака предстательной железы
в происхождении циркулирующих микроРНК 64
2.3.1 Культивирование клеточной линии рака предстательной железы DU 145
2.3.2 Выделение РНК из культуральной среды и клеток DU 145 и анализ
профиля микроРНК на чипах Affymetrix GeneChip miRNA 4.0 65
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 68
3.1 Разработка методики выделения циркулирующих РНК из плазмы крови 68
3.1.1 Влияние методики выделения плазмы на показатели плазмы крови 68
3.1.2 Изучение взаимосвязи гемолиза и профиля циркулирующих микроРНК
3.1.3 Профиль микроРНК здоровых доноров 79
3.2 Изучение профилей микроРНК, характерных для доброкачественной гиперплазии и рака предстательной железы 82
3.2.1 Анализ отдельных микроРНК, высокопредставленных при доброкачественной гиперплазии и раке предстательной железы 82
3.2.2 Дифференциальная диагностика доброкачественной гиперплазии и рака предстательной железы на основе набора из нескольких микроРНК 86
3.3 Анализ возможных источников циркулирующих микроРНК при раке предстательной железы 92
3.3.1 Анализ генов-мишеней и генов-хозяев микроРНК, высокопредставленных при раке предстательной железы 92
3.3.2 Исследование взаимосвязи уровней микроРНК в клеточной модели рака предстательной железы и плазме крови больных 98
Заключение 109
Выводы 115
Практические рекомендации 116
Список сокращений и условных обозначений 117
Список литературы 119
- Молекулярно-генетические маркеры рака предстательной железы
- Роль циркулирующих микроРНК в качестве маркеров различных физиологических и патологических состояний организма
- Изучение взаимосвязи гемолиза и профиля циркулирующих микроРНК 2.2.2 Изучение профиля микроРНК здоровых доноров
- Анализ отдельных микроРНК, высокопредставленных при доброкачественной гиперплазии и раке предстательной железы
Введение к работе
Актуальность темы исследования
Рак предстательной железы (РПЖ) является вторым по частоте и пятым по смертности среди злокачественных новообразований у мужчин в мире [Siegel, Miller, Jemal, 2015], а в Российской Федерации смертность от РПЖ стоит на третьем месте среди всех злокачественных опухолей мужчин [Каприн, Старинский, Петрова, 2016]. Одной из важных клинических проблем является вопрос малоинвазивной диагностики РПЖ и дифференциальной диагностики РПЖ и доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ). Ранняя дифференциальная диагностика ДГПЖ и РПЖ является очень важным моментом в плане улучшения исходов и выживаемости при РПЖ. Текущая скрининговая диагностика РПЖ включает метод пальцевого ректального исследования с чувствительностью около 37% [Schrder et al., 1998] и определение ПСА, уровень которого повышен как при РПЖ, так и при ДГПЖ, что делает дифференциальную диагностику относительно сложным процессом, особенно при значениях ПСА из «серой зоны» 4–10 нг/мл [Woolf, 2001]. Для гистологического подтверждения РПЖ необходима трансректальная биопсия под контролем ультразвука, однако инвазивность процедуры остро ставит вопрос малоинвазивной диагностики РПЖ для принятия решения о необходимости проведения первичной биопсии. В свете вышесказанного становится актуальным поиск новых маркеров диагностики РПЖ.
Перспективным направлением развития диагностики РПЖ является определение циркулирующих молекул микроРНК. Данные некодирующие молекулы РНК выступают в роли посттранкрипционных регуляторов экспрессии определенных генов [Nicoloso et al., 2009]. Существует множество подтверждений, что микроРНК могут быть гипер-или гипоэкспрессированы в различных злокачественных опухолях [Heneghan, Miller, Kerin, 2010]. Данные молекулы могут быть выделены из любых биологических жидкостей и определены даже при наличии в очень малых количествах, что делает их перспективными биомаркерами [Cortez et al., 2011]. При РПЖ микроРНК могут выступать в роли биомаркеров в диагностике и прогнозировании течения РПЖ. Первично было обнаружено, что микроРНК miR-141 позволяет выявлять распространенный, метастатический РПЖ при сравнении со здоровым контролем с чувствительностью 60% и специфичностью 100% [Mitchell et al., 2008]. Другое исследование выявило панель из пяти микроРНК, отличающих РПЖ от ДГПЖ [Chen et al., 2012]. Еще три микроРНК позволяли дифференцировать раннюю стадию РПЖ и ДГПЖ, однако не различались при РПЖ и отсутствии патологий предстательной железы [Mahn et al., 2011].
