Введение к работе
Актуальность проблемы
Одной из основных задач современной онкологии является изучение наиболее опасного свойства злокачественных опухолей – способности к инвазии и метастазированию. Разрушение стабильной межклеточной адгезии и приобретение способности к миграции играет существенную роль в развитии инвазивного потенциала трансформированных эпителиоцитов. В настоящее время общепринятой точкой зрения является представление о том, что программа эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), при которой дифференцированные эпителиальные клетки превращаются в фибробластоподобные клетки, способные к миграции, является основным механизмом эволюции клеток карцином. Угнетение экспрессии Е-кадхерина и связанное с этим разрушение межклеточной адгезии часто рассматривается как пусковой механизм инвазии и диссеминации опухолевых клеток. Вместе с тем хорошо известно, что ряд карцином человека, в частности, протоковые карциномы молочной железы, карциномы толстой кишки, меланомы могут сохранять экспрессию Е-кадхерина (Gillett et al., 2001, Hegerfeldt et al., 2002). Показано также, что опухолевые клетки способны к миграции и инвазии и в отсутствие ЭМП (Tarin et al., 2005, Wicki et al., 2006, Wolf et al., 2007), что свидетельствует о возможности существования механизмов запуска инвазии, не связанных с угнетением экспрессии и аккумуляции на мембране Е-кадхерина. Несмотря на то, что значительное количество исследований посвящено изучению Е-кадхерина как опухолевого супрессора, до сих пор остается недостаточно исследованным вклад межклеточных адгезионных контактов (АК), образованных Е-кадхерином, в реализацию миграционной активности трансформированных эпителиоцитов. В настоящее время появились новые возможности видеомикроскопических исследований живых клеток, позволяющие детально изучить изменения межклеточных взаимодействий при неопластической трансформации.
Также весьма важным представляется изучение функциональной роли структур актинового цитоскелета, которые, как известно, в значительной степени определяют морфологию, локомоторные и адгезивные характеристики клеток. Хорошо известно, что неопластическая трансформация может приводить к кардинальным изменениям актинового цитоскелета. Детальное исследование перестроек актинового цитоскелета в трансформированных эпителиальных клетках позволит прояснить их вклад в разрушение стабильной межклеточной адгезии и появление у эпителиальных клеток способности перемещаться на значительные расстояния. Сравнительные исследования перестроек актинового цитоскелета, АК, характера межклеточных взаимодействий при трансформации эпителиальных клеток помогут прояснить основные закономерности ранних этапов опухолевой прогрессии.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы было сравнительное исследование особенностей фенотипических изменений, закономерностей межклеточных взаимодействий и миграционной активности эпителиоцитов линий IAR, сохранивших или утративших экспрессию Е-кадхерина в результате трансформации.
Задачи исследования:
-
Исследовать особенности морфологических изменений Ras-трансформированных производных эпителиоцитов линии IAR-2, как сохранивших, так и утративших экспрессию Е-кадхерина, а также эпителиоцитов IAR после трансформации химическими канцерогенами либо претерпевших спонтанную трансформацию.
-
Изучить перестройки актинового цитоскелета в трансформированных эпителиоцитах IAR.
-
Изучить изменения спектра экспрессируемых кадхеринов, исследовать организацию межклеточных адгезионных контактов и их связь со структурами актинового цитоскелета в трансформированных эпителиоцитах IAR.
-
Провести сравнительные видеомикроскопические исследования псевдоподиальной активности при межклеточных взаимодействиях в культурах нетрансформированных и трансформированных эпителиоцитов IAR.
-
Исследовать изменения плотных контактов при трансформации эпителиоцитов IAR.
-
Исследовать локомоторную активность трансформированных эпителиоцитов IAR на двумерном субстрате и миграционную активность в миграционных камерах.
-
Оценить влияние экспрессии экзогенного Е-кадхерина на морфологию, адгезионные характеристики и локомоторную активность трансформированных эпителиоцитов IAR.
Научная новизна и практическая значимость работы
В представленной работе при исследовании культур эпителиоцитов линий IAR, трансформированных мутантным онкогеном RAS и химическими канцерогенами, было показано, что неопластическая трансформация вызывает два типа морфологических изменений: 1) классический ЭМП, при котором эпителиальные клетки приобретают фибробластоподобный фенотип и утрачивают экспрессию Е-кадхерина; 2) морфологическую трансформацию, при которой клетки частично сохраняют эпителиальные характеристики, растут в культуре в виде монослоя и формируют Е-кадхерин-содержащие АК.
Впервые обнаружено, что исчезновение типичного для эпителиоцитов краевого актинового пучка в трансформированных эпителиоцитах изменяет характер межклеточных взаимодействий, вызывая угнетение контактного паралича псевдоподиальной активности и разрушая стабильную межклеточную адгезию.
Впервые обнаружены изменения пространственной организации Е-кадхерин-содержащих АК эпителиоцитов IAR-6-1 и IAR1170 в результате трансформации: непрерывные тангенциальные АК, характерные для нетрансформированных эпителиоцитов, замещаются точечными и радиальными контактами, ассоциированными с прямыми актиновыми пучками. Впервые обнаружена реорганизация плотных контактов в трансформированных эпителиоцитах IAR.
Впервые установлено, что присутствие Е-кадхерина в АК трансформированных эпителиоцитов влияет на характер их миграции: клетки IAR1170 и IAR-6-1, сохранившие Е-кадхерин в АК, могут мигрировать как индивидуально, так и коллективно, тогда как клетки IAR1162, утратившие экспрессию Е-кадхерина, способны лишь к индивидуальной миграции. Показано, что экспрессия экзогенного Е-кадхерина в клетках IAR1162 частично восстанавливала эпителиальный фенотип, а также способствовала появлению у клеток способности к коллективной миграции.
Изучение механизмов функциональной взаимосвязи реорганизации актинового цитоскелета и АК при неопластической трансформации эпителиоцитов, изменяющей межклеточные взаимодействия и приводящей к разрушению стабильной межклеточной адгезии и миграционной активности, расширяет наши представления о закономерных измениях, происходящих в трансформированных клетках на ранних этапах инвазии и метастазирования. Флуоресцентно-микроскопическое исследование пространственной организации АК в клетках опухолей может помочь в выявлении первых признаков их злокачественного перерождения.
Апробация работы
Диссертация апробирована на совместной научной конференции лаборатории механизмов канцерогенеза, лаборатории генетики опухолевых клеток и лаборатории механизмов химического канцерогенеза НИИ канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН 30 сентября 2010 г.
Материалы диссертационной работы были представлены на конференциях «Петровские чтения 2008» (Санкт-Петербург, 2008); II московской региональной научно-практической конференции (с международным участием) «Цитометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2009); 13-й международной пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2009); школе-семинаре по проблемам организации внутриклеточного транспорта, цитоскелета и путей передачи сигнала (Санкт-Петербург, 2009); международном симпозиуме "Biological motility: from fundamental achievements to nanotechnologies" (Пущино, 2010).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 6 работ.
Структура и объем работы
Диссертационная работа изложена на 127 страницах, содержит 46 рисунков и 3 таблицы и состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы», который включает 285 цитируемых источников.