Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1 Происхождение гастроинтестинальных стромальных опухолей (ГИСО) 11
1.2 Принципы терапии ГИСО 20
1.2 Механизмы резистентности ГИСО к иматинибу 31
Глава 2. Материалы и методы исследования 37
2.1. Объект и предмет исследования 37
2.2. Хранение, культивирование и пассирование клеточных культур 38
2.3. Анализ экспрессии белков методом вестерн-блоттинг (иммуноблоттинг) 40
2.4. Оценка жизнеспособности клеток с помощью МTS-теста 53
2.5 Оценка эффективности гомологичной рекомбинации с помощью проточной цитофлюореметрии 56
2.6 Многопараметрический анализ клеточных культур в режиме реального времени с помощью системы RTCA iCELLigence 58
2.7 Анализ экспрессии генов с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени 59
Глава 3. Результаты собственных исследований 63
3.1 Состояние систем репарации повреждений ДНК в клетках ГИСО 63
3.2 Чувствительность клеток ГИСО к ингибиторам ДНК-топоизомеразы II типа .68
3.3 Изучение иматиниб-индуцированной сенситизации клеток ГИСО к ингибиторам ДНК-топоизомеразы II типа 77
3.4 Механизмы чувствительности иматиниб-резистентных клеток ГИСО к ингибиторам ДНК-топоизомеразы II типа 85
3.4.1 Роль АВС-транспортеров в химиорезистентности клеток ГИСО 85
3.4.2 Изменение уровня экспрессии генов, репарирующих повреждения ДНК, при развитии химиорезистентности клеток ГИСО 94
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 99
Выводы 114
Заключение 115
Практические рекомендации 118
Список сокращений 119
Список литературы 121
Примечание 148
- Происхождение гастроинтестинальных стромальных опухолей (ГИСО)
- Механизмы резистентности ГИСО к иматинибу
- Чувствительность клеток ГИСО к ингибиторам ДНК-топоизомеразы II типа
- Изменение уровня экспрессии генов, репарирующих повреждения ДНК, при развитии химиорезистентности клеток ГИСО
Происхождение гастроинтестинальных стромальных опухолей (ГИСО)
Гастроинтестинальные стромальные опухоли (ГИСО) представляют собой мезенхимальные опухоли, которые могут обнаруживаться по всему желудочно кишечному тракту (ЖКТ) [13, 16]. Первые данные о мезенхимальных опухолях ЖКТ были опубликованы в 1960 году в статье Джозефа Мартина (Martin J.F.) и соавторов о шести случаях «интрамуральных миоидных опухолей» желудка, где было описано их гладкомышечное происхождение [149, 257]. В 1962 году Стаутом (Stout A.P.) был введен термин «лейомиобластома» для описания группы причудливых опухолей гладкой мускулатуры желудка [149, 230]. С тех пор для описания таких веретеноклеточных и эпителиоидных опухолей, возникающих на всем протяжении ЖКТ, а также в сальнике и брыжейке, использовалось огромное количество названий, таких как гастроинтестинальные саркомы, гастроинтестинальные лейомиомы, лейомиосаркомы, лейомиобластомы, плексосаркомы и злокачественные гистиоцитомы.
В 1980-х годах детальное гистологическое исследование опухолей стенки желудка выявило существенную вариабельность в иммуногистохимического окрашивания данных новообразований [166, 169]. В то время как типичные лейомиомы выражали традиционные маркеры гладких мышечных клеток, таких как десмин и гладкомышечный актин, а шванномы имели тенденцию экспрессировать маркер S100 протеин, группа опухолей (впоследствии определенная как ГИСО) редко экспрессировала десмин, тогда как экспрессия актина сильно варьировала. Существенная гетерогенность новообразований поставила под сомнение единое происхождение данных опухолей, и указывала на возможность того, что данный тип новообразований являет собой, во всей видимости, отдельную нозологическую группу. Для описания данного вида опухолей Мазуром (Mazur M.T.) и Кларком (Clark H.B.) в 1983 году был введен термин «gastrointestinal stromal tumor» (GIST) (гастроинтестинальная стромальная опухоль, ГИСО) [8, 149, 166, 169].
