Люминальный рак молочной железы. Клинические, молекулярно-биологические, генетические особенности и прогноз Рябчиков Денис Анатольевич

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1 Обзор литературы. Клиническая и молекулярно биологическая характеристика люминального рака молочной железы 19

1.1 Общая характеристика люминального рака молочной железы 19

1.2 Эстрогеновые рецепторы люминального рака молочной железы 30

1.3 Андрогенные рецепторы люминального рака молочной железы 33

1.4 Маркеры лекарственной резистентности рака молочной железы 36

1.5 Иммунобиология рака молочной железы 41

1.6 Диссеминированные опухолевые клетки в костном мозге больных раком молочной железы 42

1.7 Генетические маркеры рака молочной железы 44

Глава 2 Материал и методы исследования 48

2.1. Общая характеристика больных РМЖ 48

2.2 Вид и объем лечения больных РМЖ, включенных в исследование. 50

2.3 Методы исследований 55

2.4 Статистическая обработка результатов исследования 65

Глава 3 Результаты лечения люминального рака молочной железы 67

3.1 Сравнение результатов лечения различных молекулярных подтипов РМЖ 70

3.2 Отдаленные результаты лечения люминального РМЖ в зависимости от экспрессии Ki-67 81

3.3 Эффективность неоадьювантной терапии и отдаленные результаты лечения люминального РМЖ в зависимости от экспрессии маркера множественной лекарственной устойчивости Pgp-170 92

Глава 4 Результаты молекулярно-генетических исследований люминального рака молочной железы 106

4.1 Результаты молекулярно-генетических исследований парных образцов РМЖ и гистологически неизмененной ткани молочных желез 106

4.2 Результаты сравнения молекулярно-генетического статуса люминального и других молекулярных подтипов РМЖ 111

4.3 Результаты молекулярно-генетических исследований различных подтипов люминального РМЖ 116

4.4 Клинико-генетический статус люминального РМЖ 124

4.5 Результаты молекулярно-генетических исследований билатерального люминального РМЖ 131

4.6 Отдаленные результаты лечения люминального РМЖ в зависимости от его генетического статуса 132

Глава 5 Результаты иммунологических исследований люминального рака молочной железы 143

5.1 Взаимосвязь иммунофенотипа опухоли (экспрессия HLA-1, HLA-DR, CD-71) с субпопуляциями иммунокомпетентных клеток, инфильтрирующих люминальный РМЖ 144

5.2. Соотношения параметров миелограмм и уровней субпопуляций лимфоцитов костного мозга больных люминальным РМЖ 151

5.3 Взаимосвязь экспрессии антигенов HLA-1, HLA-DR, CD-71 и субпопуляций иммунокомпетентных клеток, инфильтрирующих опухоль, с параметрами миелограмм и уровнями субпопуляций лимфоцитов костного мозга больных люминальным РМЖ 154

5.4 Диссеминированные опухолевые клетки у больных люминальным РМЖ 160

Глава 6 Результаты исследования экспрессии андрогеновых и эстрогеновых рецепторов в люминальном раке молочной железы 166

6.1 Клинико-морфологические параметры люминального РМЖ и отдаленные результаты лечения в зависимости от экспрессии андрогеновых рецепторов 166

6.2 Клинико-морфологические параметры люминального РМЖ в зависимости от экспрессии эстрогеновых б- и в-рецепторов 179

Глава 7 Обсуждение результатов исследования 189

Выводы 218

Практические рекомендации 221

Список сокращений 222

Список литературы 224

• Общая характеристика люминального рака молочной железы
• Отдаленные результаты лечения люминального РМЖ в зависимости от экспрессии Ki-67
• Клинико-генетический статус люминального РМЖ
• Клинико-морфологические параметры люминального РМЖ в зависимости от экспрессии эстрогеновых б- и в-рецепторов