Несмотря на то, что на сегодняшний день удалось продемонстрировать диагностическую значимость ряда циркулирующих в крови микроРНК, надежная методика для применения в практической медицине не создана. Отсутствует общепринятая методика получения плазмы крови для последующего выделения микроРНК, крайне ограничен объем клинических данных о связи микроРНК и РПЖ [Sita-Lumsden et al., 2013]. Маловероятно, что определение конкретной одиночной микроРНК
4 позволит достичь достаточной диагностической и прогностической точности,
так как существуют сообщения о связи одних и тех же типов микроРНК с различными
типами опухолей. Одним из путей решения вышеперечисленных проблем может быть
проведение исследований, направленных на поиск новых диагностически значимых
микроРНК с последующим созданием панели из нескольких микроРНК, способных
решить задачи диагностики РПЖ, как это было сделано для рака поджелудочной железы
[Szafranska-Schwarzbach et al., 2011].
Цель исследования
Разработать панель микроРНК-маркеров плазмы крови для малоинвазивной диагностики РПЖ.
Задачи исследования
-
Минимизировать выход нуклеиновых кислот из клеточных элементов в ходе получения плазмы крови.
-
Сформировать банк образцов плазмы крови пациентов с РПЖ, ДГПЖ и отсутствием патологии предстательной железы с охарактеризованным профилем циркулирующих микроРНК.
-
Выявить и исключить микроРНК, коррелирующие с гемолизом при получении плазмы крови.
-
Выявить микроРНК, ассоциированные с наличием РПЖ.
-
Установить профиль секретируемых микроРНК на линии клеток РПЖ DU145.
Научная новизна
Оптимизирована методика выделения плазмы крови с целью минимизации высвобождения микроРНК из форменных элементов крови. Выявлены микроРНК, коррелирующие с гемолизом. Впервые проведен анализ уровня микроРНК в плазме крови здоровых добровольцев, пациентов с РПЖ и ДГПЖ и отсутствием патологии предстательной железы с использованием микрочипов высокой плотности Affymetrix GeneChip miRNA 4.0 Array. Подобраны панели микроРНК, ассоциированных с РПЖ и ДГПЖ в российской популяции. Проведено сравнение уровня микроРНК при РПЖ в плазме крови российской популяции пациентов с профилем микроРНК в клетках РПЖ DU145 и выделяемыми в культуральную среду микроРНК.
Теоретическая и практическая значимость
Изучено влияние условий выделения плазмы крови на состояние форменных элементов крови и некоторые показатели плазмы крови. Углублены знания об изменении уровня циркулирующих нуклеиновых кислот при отсутствии патологий предстательной железы, РПЖ и ДГПЖ. Разработан метод выделения плазмы крови, минимизирующий разрушение форменных элементов крови, что может быть использовано в других научно-прикладных исследованиях, связанных с изучением различных параметров и маркеров в плазме крови.
Разработаны панели микроРНК для малоинвазивной диагностики РПЖ и дифференциальной диагностики с ДГПЖ и отсутствием патологии предстательной
5 железы, что может быть использовано в практической медицине и лабораторной
диагностике. Планируется внедрение на базе отдела трансляционной онкологии МНИОИ
им. П.А. Герцена — филиала ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России.
Методология и методы исследования
Для оптимизации методики выделения плазмы крови с минимизацией высвобождения нуклеиновых кислот изучено влияние ускорения (1000, 2000 и 4000 g), создаваемого центрифугой на первом и втором этапе центрифугирования, скорости разгона и торможения центрифуги (низкая, средняя и высокая), температуры (+25C и +4C), при которой производится выделение, на уровень гемоглобина, концентрацию свободной ДНК и количество микрочастиц в полученной плазме.
Для выявления роли микроРНК в диагностике РПЖ на базе ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России сформирована коллекция (банк) биологических образцов в составе:
– 35 образцов плазмы крови условно здоровых добровольцев и пациентов без патологии предстательной железы;
– 22 образца плазмы крови пациентов с ДГПЖ;
– 188 образцов плазмы крови пациентов с РПЖ.