До 1990 года дифференциальная диагностика неэпителиальных опухолей ЖКТ была весьма затруднительной, вследствие чего, ГИСО довольно часто классифицировали как лейомиомы, лейомиосаркомы, нейрофибромы и шванномы, которые также могли содержать признаки гладкомышечной и нейрогенной дифференцировки [166, 169]. С развитием иммунологии, открылись возможности иммунофенотипирования опухолевых клеток по представленным на клеточных мембранах молекулам – CD-маркёрам (англ. cluster of differentiation, cluster designation; сокращённо CD). Данная система была предложена еще в 1982 году для идентификации и исследования поверхностных мембранных белков лейкоцитов [51]. В 1995 году Миттененом (Miettinen) и его коллегами было обнаружено, что до 70% ГИСО окрашивались положительно по CD34, являющемуся, как известно, маркером миелоидных клеток-предшественников, эндотелиальных клеток и фибробластов [76, 170]. Это позволило дифференцировать ГИСО от истинных лейомиом и шванном, которые являются CD34-негативными. Выявляемость CD34 у ГИСО составляет от 46 до 100%, в зависимости от места возникновения опухоли [170, 173]. Наименьшая экспрессия CD34 была выявлена у ГИСО тонкого кишечника [170]. Несмотря на важность открытия данного иммуногистохимического маркера ГИСО, позволившего в ряде случаев дифференцировать данный тип новообразований, существовала достаточно большая группа ГИСО (до 40% случаев), не экспрессировавшая данный маркер.
Революционный прорыв в понимании патогенеза ГИСО был осуществлен в 1998 году. Хирота (Hirota S) с соавторами опубликовали статью «Доминантно негативные мутации c-kit при гастроинтестинальных стромальных опухолях у человека» [76, 105]. Авторами было обнаружено несколько важных особенностей, которые позволили выяснить происхождение ГИСО, а также существенным образом изменить методы диагностики и терапии больных с ГИСО. Во-первых, среди 58 исследованных опухолей мезенхимального происхождения в 49 случаях было обнаружено положительное иммуногистохимическое окрашивание по маркеру CD117. В то же время, в лейомиомах и шванномах экспрессия CD117 не выявлялась. Кроме того, в 78% случаях в “потенциальных ГИСО” был выявлен факт ко-экспрессии CD117 и CD34. В это же время Сарломо-Рикали (Sarlomo-Rikali) и его коллеги также обнаружили, что около 95% ГИСО окрашивались на маркер CD117 [52]. Другие значимые иммуногистохимические маркеры для ГИСО включали CD34 (70%), гладкомышечный актин (35%), S-100 протеин (10%) и редко десмин (5%) [64]. В 2004 г. Вестом (West RB) и его коллегами был обнаружен новый маркер – DOG-1, который является трансмембранным белком, обеспечивающим кальций-зависимый транспорт ионов хлора [174, 248]. Иммуноокрашивание на белок DOG1 составляет 97,8 % всех ГИСО, он более чувствительный и специфичный, чем CD117, и выявляется также в CD117-негативных опухолях с мутацией PDGFRA [24, 73, 248]. Из всех случаев, окрашенных на CD117 и DOG-1, 98,4% были положительными по меньшей мере для одного из этих маркеров, предполагая, что сочетание иммуноокрашивания на CD117 и DOG1 является достаточным для подтверждения гистологического диагноза ГИСО [77]. Кроме того, DOG-1 экспрессирован в 36% случаев CD117-отрицательных опухолей ГИСО, что дает возможность для правильной идентификации редких подгрупп ГИСО [72, 174]. В настоящее время известен также и другой маркер – протеинкиназа C theta (PKCheta), который также выявляется при CD117-отрицательных опухолях, что позволяет верифицировать ГИСО среди других мезенхимальных новообразований ЖКТ [86, 214]. Тем не менее, данный маркёр имеет меньшую специфичность по сравнению с DOG1.
Во-вторых, при сравнительной оценке экспрессии маркеров CD117 и CD34 в клетках ГИСО и интерстициальных клетках Кахала (ИКК) (the interstitial cells of Cajal (ICCs)) было обнаружено, что эти клетки имеют общий фенотип (CD117 и CD34) и морфологическое сходство. ИКК – это пейсмекерные клетки, расположенные в циркулярном мышечном слое ЖКТ. Эти клетки открыты в 1911 г. испанским патологом С. Р. Кахалем, лауреатом Нобелевской премии 1906 г. [144]. Хёйзинг (Huizinga J.D) и соавторы в 1995 году показали, что у мышей с мутацией KIT имеются признаки нарушений развития сети интерстициальных клеток Кахаля, которая связана с Ауэрбаховским нервным сплетением [42, 103].