Введение к работе

Актуальность проблемы и степень ее разработанности

Рак молочной железы (РМЖ) занимает лидирующее место среди всех онкологических заболеваний у женщин в мире. По данным GLOBOCAN, ежегодная ожидаемая смертность в мире составляет более 450000 человек. Частота РМЖ в структуре мировой заболеваемости злокачественными опухолями достигает 25,2%, смертность — 14,7% (GLOBOGAN 2012; Аксель Е.М., 2014). За последние 10 лет ежегодный стандартизированный показатель прироста заболеваемости в России составил 1,8%; в 2015 г. зарегистрировано 66366 новых случаев — 20,8% всей опухолевой патологии у женщин (Министерство здравоохранения Российской Федерации, 2017). Точные механизмы возникновения РМЖ до сих пор не известны, поэтому результаты лечения остаются относительно удовлетворительными. Уже на ранних стадиях заболевания в крови и костном мозге некоторых пациентов обнаруживаются диссеминированные опухолевые клетки, которые могут стать источником метастазов даже после радикального комплексного и комбинированного лечения.

Исследования последних десятилетий свидетельствуют о гетерогенности РМЖ и
широком спектре его морфологических и иммунологических подтипов. Длительное
время заболевание классифицировали только по клинико-морфологическим параметрам.
С конца XX века для диагностики и выбора адекватного лечения используют
молекулярные и иммуногистохимические маркеры, включающие экспрессию
рецепторов эстрогенов, прогестерона, HER-2 и уровня пролиферативной активности Ki-
67, а также мутации генов (The Cancer Genome Atlas Network, 2012). Согласно
консенсусу, одобренному конференцией St. Gallen-2015, в настоящее время подтип
РМЖ можно определить с помощью мультипараметрических молекулярных тестов —
PAM-50 или Mamma Print/Blue Print. Однако в большинстве клиник мира проведение
таких исследований невозможно по логистическим и/или финансовым причинам,
поэтому необходимо продолжить поиск суррогатных гормональных,

иммуногистохимических, генетических и иммунологических маркеров прогноза и эффективности лечения РМЖ. В частности, это касается люминальных А и В подтипов РМЖ, которые диагностируют примерно у 70% больных. Их отличает экспрессия рецепторов эстрогенов и/или прогестерона и потенциальная чувствительность к

гормонотерапии (Russnes H., 2017; Семиглазов В.Ф., 2017). Однако, несмотря на относительно благоприятный клинический прогноз люминального РМЖ, у 10-20% больных в течение первого года адъювантной гормонотерапии тамоксифеном наблюдается прогрессирование заболевания и в дальнейшем данный показатель увеличивается до 20-40% (Кулигина Е., 2010, Семиглазов В.Ф. 2017).

В настоящее время нет общепринятых предикторов эффективности гормональной и химиотерапии РМЖ, поэтому сложно предугадать случаи низкой чувствительности и резистентности опухоли к лечению. Их причиной может быть фенотип множественной лекарственной устойчивости — перекрестная резистентность опухолевых клеток к различным лекарственным препаратам, несходным по химической структуре и механизму действия (Gottesman M.M., 2002). У больных РМЖ выявлена естественная и индуцированная лекарственная резистентность опухолевых клеток, обусловленная гиперэкспрессией энергозависимых ABC-транспортеров (ATP-Binding Cassette), выбрасывающих цитостатики из опухолевых клеток против градиента концентрации (Nemcova-Frstova V., 2016; Литвяков Н.В., 2014). В настоящее время основными АВС-транспортерами, определяющими множественную лекарственную устойчивость РМЖ, признаны ABCB1 (Pgp), ABCC1 (MRP) и ABCG2 (BCRP). Спектр их субстратов во многом аналогичен и включает такие противоопухолевые препараты с перекрестной резистентностью как антрациклины, винкаалкалоиды, таксаны, эпиподофиллотоксины камптотецины, хромопептидные антибиотики и антрацены. Исследования в этой области продолжаются. Прогностическим маркером агрессивности РМЖ, помогающим в выборе терапевтической тактики, может служить и метилирование генов-супрессоров опухолевого роста. В последнее время открыт целый кластер таких генов, включающий RAR-beta2, SEMA3B, RASSF1A, RHOA, USP4, GPX1, DAG1, MGMT и NKIRAS (Бурденный А.М., 2015; Логинов В.И., 2015; Pille J.Y., 2005). Обнаруженные генетические мутации являются потенциальными мишенями таргетной терапии, разработка которой требует дальнейших исследований. Таким образом, несмотря на многообразие предполагаемых факторов, необходим дальнейший поиск новых биологических маркеров диагностики и прогноза эффективности лечения люминального РМЖ.