Для выявления внеклеточных микроРНК, выделяемых клетками РПЖ,
производилось культивирование клеток линии РПЖ DU 145, образцы клеток и культуральной среды собирались в динамике с 1-го по 5-й день.
Для проведения микрочипового анализа из образцов плазмы и культуральной среды объемом 400 мкл выделялась РНК с помощью miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen) с добавлением GlycoBlue Coprecipitant (Thermofisher Scientific). Из образцов клеток проводилось выделение тотальной РНК с помощью miRNeasy Mini Kit (Qiagen) с обработкой ДНКазой из набора RNase-Free DNase Set (Qiagen). Все образцы были проанализированы методом микрочипового анализа с помощью GeneChip miRNA 4.0 (Affymetrix). После обработки микрочиповых данных с помощью пакета программного обеспечения Bioconductor XPS и программного обеспечения Affymetrix выбирался список дифференциально экспрессированных генов.
Для отобранных в результате микрочипового анализа микроРНК был проведен анализ генов-хозяев, генов-мишеней, корреляции клинических данных с уровнем микроРНК плазмы, связи профилей микроРНК, выделяемых клетками РПЖ, с профилем микроРНК плазмы крови.
В работе применяются следующие методы:
-
теоретический анализ и обобщение данных научной литературы;
-
клинико-анамнестический метод (опрос и анализ медицинских карт): данные о стадии и локализации заболевания, уровнях лабораторных показателей;
-
культивирование клеточной линии РПЖ DU 145;
-
мультиплексный параллельный анализ нуклеиновых кислот на микрочипах высокой плотности Affymetrix GeneChip miRNA 4.0 Array;
-
cтатистико-математические методы.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Разработанный двухстадийный метод получения плазмы позволяет минимизировать неспецифический вклад разрушения форменных элементов крови в изменение профиля циркулирующих микроРНК.
-
Предложенная панель из 6 микроРНК (hsa-miR-6085, hsa-miR-6511b-5p, hsa-miR-6886-5p, hsa-miR-155-5p, hsa-miR-619-5p, hsa-miR-6777-5p) позволяет выявлять РПЖ.
-
Линия клеток РПЖ DU145 секретирует 4 из 6 микроРНК, вошедших в панель для диагностики РПЖ.
Степень достоверности и апробация результатов
Диссертация апробирована и рекомендована к защите 01 сентября 2016 г. на заседании научно-технического совета ООО НТЦ «БиоКлиникум», а также 21 сентября 2016 г. на межотделенческой конференции МНИОИ им. П.А. Герцена — филиала ФГБУ «НМИРЦ» Минздрава России. Результаты настоящего исследования доложены на IX Конгрессе Российского общества онкоурологов (1–3 октября 2014 года, Москва), конференции «Personalized Medicine and its Impact in the Clinic» (7–8 октября 2015 года, Ганновер, ФРГ), всероссийском форуме-выставке «ГОСЗАКАЗ — ЗА честные закупки» (23–25 марта 2016 года, Москва), 2-м Международном семинаре по цифровой ПЦР (цПЦР) в России (7–8 июня 2016 года, Санкт-Петербург).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 5 — в научных изданиях, рецензируемых ВАК Министерства образования и науки РФ.
Структура диссертации
Диссертация изложена на 151 странице компьютерной верстки, иллюстрирована 24 таблицами и 11 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, двух глав, посвященных материалам и методам и собственным наблюдениям, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений и условных обозначений и списка литературы, содержащего 371 литературный источник зарубежных и отечественных авторов.