Данный факт указывал на то, что ИКК экспрессируют тирозинкиназный рецептор KIT. ИКК задают нормальный ритм спонтанной перистальтики в различных отделах ЖКТ путем передачи медленных электрических потенциалов на гладкую мышечную ткань. Именно через ИКК происходит регуляция перистальтики кишечника вегетативной нервной системой. Результаты сравнительного иммуногистохимического анализа позволили предположить, что ГИСО развивается из ИКК или их плюрипотентных клеток-предшественников [12]. Так как именно активация KIT-сигнального пути клеточной пролиферации определяет дальнейшую дифференцировку мезенхимальных клеток-предшественников в направлении ИКК [41]. KIТ экспрессируется не только клетками ГИСО и ИКК, но и нормальными клетками, такими как мастоциты, меланоциты, клетки Лейдига, сперматогонии, гемопоэтические стволовые клетки, и играет важную роль в меланогенезе, сперматогенезе и гемопоэзе [207]. Кроме того, экспрессия данного маркера наблюдается при мелкоклеточном раке легкого, ангиосаркоме, семиноме/дисгерминоме, саркоме Юинга, меланоме, глиоме, остром миелобластном лейкозе, раке яичников, нейробластоме за счет амплификации KIT. Однако эти опухоли редко приходится дифференцировать с ГИСО, так как они обладают достаточно специфичными гистологическими особенностями [17]. Кайндблум (Kindblom) и его коллеги также обнаружили, что 100% всех ГИСО были положительными на CD117 и предположили, что ГИСО могут возникать из стволовых клеток, которые дифференцируются в последующем в ИКК [107]. Они предложили изменить название со стромальных опухолей на опухоли клеток пейсмекеров ЖКТ (gastrointestinal pacemaker cell tumors, GIPACT), чтобы отразить их предполагаемое происхождение, однако это название не прижилось. Авторами также было обнаружено, что «истинные» лейомиомы и шванномы не экспрессируют CD117.
В-третьих, Хирота и его коллеги выявили, что 5 из 6 образцов опухолей ГИСО имеют мутации в протоонкогене c-kit, которые приводят к лиганд-независимой, конститутивной активации тиразинкиназного рецептора KIT [76, 105].
Механизмы резистентности ГИСО к иматинибу
В настоящее время установлено, что молекулярно-генетические различия ГИСО могут определять эффективность таргетной терапии ИМ (Табл. 1.). Например, наиболее высокая чувствительность к ИМ соответствует опухолям с первичными мутациями KIT в 11 экзоне, меньшая в 9-м экзоне, что требует 2-х кратного повышения суточной дозы ИМ (400 мг 2 раза в сут – см. ниже), а резистентность к ИМ доказана для ГИСО с «диким типом» KIT и PDGFRА, что является распространенным для ГИСО детского возраста [210, 253].
Как описывалось выше, несмотря на высокую эффективность ИМ в терапии пациентов с ГИСО, более чем у половины больных после проведения непрерывной таргетной терапии в течения 2-х лет развивается резистентность к ИМ [212]. В настоящее время в практической онкологии принято разделять первичную и вторичную резистентность ГИСО к ИМ. Первичная резистентность (ПР) определяется как прогрессирование процесса в течение первых 6 месяцев непрерывного применения ИМ. Около 10-14% пациентов с ГИСО не наблюдается положительного терапевтического ответа на таргетную терапию ИМ [64, 111]. Как уже было отмечено выше, ПР к ИМ во многом связана с молекулярно генетическими особенностями ГИСО [66, 151, 153]. Наиболее распространенными мутациями, обуславливающими ПР к ИМ, являются мутации в 9 экзоне KIT (большинство из которых представляют собой внутреннее тандемное дублирование AY502-503) и в 18 экзоне PDGFRA (замена D842V) [171]. Если мутации обнаруживаются в 9 экзоне KIT, то положительный терапевтический ответ может быть достигнут за счет двукратного повышения дозы ИМ (до 800 мг/сут), в то время как для других пациентов с ПР (дикий типа KIT, мутации PDGFRA) данный подход не является эффективным [151, 190]. Мутации SDH, кодирующего комплекс субъединиц сукцинатдегидрогеназы, NF1 (нейрофибромина 1), протоонкогена B-raf (BRAF), «эпимутации» (обусловленные эпигенетической изменчивостью) SDHC и более редкие мутации, включая PI3K3CA, CBL и KRAS, также приводят к ПР ГИСО к ИМ [54, 212]. Поэтому для таких пациентов необходима другая терапевтическая тактика, и использование ингибиторов BRAF, MEK и VEGFR было бы логичным альтернативным вариантом. Следует выделить, что мутации KIT, PDGFRA и BRAF являются взаимоисключающими [261]. ГИСО c мутацией BRAF являются высокозлокачественным, чаще обнаруживаются в тонкой кишке и составляют менее чем 1% случаев всех ГИСО [183, 6].