Цель исследования

Поиск значимых гормональных, молекулярно-генетических,

иммуногистохимических и иммунологических маркеров люминального РМЖ для улучшения прогнозирования эффективности лечения и контроля над течением заболевания.

Задачи исследования

1. Оценить результаты лечения А- и В-подтипов люминального РМЖ и изучить их связь с клинико-морфологическими, гормональными, молекулярно-генетическими, иммуногистохимическими и иммунологическими характеристиками опухоли.

2. Изучить частоту экспрессии рецепторов эстрогенов (альфа и бета) и андрогенов у больных люминальным РМЖ и взаимосвязь с клинико-морфологическими характеристиками опухоли.

3. Определить частоту гиперэкспрессии белка множественной лекарственной резистентности Pgp-170 и его прогностическую значимость для оценки эффективности неоадьювантной терапии и отдаленных результатов лечения люминального РМЖ.

4. Оценить прогностическую роль уровня экспрессии Ki-67 при люминальном РМЖ.

5. Изучить фенотип иммунокомпетентных клеток и степень лимфоидной инфильтрации первично-операбельного люминального РМЖ.

6. Определить частоту выявления диссеминированных опухолевых клеток в костном мозге и особенности гемопоэза у больных люминальным РМЖ.

7. Оценить связь иммунофенотипа люминального РМЖ с микроокружением костного мозга.

8. Изучить молекулярно-генетические и эпигенетические изменения в генах хромосомы 3 (RAR-beta2, SEMA3B, RASSF1A, RHOA, USP4, GPX1, DAG1, MGMT, NKIRAS) и генах микроРНК (MIR-9-1, MIR-9-3, MIR-34B/C, MIR-193A, MIR-129-2) парных образцов опухолевой и гистологически неизмененной ткани молочных желез и их возможную связь с клинико-морфологическими параметрами люминального РМЖ.

9. Оценить совокупность изученных гормональных, молекулярно-генетических, иммуногистохимических и иммунологических параметров люминального РМЖ и выделить значимые маркеры для персонализированного лечения люминального РМЖ.