Молекулярно-генетические маркеры рака предстательной железы
Рак предстательной железы (РПЖ) является вторым по частоте и пятым по смертности злокачественным новообразованием у мужчин в мире [Siegel, Naishadham, Jemal, 2013], а в России — третьим по смертности [Алексеев, 2015; Каприн, Старинский, Петрова, 2015a; Каприн, Старинский, Петрова, 2016]. Наиболее высокие показатели заболеваемости РПЖ отмечаются в США, Канаде и ряде стран Европы, где он выходит на 1 место в структуре онкологической патологии. В России заболеваемость РПЖ продолжает неуклонно возрастать. Так, в 2014 году зарегистрировано 36493 новых случая РПЖ, показатель заболеваемости составил 54,3 на 100000 мужчин [Каприн, Старинский, Петрова, 2015a]. Среднегодовой прирост заболеваемости составил 8,09%, что соответствует первому месту по темпам прироста данного показателя [Каприн, Старинский, Петрова, 2015b]. Как правило, РПЖ является медленно прогрессирующим заболеванием [Dimakakos, Armakolas, Koutsilieris, 2014]. Агрессивность РПЖ может быть определена биологическими особенностями опухоли, связанными с устойчивостью к лучевой терапии или прогрессированием заболевания после проведенного радикального хирургического или лучевого лечения, что увеличивает опухолево-специфическую смертность больных РПЖ. Тем не менее, остается не вполне ясным, какими молекулярно-генетическими свойствами можно объяснить данные особенности [Краснов и др., 2015; Fraser и др., 2014].
Одной из важных клинических проблем является вопрос дифференциальной диагностики доброкачественной гиперплазии предстательной железы (ДГПЖ) и РПЖ. ДГПЖ является распространенным заболеванием, проявляющимся в увеличении размера предстательной железы, что может оказывать значительное влияние на здоровье больного и требовать хирургического лечения при неработоспособности фармакологического. ДГПЖ может развиваться и в 25 лет, однако гистологическое подтверждение чаще всего обнаруживается в возрасте примерно 50 лет, когда частота развития заболевания достигает 50% [Lokant, Naz, 2015]. Ранняя дифференциальная диагностика ДГПЖ и РПЖ является очень важным моментом в плане улучшения исходов и выживаемости при РПЖ.
Текущая скрининговая диагностика РПЖ включает метод ректального пальцевого исследования с чувствительностью около 37% [Schrder и др., 1998], определение ПСА, уровень которого повышен как при РПЖ, так и при ДГПЖ, делая дифференциальную диагностику относительно сложным процессом, особенно при значениях ПСА из «серой зоны» 4–10 нг/мл [Woolf, 2001]. Еще одним способом диагностики РПЖ является трансректальная биопсия под контролем ультразвука [Скрепцова и др., 2015; Степанов и др., 2016], однако данная методика имеет ограничения, связанные с техникой получения образцов, что в результате не позволяет обнаружить около 20% случаев РПЖ при первой процедуре [Djavan и др., 2001]. Кроме того, определенные области предстательной железы, такие как её передняя часть, в которой развивается более 25% опухолей, остаются сложнодоступными для трансректальной биопсии [Lawrentschuk и др., 2010]. Часто наблюдается неправильная оценка суммы по шкале Глисона из-за недостаточно надежной информации об объеме, распространении и агрессивности опухоли [Yakar и др., 2008]. В то же время патоморфологическая диагностика РПЖ остается золотым стандартом постановки диагноза [Аполихин и др., 2015]. Инвазивность процедуры остро ставит вопрос ранней дифференциальной диагностике ДГПЖ и РПЖ для принятия решения о необходимости проведения первичной биопсии. В свете вышесказанного становится актуальным поиск новых маркеров диагностики РПЖ, а также маркеров для оценки течения болезни.
Существует значительная разница между заболеваемостью РПЖ и смертностью от него. РПЖ диагностируется в течение жизни у 15-20% мужчин, однако риск наступления смерти от РПЖ составляет только около 3% [Jemal и др., 2006]. Это означает, что не все случаи РПЖ должны иметь одинаковую тактику ведения. Исследование PIVOT, сравнивавшее выжидательную тактику с радикальной простатэктомией (РПЭ) при РПЖ с ПСА 10 нг/мл не показало разницы в выживаемости в течение 10 лет [Wilt и др., 2012]. РПЖ-зависимая смертность среди нелеченых мужчин, у которых РПЖ не был обнаружен при скрининге и текущий статус опухоли имеет оценку 6 по шкале Глисона, составляет менее 10% в течение следующих 20 лет наблюдения [Klotz, 2007]. РПЭ может сопровождаться недержанием мочи, половой дисфункцией, тромбозами, стриктурой уретры, приступами подагры и другими осложнениями, ухудшающими качество жизни, что ставит вопрос оценки соотношения риска и пользы при РПЭ у разных групп больных [Cheng и др., 2014; Lppenberg и др., 2014]. В одном из исследований было сделано заключение, что РПЭ не может быть оправдана у мужчин с РПЖ низкого риска, с суммой Глисона 6 и менее, клинической стадией РПЖ cT1 или в возрасте больше 70 лет [Vickers и др., 2012]. Таким образом, помимо проблемы диагностики важным является поиск биомаркеров, позволяющих оценить возможное течение болезни и возможной тактики лечения.