Вторичная резистентность (ВР) определяется как развитие устойчивости к ИМ при непрерывном приёме ИМ с положительным терапевтическим ответом в начале терапии (более 6 месяцев) [261]. ВР, как правило, развивается в результате приобретенных (вторичных) мутаций KIT или PDGFRA [21, 34, 104, 132, 157, 171, 212]. Вторичные мутации KIT обнаруживаются чаще всего в двух ТК-х доменах внутриклеточной киназной области [6]. Первый находится в АТФ-связывающем домене (ТК1), который предотвращает связывание с ИМ (экзоны 13 (V654A) и 14 (T670I, T701I)), а второй – в тирозинкиназном домене (ТК2), что приводит к стабилизации рецептора KIT в активной конформации и препятствию взаимодействия его с ИМ (экзоны 17 (D816A/G/H/V, D820A/E/G/Y, Y823D) и 18 (D842V)) [82, 171]. Мутации KIT в 17 экзоне составляют до 40% от всех вторичных мутаций KIT, которые обуславливают устойчивость ко всем новым ИТК, таких как сунитиниб, дазатиниб, сорафениб и нилотиниб. Реже вторичные мутации KIT обнаруживаются в 15 и 16 экзонах, кодирующих киназную вставку [223].
Важно подчеркнуть наличие молекулярно-генетической гетерогенности между первичными ГИСО и их метастазами, развивающимися на фоне непрерывного применения ИМ. Поэтому эти различия могут повлиять на эффективность дальнейшей таргетной терапии, вследствие развития ВР как материнской опухоли, так и ее метастазов [125, 157, 171, 205]. Лигл (Liegl) с соавт. при изучении мутационного статуса KIT и PDGFRA в 53 метастазах ГИСО, полученных от 14 пациентов, прогрессировавших на фоне лечения ИМ или сунитинибом и получивших в последующем хирургическую дебуляцию, подтвердил гетерогенность мутаций в первичном очаге ГИСО и ее метастазах. Было выявлено, что 11 из 14 пациентов (79%) имеют первичные мутации KIT, из них 9 (83%) – вторичные мутации KIT, причем 6 (67%) из 9 имеют от 2 до 5 различных вторичных мутаций в отдельных метастазах и трое (34%) – 2 вторичные мутации KIT в тех же метастазах. При проведении FISH-анализа было обнаружено, что в 2 из 10 метастазов, не имеющих вторичных мутаций KIT произошла амплификация KIT. Таким образом, была доказана обширная внутриклональная и межклональная гетерогенность мутаций и амплификация KIT и PDGFRA, ответственных за развитие устойчивости к ИМ у пациентов с прогрессирующими ГИСО [125].
ВР клеток ГИСО к ИМ может быть обусловлена не только вторичными мутациями KIT и PDGFRA, но и потерей экспрессии KIT в сочетании с гиперэкспрессией альтернативных рецепторных и не рецепторных ТК (MET, AXL, FGFR2, FAK и др.). Например, Сакомото (Sakamoto K) и его коллеги обнаружили потерю экспрессии KIT в клетках ГИСО в 7 из 33 случаев. Важно отметить, что в 4 из 7 случаев не применялась терапия ИТК, т.е. потеря экспрессии KIT была спонтанной, что свидетельствовало о новом механизме ПР к ИМ. В остальных случаях была выявлена гиперэкспрессия альтернативных ТК, таких как PDGFRB, MET или EGFR, участвующих в регуляции пролиферации, апоптоза опухолевых клеток, а также их чувствительности к лекарственной терапии, что могло привести к развитию альтернативных механизмов резистентности к ИМ, обуславливая тем самым прогрессирование опухоли [140, 203]. К ВР ГИСО к ИМ могут также способствовать вторичные мутации BRAF [183].