Научная новизна

Впервые изучен совместный профиль метилирования группы генов хромосомы 3 в люминальных А и В (B-HER2-негативный и B-HER2-позитивный), HER2+ и трижды негативном подтипах РМЖ. Выявлен высокий уровень метилирования 4-х из 9 белоккодирующих генов (RASSF1A, SEMA3B, MGMT и RAR-beta2) и генов микроРНК (MIR-9-1, MIR-9-3, MIR-34B/C, MIR-193A, MIR-129-2). Впервые показано, что частота метилирования генов RAR-2 и MGMT в люминальных В-HER-2-негативном и -позитивном подтипах статистически значимо в 5-6 раз превышает аналогичные показатели люминального подтипа А. Показано, что метилирование промоторных районов генов RASSF1A, SEMA3B, RAR-b2 и MGMT значимо коррелирует с клинической стадией, размером и степенью дифференцировки РМЖ, гена MIR-34B/C — с размером опухоли, а генов MIR-34B/C, -9-1, -9-3, -129-2, -193A — с клинической стадией заболевания. Метилирование генов RASSF1A, RAR-b2, MGMT и MIR-193А коррелирует с регионарным метастазированием, гена RAR-b2 — с уровнем экспрессии HER-2/neu, генов MGMT и MIR-34B/C — с пролиферацией Ki-67. Также установлено, что метилирование даже одного из генов RASSF1A, RAR-2 и MGMT приводит к снижению общей выживаемости больных. Выявлены опухоль-специфичные изменения экспрессии 6 генов (RASSF1A, SEMA3B, RAR-beta2, RHOA, GPX1, NKIRAS1) в РМЖ и его люминальных подтипах. Впервые обнаружены общие и уникальные комбинации совместно метилированных генов в различных подтипах люминального РМЖ; данные комбинации могут быть использованы при их определении. Изучен вклад эпигенетических факторов РМЖ и впервые выдвинута гипотеза о синергизме генов 3р и их регуляторных эффекторов, связанных с ключевыми процессами канцерогенеза. Полученные данные можно использовать для неинвазивной диагностики РМЖ и стратификации больных, а также при составлении прогноза заболевания и разработке индивидуальной тактики ведения пациентов.

Впервые установлены взаимосвязи иммунофенотипа люминального РМЖ с гемопоэзом и иммунной системой костного мозга. Показано, что утрата экспрессии молекул HLA-I класса на первичной опухоли сопровождается достоверным снижением показателей мегакариоцитопоэза и эритропоэза, а уровни костномозговых NK-клеток и В1-лимфоцитов находятся в реципрокных отношениях с инфильтрацией опухоли плазмоцитами и Т-киллерами.

Впервые в России повышена чувствительность метода обнаружения

диссеминированных опухолевых клеток в костном мозге больных РМЖ за счет увеличения порогового значения миелокариоцитов с 1 млн клеток до 10 млн. Кроме этого, использован высокоскоростной проточный цитометр Attune с опцией акустической фокусировки и набора большого количества анализируемых клеток (до 100 млн), а также программное обеспечение Kaluza, позволяющее соединять множество файлов со сравнительно небольшим количеством клеток (1-2 млн) в огромные файлы, содержащие десятки миллионов клеток. Повышение чувствительности метода позволило увеличить частоту выявления диссеминированных опухолевых клеток, составившую в данном исследовании 40% и сочетавшуюся с достоверным снижением количества миелокариоцитов (вдвое) и CD8-позитивных лимфоцитов.

Подтверждены данные ранее проведенных исследований о статистически значимой зависимости выживаемости больных люминальным РМЖ от стадии и степени злокачественности опухоли, уровня экспрессии Ki-67 и HER2/neu. Выявлена тенденция к повышению значимости влияния возраста больных на общую выживаемость.

Показано, что у больных с Ki-67 более 20% результаты лечения люминального РМЖ хуже за счет достоверно более высокой частоты отдаленных метастазов (>3-5 раз) и смертности пациентов (>6 раз), а также снижения 5-летней выживаемости без признаков прогрессирования заболевания (50% против 88%) и общей выживаемости (76% против 97%). Подтверждены данные литературы о том, что наличие Pgp-170 статистически значимо снижает клиническую эффективность неоадьювантной терапии, частоту лечебного патоморфоза III-IV степени. Выявлено укорочение периода до прогрессирования заболевания и снижение 5-летней выживаемости без признаков прогрессирования РМЖ.

Впервые показано, что у больных люминальным РМЖ частота гиперэкспрессии рецепторов эстрогенов альфа составляет 86,4%, бета — 97,7%, их коэкспресии — 85,3%. Среди ER-позитивных опухолей статистически значимо доминирует подтип А, среди ER-отрицательных — В-HER2-негативный подтип. ER-статус коррелирует со стадией заболевания. ER-статус напрямую коррелирует с прогестероновым статусом и совпадает с андрогенным статусом.