В течение многих лет было изучено множество возможных маркеров для диагностики и прогнозирования РПЖ. S. Sharma сформулировал основные требования к идеальному опухолевому маркеру: он должен быть высоко специфичен для конкретного типа опухоли и высоко чувствителен во избежание ложноположительных результатов, а также должен позволять проводить диагностику до клинических проявлений. Кроме того, желательно наличие корреляции с прогрессией и регрессией опухоли, короткого периода полураспада маркера для возможности повторных динамических измерений. Не последнюю роль играют стоимость и способ определения маркера и возможность предсказания метастазирования и его степени. Обнаружение идеального маркера представляется практически невозможным [Sharma, 2009]. Однако поиск маркеров РПЖ, максимально приближающихся к предъявленным требованиям, постоянно продолжается [Князев и др., 2014].
Роль циркулирующих микроРНК в качестве маркеров различных физиологических и патологических состояний организма
Вынуть из пробирки колонку, перемешать элюированный раствор и осадить на центрифуге. Хранить на льду до продолжения эксперимента или заморозить при минус 20С для непродолжительного хранения либо при минус 80С для длительного хранения.
Анализ экспрессии микроРНК в образцах проводился в соответствии с протоколом производителя с небольшими модификациями. Для анализа брали 8 мкл тотальной РНК, выделенной из плазмы крови. На первой стадии проводили реакцию неспецифического синтеза поли-А олигонуклеотидов на 3 -конце молекул микроРНК с помощью поли-А-полимеразы. Для этого к 8 мкл РНК добавляли 2 мкл RNA Spike Control Oligos и 5 мкл Poly A Tailing Master Mix (Таблица 2, при приготовлении смеси сразу на несколько образцов необходимо увеличение объемов на 5% для учета потерь при пипетировании), аккуратно перемешивали и инкубировали 15 минут при 37С.
PAP Enzyme 1,0 Далее проводили стадию лигирования для мечения каждой молекулы РНК специальной Biotin-labeled3DNA меткой, содержащей биотин. Для этого после наращивания поли-А-концов к реакционной смеси добавляли 4 мкл 5х FlashTag Biotin HSR Ligation Mix, 2 мкл T4 DNA Ligase, аккуратно перемешивали и инкубировали 30 мин при 25С, после чего останавливали реакцию, добавлением 2,5 мкл HSR Stop Solution. Затем из 23,5 мкл реакционной смеси отбирали по 2 мкл для анализа ELOSA QC Assay, оставшиеся 21,5 мкл использовали для гибридизации на микрочипе.
Анализ ELOSA QC Assay (Enzyme Linked Oligosorbent Assay) проводится для оценки качества проведённых реакций, поэтому этот анализ проводится до стадии гибридизации. ELOSA QC Assay проводили с тремя контролями: положительный контроль, содержащий ELOSA Positive Control (олигонуклеотиды, меченые биотином и проверенные на качество производителем); отрицательный контроль, содержащий все реагенты для мечения РНК, кроме RNA Spike Control Oligos; отрицательный контроль, содержащий все реагенты для мечения РНК, кроме RNA Spike Control Oligos и тотальной РНК. Для проведения анализа сначала разводили ELOSA Spotting Oligos в растворе 1х PBS: например, для трёх образцов 4,5 мкл ELOSA Spotting Oligos растворяли в 220,5 мкл 1х PBS. Разведенные ELOSA Spotting Oligos добавляли по 75 мкл в каждую лунку на плашке для ELOSA. После этого плашку с ELOSA Spotting Oligos оставляли на ночь в холодильнике при 2–8С. Затем плашку дважды промывали раствором 0,02% Tween-20 в 1х PBS, добавляли 150 мкл 5% BSA в 1х PBS в каждую лунку, после этого инкубировали плашку 1 час при комнатной температуре. Раствор удаляли из плашки.