Рецепторная ТК MET, кодирующаяся протоонкогеном MET, принимает участие в канцерогенезе, ангиогенезе и метастазировании опухоли. Связывание МЕТ со своим лигандом – фактором роста гепатоцитов (hepar grow factor, HGF) фосфорилирует фосфатидилинозитол-3-киназу (PI3K), митоген-активированную протеинкиназу (MAPK), Янус-киназу, сигнал трансдукции и активации транскрипции (JAK-STAT), Src-сигнальные пути трансдукции. Важно подчеркнуть, что все выше перечисленные сигнальные пути находятся ниже KIT. Коен (Cohen N.A.) и соавт. обнаружили низкую экспрессию KIT и PDGFRА в сочетании с гиперэкспрессией фосфорилированных MET (причем, без гиперпродукции HGF) и AXL в клетках ГИСО с резистентностью к ИМ [193].
AXL (от греч. аnexelekto – неконтролируемый) является также рецепторной ТК [161]. Махадеван (Mahadevan D.) c соавт. выявили, что ИМ-резистентные ГИСО развили устойчивость к ИМ за счет так называемого «киназного переключения», т.е. потери экспрессии KIT и одновременно гиперэкспрессии AXL. Полученные результаты молекулярного докинга с использованием гомологичных моделей доменов MET и AXL доказали, что ИМ не связывается с этими рецепторными тирозинкиназами, чем и обуславливает устойчивость к ИМ [26].
FAK является не рецепторной ТК, которая активируется в результате аутофосфорилирования по остаткам Tyr в положении 397. Обнаружено, что повышение экспрессии FAK наблюдается в высоко-злокачественных ГИСО и коррелирует с частотой рецидивирования заболевания. Кроме того, активация FAK сигнального пути ассоциировано с устойчивостью к ИМ при мутации KIT в 17 экзоне, но не в 11 экзоне. Результаты Такахаши (Takahashi T.) и его коллег показали, что ИМ привел к активации FAK в ИМ-чувствительных клетках ГИСО с мутацией KIT в 11-ом экзоне. Поэтому применение FAK-ингибитора TAG372 или siRNA у этих клеток снижает их жизнеспособность под влиянием ИМ [178]. Отечественной научной группой [25] были изучены механизмы ВР ГИСО к ИМ. Для этого был выделен ИМ-резистентный субклон из ИМ-чувствительной опухолевой линии ГИСО для сравнительного анализа мутационного статуса и уровня экспрессии KIT и альтернативных ТК. Молекулярное исследование KIT не выявило наличия вторичных мутаций. Однако сравнительный анализ уровня экспрессии рецепторных ТК у ИМ-чувствительных и резистентных клетках ГИСО выявил существенные различия. У ИМ-резистентной клеточной линии обнаружена потеря экспрессии фосфорилированных форм KIT (pKIT) и PDGFRA (pPDGFRA) в сочетании с гиперэкспрессией фосфорилированной формы тирозинкиназного рецептора фактора роста фибробластов-2 (pFGFR2). Важно выделить, что использование селективного ингибитора FGFR-сигнального пути BGJ398, приводило к повышению чувствительности ИМ-резистентного субклона ГИСО к ИМ. Данный эффект был получен как в экспериментах in vitro, так и in vivo с использованием ксенографтных моделей [237]. Важно подчеркнуть, что комбинированное применение ИМ и BGJ398 приводило к замедлению роста ИМ-резистентных ксенографтных опухолей ГИСО и индуцировало апоптоз. Примечательно, что при воздействии ИТК в отдельности не было выявлено аналогичного эффекта. Следовательно, эти результаты также показывают, что развитие ВР клеток ГИСО к ИМ было обусловлено «киназным переключением», т.е. потерей экспрессии pKIT и pPDGFRA и активацией FGFR-сигнального пути, приводящей к последующей клеточной пролиферации.
Чувствительность клеток ГИСО к ингибиторам ДНК-топоизомеразы II типа
На основании полученных данных, свидетельствующих о гиперэкспрессии топоизомеразы II типа в клетках ГИСО, были проведены исследования по изучению чувствительности клеток ГИСО к химиопрепаратам, оказывающим ингибирующее действие на данный фермент.