Показано, что у больных люминальным РМЖ частота гиперэкспрессии андрогенных рецепторов составляет 89,5% и не зависит от молекулярного подтипа,

стадии, степени злокачественности и гистологической формы опухоли. Наличие андрогенных рецепторов достоверно улучшает результаты лечения за счет удлинения периода до прогрессирования заболевания, снижения частоты возникновения и прогрессирования отдаленных метастазов. У таких пациентов выживаемость без признаков прогрессирования люминального РМЖ в 5 раз выше, уровень смертности — в 8,7 раза ниже, 5-летняя общая выживаемость — в 3 раза выше.

Практическая и теоретическая значимость

Впервые в России на базе Федерального государственного бюджетного
учреждения «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им.
Н.Н. Блохина» Минздрава России проведено комплексное изучение люминального
РМЖ, включающее клинико-инструментальные, патоморфологические,

иммуногистохимические, иммунологические и генетические исследования.

Впервые установлены взаимосвязи иммунофенотипа люминального РМЖ с
гемопоэзом и иммунной системой костного мозга. На большом клиническом материале
показано, что утрата экспрессии молекул HLA-I класса на первичной опухоли
сопровождается достоверным снижением показателей мегакариоцитопоэза и

эритропоэза. При этом уровни костномозговых NK-клеток и В1-лимфоцитов находятся в реципрокных отношениях с инфильтрацией опухоли плазмоцитами и Т-киллерами.

Выполнено пилотное исследование андрогенных рецепторов в люминальном
РМЖ и изучена их связь с клинико-морфологическими параметрами опухоли. Показано,
что наличие андрогенных рецепторов достоверно улучшает результаты лечения
люминального РМЖ. Впервые установлено совпадение андрогенного статуса и ER-
статусов опухоли, которые могут служить предикторами течения заболевания.
Проведенное исследование показало, что люминальный подтип А доминирует среди
ER-позитивного РМЖ, подтип В-HER2-негативный — среди ER-отрицательных
опухолей. ER-статус напрямую коррелирует с прогестероновым статусом. Впервые
экспрессию ER определяли методом ПЦФ с использованием мышиных

моноклональных антител IgG клона 14C8 (ab288, Abcam), клона SP1, Abcam, вторичных антител, конъюгированных с флуоресцентным красителем DyLight 650. В ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России был разработан и запатентован количественный метод иммунофлуоресцентного анализа с привлечением

проточной цитофлуориметрии. Он дал возможность количественно оценить не только уровень экспрессии разных типов рецепторов эстрогенов, но и её интенсивность в каждой клетке. Кроме того, данный метод позволил значительно снизить влияние субъективной оценки и исключить фактор гетерогенности опухоли за счет одномоментного анализа 5000 и более клеток.

Впервые в России повышена чувствительность метода обнаружения

диссеминированных опухолевых клеток в костном мозге больных РМЖ за счет увеличения порогового значения миелокариоцитов с 1 млн клеток до 10 млн. Кроме этого использован высокоскоростной проточный цитометр Attune с опцией акустической фокусировки и набора большого количества анализируемых клеток (до 100 млн), а также программное обеспечение Kaluza, позволяющее соединять множество файлов со сравнительно небольшим количеством клеток (1-2 млн) в огромные файлы, содержащие десятки миллионов клеток. Повышение чувствительности метода позволило увеличить частоту выявления диссеминированных опухолевых клеток. В данном исследовании она составила 40% и сочеталась с достоверным снижением количества миелокариоцитов (вдвое) и CD8-позитивных лимфоцитов.