На следующем этапе готовили Hybridization Master Mix (Таблица 3) и заполняли 50,5 мкл этого раствора каждую лунку. Далее добавляли либо 2 мкл воды (для отрицательного контроля), либо 2 мкл ELOSA Positive Control (для положительного контроля), либо 2 мкл меченого образца. Плашку хорошо заклеивали и инкубировали 1 час при комнатной температуре.
Далее проводили связывание с SA-HRP. Лунки промывали 3 раза 0,02% раствором Tween в 1х PBS, потом в каждую добавляли 75 мкл SA-HRP, разведённого в соотношении 1:4000 раствором 5% BSA в 1х PBS. Плашку заклеивали и инкубировали 1 час при комнатной температуре. После этого лунки промывали 3 раза раствором 0,02% Tween в 1х PBS, добавляли 100 мкл TMB Substrate в каждую лунку, заклеивали плашку, заворачивали в фольгу и оставляли в темноте на 7 минут. Синий цвет раствора в лунке означает положительный результат: лунки с положительным контролем оказывались синими, а лунки с отрицательными контролями содержали неокрашенные растворы. Если раствор в лунках с образцами оказывался синим, то считали, что стадия мечения прошла успешно, и образцы использовали дальше для гибридизации на микрочип.
Для гибридизации готовили Hybridization Master Mix (Таблица 4, при приготовлении смеси на несколько образцов необходимо добавить 5% избыточного объема), при этом 20х Eukaryotic Hybridization Controls перед добавлением в реакционную смесь инкубировали 5 мин при 65С. Готовый раствор Hybridization Master Mix добавляли по 110,5 мкл к 21,5 мкл меченого образца для составления Hybridization Cocktail. Полученный раствор инкубировали 5 мин при 99С, а затем 5 мин при 45С. Затем 130 мкл Hybridization Cocktail переносили в микрочип GeneChip miRNA 4.0. Чипы помещали в разогретую до 48С гибридизационную печь Affymetrix Hybridization Oven 645 и оставляли в ней на 16 часов при скорости вращения 60 rpm.
Изучение взаимосвязи гемолиза и профиля циркулирующих микроРНК 2.2.2 Изучение профиля микроРНК здоровых доноров
Чувствительность и специфичность классификации составили соответственно 81,3% и 80,8%, диагностическая точность составила 81,2%, значение AUC составило 0,860. Следует отметить, что эти значения соответствуют ситуации, когда набор образцов, соответствующих пациентам без онкопатологий предстательной железы, включал образцы, соответствующие пациентам с онкопатологиями других органов, а также пациентам с неонкологическими патологиями предстательной железы (доброкачественной гиперплазией). Это свидетельствует об отсутствии некорректности, связанной с возможным базированием классификатора на онкомаркерах, неспецифичных для предстательной железы, или же на маркерах патологий предстательной железы, свойственных не только онкопатологиям.
Также следует отметить, что каждая отдельная из входящих в построенную тройку микроРНК не является дифференциально представленной относительно двух сравниваемых классов при стандартных критериях дифференциальной представленности. В частности, ни для одной из этих трех микроРНК отношение средних значений (fold-change) не превосходит 1,5x, и лишь для одной из трех микроРНК скорректированный уровень статистической значимости различия представленности (adjusted p-value) оказался ниже 0,05 (здесь и далее в этом разделе уровни статистической значимости соответствуют стандартной для биоинформатики модификации критерия Стьюдента — moderated t-statistics [Smyth, 2004], в качестве метода коррекции на множественность используется метод Бенжамини-Хохберга [Benjamini, Hochberg, 1995]).
Вторая по значению AUC тройка включала микроРНК miR-155-5p, miR 619-5p, miR-6777-5p. Наличию онкопатологии предстательной железы соответствует повышенный уровень в плазме крови каждой из этих трех микроРНК. Классификация на основе этой тройки обеспечивает близкие показатели достоверности (чувствительность 78,9% при специфичности 80,8%, диагностическая точность — 79,4%, AUC — 0,850). Следует отметить, что две из трех микроРНК этой тройки являются дифференциально представленными относительно двух сравниваемых классов. А именно, для miR-155-5p отношение средних (fold-change) составило 7,2, а скорректированный уровень статистической значимости различия представленности (adjusted p-value) — 0,004 (unadjusted p-value — 5,4x10-6); для miR-619-5p отношение средних (fold-change) составило 8,4, а скорректированный уровень статистической значимости различия представленности (adjusted p-value) — 0,003 (unadjusted p-value — 2,3x10-6). Факт, что при этом эта тройка уступает по достоверности классификации описанной выше, является дополнительной иллюстрацией тезиса [Galatenko и др., 2015] о различии понятий совокупной и индивидуальной информативности.