Известно, что топоизомеразы представляют собой класс внутриядерных ферментов – изомераз, влияющих на топологию ДНК (трехмерную структуру). Топоизомеразы способны релаксировать сверхспирализованные молекулы ДНК путём внесения одно- (топоизомераза I типа) или ДНР (топоизомераза II типа) с последующим восстановлением. Таким образом, топоизомеразы играют важную роль в процессах репликации и транскрипции, облегчая раскручивание цепей двунитевой ДНК.
Ингибиторы ДНК-топоизомеразы II типа стабилизируют «расщепляемый комплекс» ДНК-фермент, что приводит к возникновению ДНР ДНК, без последующего восстановления, которое ведет к фрагментации ДНК и неминуемой гибели клеток. К ингибиторам ДНК-топоизомеразы II типа относятся две группы цитотоксических препаратов: эпиподофиллотоксины и антрациклины. Основным представителем эпиподофиллотоксинов является этопозид – полусинтетический производный природного подофиллотоксина. Этопозид угнетает способность топоизомеразы II типа восстанавливать ДНР ДНК, блокируя продвижение клетки в фазе G2 клеточного цикла и задерживая, тем самым, их вступление в митоз.
Одним из часто применяемых в практической онкологии антрациклинов является доксорубицин. Доксорубицин — это полусинтетический противоопухолевый антибиотик, получаемый из стрептомицетов, который не только угнетает топоизомеразу II типа, но и приводит к одно- и двухэлектронному окислению. В результате этого образуются свободные радикалы, в частности, гидроксильные, которые обладают высокой цитотоксичностью. Клетки чувствительны к препарату в S- и G2-фазах. Учитывая вышеизложенное, было проведено изучение чувствительности клеток ГИСО к этопозиду и доксорубицину. Исследования проводили как на ИМ-чувствительной (GIST1), так и на ИМ-резистентной линиях ГИСО (GIST 430).
Цитотоксичность этопозида и доксорубицина определяли методом колориметрического МТS-теста с последующим вычислением значений концентраций полумаксимального ингибирования (IC50). В качестве маркеров апоптоза использовали изменения в уровнях экспрессии расщепленных форм поли-(АДФ-рибозы)-полимеразы (ПАРП) и каспазы-3. Маркером ДНР ДНК являлась фосфорилированная по остаткам серина в положении 139 форма гистона 2A - -H2AX, а маркерами репарации этих повреждений ДНК – pATM Ser1981 и рекомбиназа Rad51. Уровень экспрессии данных маркеров оценивали методом иммуноблоттинга с использованием соответствующих моноклональных антител.
Было выявлено, что ингибиторы ДНК-топоизомеразы II типа (этопозид и доксорубицин) обладают выраженным дозо-зависимым цитотоксическим эффектом как в отношении ИМ-чувствительной (GIST T-1), так и ИМ-резистентной (GIST430) клеточной линии (Рис. 5, А и Б).
Примечательно, что чувствительность ИМ-резистентной линии ГИСО к ингибиторам ДНК-топоизомеразы II типа была значительно менее выражена по сравнению с ИМ-чувствительной линией ГИСО. Например, значения IC50 для этопозида составили 101,28±3,36 и 31,37±0,94 мкМ в отношении GIST 430 и GIST T-1, соответственно (Табл. 7). Аналогичным образом, было показана большая чувствительность клеток GIST-Т1 в отношении доксорубицина.
Было также обнаружено, что основным механизмом гибели клеток ГИСО под действием этопозида и доксорубицина являлся апоптоз, о чем свидетельствовало дозо-зависимое увеличение уровня экспрессии расщепленных форм ПАРП и каспазы-3.
Полученные данные коррелировали с вышеописанными результатами по изучению цитотоксичности ингибиторов ДНК-топоизомеразы II типа. Например, для индукции апоптоза в ИМ-резистентной линии ГИСО требовалось 4-кратное увеличение концентрации этопозида и доксорубицина по сравнению с ИМ-чувствительной линией ГИСО (Рис. 6, Б и А, соответственно). Обнаруженный факт вызывает безусловный интерес, и может свидетельствовать о развитии общих механизмов формирования устойчивости клеток ГИСО к действию таргетных и химиопрепаратов. Данные механизмы могут быть явиться следствием активации альтернативных сигнальных путей, не связанных с развитием вторичных мутаций KIT или PDFRA.