Впервые изучен совместный профиль метилирования группы генов хромосомы 3 в люминальных А и В (B-HER2-негативный и B-HER2-позитивный), HER2+ и трижды негативном подтипах РМЖ. Выявлен высокий уровень метилирования 4-х из 9 белоккодирующих генов (RASSF1A, SEMA3B, MGMT и RAR-beta2) и генов микроРНК (MIR-9-1, MIR-9-3, MIR-34B/C, MIR-193A, MIR-129-2). Впервые показано, что частота метилирования генов RAR-2 и MGMT в люминальных В-HER-2-негативном и позитивном подтипах статистически значимо в 5-6 раз превышает аналогичные показатели люминального подтипа А. Показано, что метилирование промоторных районов генов RASSF1A, SEMA3B, RAR-b2 и MGMT значимо коррелирует с клинической стадией, размером и степенью дифференцировки РМЖ, гена MIR-34B/C — с размером опухоли, а генов MIR-34B/C, -9-1, -9-3, -129-2, -193A — с клинической стадией заболевания. Метилирование генов RASSF1A, RAR-b2, MGMT и MIR-193А коррелирует с регионарным метастазированием, гена RAR-b2 — с уровнем экспрессии HER-2/neu, генов MGMT и MIR-34B/C — с пролиферацией Ki-67. Выявлены опухоль-специфичные изменения экспрессии 6 генов (RASSF1A, SEMA3B, RAR-beta2, RHOA, GPX1, NKIRAS1) в РМЖ и его люминальных подтипах.

Впервые обнаружены общие и уникальные комбинации совместно

метилированных генов в различных подтипах люминального РМЖ. Установлено, что метилирование даже одного из генов RASSF1A, RAR-2 и MGMT приводит к снижению общей выживаемости больных. Полученные данные рекомендовано использовать при определении молекулярных подтипов РМЖ.

Впервые изучен вклад эпигенетических факторов РМЖ и впервые выдвинута гипотеза о синергизме генов 3р и их регуляторных эффекторов, связанных с ключевыми процессами канцерогенеза. Полученные данные можно использовать для неинвазивной диагностики РМЖ и стратификации больных, а также при составлении прогноза заболевания и разработке индивидуальной тактики ведения пациентов.

Положения, выносимые на защиту

10. Результаты лечения люминального РМЖ зависят от молекулярного подтипа опухоли и её клинико-морфологических, гормональных, генетических, иммуногистохимических и иммунологических параметров. В частности, при Ki-67 более 20% достоверно выше частота отдаленных метастазов (>3-5 раз) и смертности пациентов (>6 раз), и общая выживаемость (76% против 97%). При этом гипреэкспрессия андрогенных рецепторов статистически значимо улучшает результаты лечения за счет удлинения периода до прогрессирования заболевания с 29,4 до 60,9 мес., снижения частоты прогрессирования с 71,4% до 7,4%, отдаленных метастазов с 71,4% до 6,2%. У таких больных выживаемость без признаков прогрессирования люминального РМЖ в 5 раз выше (94,6%), уровень смертности — в 8,7 раза ниже (4,9%), 5-летняя общая выживаемость — в 3 раза выше (96,5%). Следует учитывать, что наличие Pgp-170 статистически значимо снижает клиническую эффективность неоадьювантной терапии с 81% до 40% объективного ответа, частоту лечебного патоморфоза III-IV степени с 28,6% до 10%, укорачивает период до прогрессирования заболевания с 91,2 до 15,9 мес.), уменьшает 5-летнюю выживаемость без прогрессирования заболевания с 94,7% до 70,1%, увеличивает частоту смертности с 4,8% до 25% и уменьшает общую 5-летнюю выживаемость больных с 94,7% до 69,6%.

11. Распространенность диссеминированных опухолевых клеток в костном мозге больных операбельным РМЖ составляет 40%. У таких пациентов статистически значимо снижено количество миелокариоцитов и CD8-позитивных лимфоцитов.

3. Существует взаимосвязь иммунофенотипа люминального РМЖ с гемопоэзом и иммунной системой костного мозга, что подтверждается утратой экспрессии молекул HLA-I класса на первичной опухоли, сопровождающейся достоверным снижением показателей мегакариоцитопоэза и эритропоэза, и реципрокными отношениями уровней костномозговых NK-клеток и В1-лимфоцитов с инфильтрацией опухоли плазмоцитами и Т-киллерами.