Имеет смысл обратить внимание на то, что микроРНК miR-619-5p демонстрирует определенную дифференциальную представленность и при сравнении неметастатической и метастатической форм рака предстательной железы: отношение средних (fold-change) составляет 2,5x при нескорректированном на множественность уровне статистической значимости 0,003. Однако при этом скорректированный на множественность уровень статистической значимости превосходит 0,5.
Интересно, что при отдельном рассмотрении образцов, соответствующих пациентам без онкопатологии предстательной железы, корреляция между значениями классификаторов, базирующихся на описанных выше тройках, оказывается статистически незначимой: двусторонний уровень статистической значимости, соответствующий коэффициенту корреляции Спирмана, превосходит 0,10 (имеются в виду «мягкие» значения, то есть значения линейной комбинации, на основе которых принимается решения о бинарной классификации). Аналогичный факт имеет место и при отдельном рассмотрении образцов, соответствующих пациентам с онкопатологией предстательной железы. При этом в силу высокой достоверности классификации каждым из классификаторов при совместном рассмотрении образцов наблюдается высоко значимая коррелированность: двусторонний уровень статистической значимости, соответствующий коэффициенту корреляции Спирмана, меньше 10-6. При совместном использовании двух классификаторов с использованием стандартной схемы голосования количество ошибок классификации каждого из видов сокращается до 6%. Однако обратной стороной применения этой схемы является возникновение так называемой «серой зоны» — образцов, на которых классификация, полученная этими классификаторами, оказывается противоречивой. Размер этой серой зоны составляет 25-30%. Альтернативным методом сочетания двух троек является построение классификатора, базирующегося одновременно на всех шести микроРНК. Именно этот подход и был реализован (построение также осуществлялось методом опорных векторов с линейным ядром). Такой подход позволил без введения серой зоны увеличить чувствительность и специфичность (специфичность 84,6% при чувствительности 83,7%; диагностическая точность 83,9%).
Ключевая роль именно троек в качестве основы для построения классификаторов оказалась обусловлена недостаточностью совокупной информативности двоек микроРНК. Так, наилучшие среди двоек результаты при разделении групп с наличием и с отсутствием онкопатологий предстательной железы показала пара miR-155-5p, miR-619-5p, но для нее при чувствительности 80,7% уровень специфичности составил лишь 69,2%.
Оптимальной для разделения образцов, соответствующих пациентам с доброкачественной гиперплазией и пациентам без патологий предстательной железы, оказалась тройка miR-149-3p, miR-4787-5p, miR-8084: при чувствительности 85,7% она обеспечила специфичность 83,9% (диагностическая точность 84,6%; AUC 0,925). Следует напомнить, что эти показатели достоверности соответствуют контрольной группе, включающей наряду со здоровыми пациентами пациентов с онкологическими патологиями других органов (не предстательной железы), а также с рядом неонкологических патологий (например, мочекаменной болезнью). Наличию доброкачественной гиперплазии соответствует повышенный уровень в плазме крови микроРНК miR-149-3p и пониженный уровень микроРНК miR-4787-5p, miR-8084.
Анализ отдельных микроРНК, высокопредставленных при доброкачественной гиперплазии и раке предстательной железы
Рак предстательной железы (РПЖ) является вторым по заболеваемости и третьим по смертности среди злокачественных опухолей у мужчин в России. При диагностике РПЖ на стадии III-IV 5-летняя выживаемость составляет около 30%, в то время как 5-летняя выживаемость при диагностике на стадии I-II приближается к 100%. В России РПЖ диагностируется на стадии I-II примерно в половине случаев, что делает актуальным раннюю диагностику РПЖ, в том числе дифференциальную диагностику с доброкачественной гиперплазией предстательной железы (ДГПЖ), что позволит улучшать исходы и выживаемость при РПЖ.