Индукция апоптоза в клетках ГИСО под влиянием ингибиторов ДНК-топоизомеразы II типа, являлась, по всей видимости, следствием образования ДНР ДНК, о чем свидетельствовало дозо-зависимое увеличение уровня экспрессии -Н2АХ (Рис. 6).
Образование ДНР ДНК в результате воздействия вышеуказанных химиопрепаратов сопровождалась активацией механизмов репарации повреждений ДНК. Например, было обнаружено, что уровень экспрессии маркера ДНР – -Н2AX в клетках GIST-Т1 и GIST 882 под действием доксорубицина коррелировал с повышением уровня экспрессии фосфорилированной (т. е. активированной) формы ATM-киназы (pATM Ser1981), являющейся, как известно, одной из ключевых киназ, фосфорилирующих Н2АX по серину в положении 139 и запускающих каскад реакций, направленных на остановку клеточного цикла и репарацию ДНР ДНК, в частности, путем гомологичной рекомбинации. (Рис. 7, А и Б). В пользу активации процессов репарации повреждений ДНК в клетках ГИСО также свидетельствовало значительное повышение уровня экспрессии рекомбиназы Rad51 после их инкубации с доксорубицином.
Несмотря на активацию в клетках ГИСО механизмов репарации ДНР ДНК, вызываемых ингибиторами ДНК-топоизомеразы II типа, по истечению 48 ч инкубации клеток с данным химиопрепаратом наблюдалась их гибель по механизму апоптоза, о чем свидетельствовало время-зависимое увеличение уровня экспрессии расщепленной формы ПАРП (Рис. 7). Известно, что расщепленные фрагменты ПАРП (например, 86 и 24 кДа) появляются в результате ферментативной активности эффекторной каспазы-3, обуславливающей необратимость программированной клеточной гибели, и поэтому расщепленная форма ПАРП является общепризнанным маркером апоптоза.
В результате проведенных исследований было обнаружено ИМ-индуцированное повышение уровня экспрессии -Н2АХ в клетках ГИСО линий GIST-Т1 и GIST 882 (Рис. 7, А и Б, соответственно). Данный факт сопровождался также повышением уровня экспрессии фосфорилированной формы АТМ-киназы (pATM Ser1981), участвующий, как известно, в процессах фосфорилирования вышеуказанной формы гистона при различных состояниях, в том числе, при повреждениях ДНК. Тем не менее, ИМ индуцировал значимое и время-зависимое снижение уровня экспрессии рекомбиназы Rad51 в этих же экспериментальных условиях (Рис. 7), что могло свидетельствовать об ослаблении процессов гомологичной рекомбинации в клетках ГИСО под действием ИМ.
После обнаружения данного феномена, были предприняты эксперименты по изучению молекулярных механизмов ИМ-индуцированного снижения уровня экспрессии данного белка в клетках ГИСО. На первом этапе была исследована динамика изменений периода полу-жизни рекомбиназы Rad51 в клетках ГИСО, инкубированных в присутствии ингибитора белкового синтеза циклогексимида. Было обнаружено, что период полу-жизни данного белка составляет примерно 12 ч (Рис. 8, А). Примечательно, что при сочетанном инкубировании клеток ГИСО с циклогексимидом и ИМ наблюдалось сокращение периода полу-жизни данного белка до 6 ч (Рис. 8, Б).
Изменение уровня экспрессии генов, репарирующих повреждения ДНК, при развитии химиорезистентности клеток ГИСО
Меньшая чувствительность ИМ-резистентной линии ГИСО к химиопрепаратам группы ингибиторов ДНК-топоизомеразы II типа, по сравнению с ИМ-чувствительной линией ГИСО могла также явиться следствием активации репаративных процессов ДНК после генотоксического воздействия химиопрепаратов. Для проверки этой гипотезы был проведен сравнительный анализ генов, участвующих в различных путях сигнализации о повреждениях ДНК, ее репарации и регуляции клеточного цикла в обеих клеточных линиях GIST1 и GIST1-108R с помощью ПЦР. Для выполнения этой задачи был использован коммерческий набор для ПЦР Array Human DNA Damage Signaling Pathway (PAHS-029Z, SABiosciences, QIAGEN, Germantown, MD, США).
Из исследованных 84 генов сигнальных путей репарации повреждений ДНК и регуляции клеточного цикла было выявлено 19 генов, продемонстрировавших по меньшей мере 2-кратное различие в экспрессии генов между ИМ-чувствительными GIST1 и ИМ-резистентными GIST1-IM-108R клетками (Рис. 21). Например, в пути репарации ДНР два гена были умеренно ( 2 раза) повышены (Rad51, H2AFX), в то время как четыре гена были подавлены (ATM, HUS1, RBBP8 и XRCC2) в клетках GIST1-IM-108R по сравнению с материнской клеточной линией GIST1 (Табл. 10). Наиболее значительные различия в системах репарации повреждений ДНК касались MPG и XRCC3, которые были гиперэкспрессированы в клетках GIST1-IM-108R (соответственно 243 и 4473 раза). Известно, что XRCC3 кодирует членов семейства RecA/Rad51 ассоциированных белков, которые участвуют в гомологичной рекомбинации. Таким образом, гиперэкспрессия XRCC3 и Rad51 могут обуславливать пониженную чувствительность клеток GIST1-IM-108R к ингибиторам ДНК-топоизомеразы II типа в виду эффективной репарации ДНР, вызванных этими химиопрепаратами.
В то же время мы обнаружили значительное (82-кратное) снижение экспрессии FANCA в клетках GIST1-IM-108R по сравнению с клеточной линией GIST. Известно, что белки FANCA восстанавливают перекрестные сшивки между цепями ДНК и поддерживают стабильность хромосом. Следовательно, подавление экспрессии FANCA указывает на потенциальную чувствительность ИМ-резистентного субклона GIST1-IM-108R к ДНК-сшивающим агентам из-за дефектного FANC-ассоциированного пути восстановления ДНК.
Мы также обнаружили значительное (44-кратное) снижение экспрессии CDKN1A в клетках GIST1-IM-108R по сравнению с материнским клоном GIST1. CDKN1A (cyclin-dependent kinase inhibitor 1A) известен как мощный ингибитор циклинзависимой киназы, который опосредует p53-зависимый арест клеток в G1 фазе клеточного цикла в ответ на различные повреждения ДНК. Экспрессия TP73, участвующего в регуляции клеточного цикла, также была подавлена в более чем в 4 раза.
Таким образом, полученные нами данные по изучению уровня экспрессии генов, участвующих в репарации повреждений ДНК и регуляции клеточного цикла в клетках ГИСО, сформировавших устойчивость к ИМ свидетельствуют о:
A) изменениях в пути репарации ДНР ДНК, а именно повышении экспрессии Rad51 и H2AFX, участвующих в распознавании ДНР и инициации гомологичной рекомбинации, и в то же время подавление экспрессии AT, HUS1, RBBP8 и XRCC2 в клетках GIST1-IM-108R,
Б) гиперэкспрессии MPG, который участвует в распознавании повреждений оснований и инициирует их восстановление путем эксцизионной репарации основании, что может указывать на обилие такого рода повреждений в клетках GIST1-IM-108R,
B) гиперэкспрессии XRCC3, который кодирует членов семейства RecA/Rad51-ассоциированных белков и участвует в репарации ДНР ДНК путем гомологичной рекомбинации, что в совокупности с высокой экспресcией Rad51 может обуславливать пониженную чувствительность клеток GIST1-IM-108R к ингибиторам ДНК-топоизомеразы II типа в виду эффективной репарации ДНР, вызванных этими химиопрепаратами,
Г) подавлении экспрессии FANCA, что указывает на потенциальную чувствительность ИМ-резистентного субклона GIST1-IM-108R к ДНК сшивающим агентам из-за дефектного FANC-ассоциированного пути восстановления ДНК,
Д) снижении экспрессии CDKN1A и TP73, участвующих в аресте клеток с повреждениями ДНК в точках рестрикции клеточного цикла и запуска апоптоза, что может обуславливать устойчивость клеток GIST1-IM-108R к ДНК-повреждающим агентам, например, ингибиторам ДНК топоизомеразы II типа. Таким образом, развитие резистентности к ИМ в клетках GIST1-IM-108R сопровождалось изменениями в системах репарации повреждений ДНК и регуляции клеточного цикла, что делает клетки GIST1-IM-108R менее восприимчивыми к некоторым химиотерапевтическим агентам, в частности, к ингибиторам ДНК-топоизомеразы II типа.