Стандартная программа скрининга при РПЖ включает в себя метод пальцевого ректального исследования и определение простатического специфического антигена (ПСА) в крови. Пальцевое ректальное исследование является субъективным методом, результат которого во многом зависит от опыта проводящего исследователя. ПСА может повышаться при неопухолевой патологии предстательной железы, кроме того, существует значимая доля случаев РПЖ без повышения ПСА. Данные факты делают актуальным поиск новых малоинвазивных маркеров для диагностики РПЖ.
Были опробованы методы диагностики на основе различных фракций ПСА и его производных или предшественников, в той или иной мере улучшающие результаты диагностики. Также изучены другие молекулярные и молекулярно-генетические маркеры РПЖ, например, представители семейства калликреинов, простатический специфический мембранный антиген, антиген стволовых клеток предстательной железы и другие. Тем не менее, данные маркеры не получили широкого распространения в диагностическом процессе, что сохраняет актуальность дальнейшего поиска маркеров.
Перспективной группой молекулярно-генетических маркеров являются микроРНК. Данные некодирующие молекулы РНК имеют длину в среднем 22 нуклеотида и способны внутриклеточно регулировать экспрессию не менее 60% генов человеческого генома. При этом существует возможность как активного, так и неспецифического попадания микроРНК во внеклеточное пространство и далее в жидкие среды организма, где микроРНК сохраняются стабильными в течение длительного времени и могут сложить маркерами заболеваний. Для микроРНК при РПЖ была показана корреляция с наличием опухоли, её гистологическими характеристиками, прогрессией, метастазированием, восприимчивостью к лечению, прогнозом. Однако результаты данных исследований имеют низкую согласованность, что может объясняться отсутствием стандартизации протоколов получения биологического материала, анализом ограниченного спектра из известных микроРНК и популяционными различиями. Данные факты делают актуальными продолжающиеся исследования профиля микроРНК при патологиях предстательной железы и выработку новых диагностических панелей.
На профиль микроРНК в плазме крови может влиять разрушение различных клеточных элементов и высокий уровень остаточных фрагментов клеток, тромбоцитов и мелких мембранных везикул. Данные факторы в свою очередь зависят от таких моментов, как ускорение при центрифугировании и количество последовательных этапов центрифугирования, скорость разгона и торможения центрифуги, температура, поддерживаемая при выделении плазмы крови. В результате анализа влияния данных факторов на уровень гемоглобина, микрочастиц и свободной ДНК была разработана оптимальная методика получения плазмы крови, позволяющая минимизировать разрушение клеточных элементов крови: первый этап центрифугирования при 2000 g в течение 10 минут с последующим переносом верхней фазы в новую пробирку, затем второй этап центрифугирования при 4000 g с отбором всей плазмы кроме 10% объема у дна пробирки. Все этапы проводятся при средней скорости разгона и торможения центрифуги и комнатной температуре.
Было проведено исследование корреляции уровня различных микроРНК плазмы крови с концентрацией гемоглобина как показателя гемолиза. Выявлено 110 микроРНК, достоверно коррелировавших с уровнем гемоглобина, из них наибольшие коэффициенты корреляции наблюдались для 9 микроРНК. Среди них взаимосвязь микроРНК hsa-miR-107, hsa-miR-106a-5p, hsa-miR-17-5p, hsa-miR-93-5p и hsa-miR-20b-5p с гемолизом выявлена впервые. Достоверная корреляция ограниченого спектра микроРНК с гемолизом позволяет либо исключать данные микроРНК из анализа профиля микроРНК плазмы крови при различных патологиях, либо учитывать их с введением поправочного коэффициента.
При изучении профиля микроРНК здоровых добровольцев с помощью микрочипов Affymetrix GeneChip miRNA 4.0, охватывающих все известные микроРНК из базы данных miRBase v.20, был определен фоновый уровень экспрессии на чипах для образцов плазмы, равный 1,49 в логарифмической шкале. Среди 20 наиболее представленных микроРНК плазмы крови здоровых добровольцев 10 оказались выявлены в плазме впервые. Примерно 30% выявленных микроРНК плазмы здоровых людей оказались закодированными в миртронах, то есть генах микроРНК, локализованных в коротких интронах других генов. Учитывая, что миртронами кодируется около 15% микроРНК человека, обогащение данной группы микроРНК в плазме крови может указывать на существование специфических механизмов секреции, возможно, основанных на разнице в механизмах процессинга миртронов и «канонических» микроРНК.