4. Первое изучение совместного профиля метилирования 9 белоккодирующих генов хромосомы 3 в РМЖ вывило высокий уровень метилирования RASSF1A, SEMA3B, MGMT и RAR-beta2 и генов микроРНК (MIR-9-1, MIR-9-3, MIR-34B/C, MIR-193A, MIR-129-2) и статистически значимое многократное превышение частоты метилирования генов RAR-2 и MGMT в люминальном РМЖ В-подтипа по сравнению с подтипом А. При этом метилирование промоторных районов генов RASSF1A, SEMA3B, RAR-b2, MGMT значимо коррелирует со стадией и степенью дифференцировки РМЖ, гена MIR-34B/C — с размером опухоли, генов MIR-34B/C, -9-1, -9-3, -129-2, -193A — с клинической стадией, генов RASSF1A, RAR-b2, MGMT, MIR-193А — N-стадией, гена RAR-b2 — с уровнем экспрессии HER-2/neu, генов MGMT и MIR-34B/C — с пролиферацией Ki-67. Метилирование даже одного из генов RASSF1A, RAR-2 и MGMT способствует статистически значимому снижению общей выживаемости больных.

Методы и методология исследования

Проведен анализ 478 историй болезни больных раком молочной железы, находившихся на лечении в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России в период с января 1998 г. по декабрь 2016 г. После полного клинико-инструментального и лабораторного обследования в 380 случаях был диагностирован люминальный РМЖ, в 98 — другие молекулярные подтипы (трижды-негативный и HER2+/сверэкспрессирующий). Всем больным проведено хирургическое лечение, по показаниям — комбинированное и комплексное лечение. Выбор метода хирургического лечения зависел от стадии РМЖ, генетического статуса и предпочтения пациентки. Показания к модифицированной радикальной мастэктомии с удалением единым блоком кожи, фасции большой грудной мышцы и клетчатки I-III уровней по Berg, а также модифицированной радикальной мастэктомии с одномоментной и отсроченной реконструкцией эндопротезом включали большие размеры опухоли, наличие местно-

распространенного процесса, наличие генетической мутации BRCA-1/2, CHEK-2, отсутствие возможности получить хороший косметический эффект. Показания к профилактической контрлатеральной подкожной мастэктомии с одномоментной реконструктивно-пластической операцией включали наличие генетической мутации BRCA-1/2, CHEК- 2. В остальных случаях выполнили радикальную резекцию молочной железы в следующих вариантах: широкая клиновидная резекция — радикальная резекция, квадрантэктомия, парциальная мастэктомия, лампэктомия — экономная резекция с простым техническим решением, повышающим косметический эффект, и онкопластическая резекция. Химиотерапию провели в нео- и адьювантном режимах по схемам CAF (циклофосфамид + доксорубицин + 5-фторурацил), АС (доксорубицин + циклофосфамид), АТ (доксорубицин + доцетаксел). Адьювантную лучевую терапию провели по стандартной методике: РОД 2 Гр, СОД 50 Гр, на зону регионарного метастазирования — СОД 45 Гр + буст на ложе удалённой опухоли.

Для анализа диссертационного материала все данные 478 больных РМЖ
формализованы с помощью специально разработанного кодификатора и внесены в «базу
данных», созданную на основе электронных таблиц EXCEL. Использовали результаты
гистологических и иммуногистохимических исследований, включая морфологический
анализ типа опухоли, распространения опухоли, наличия in situ компонента и
сосудистой инвазии, митотического индекса, общего количества лимфатических узлов и
количества узлов, пораженных метастазами, выраженности лечебного патоморфоза
после неоадьювантной терапии. Во всех случаях оценили степень злокачественности
опухоли по методике Nottingham Histologic Score. Выраженность лечебного
патоморфоза в опухоли определяли по классификации Г.А. Лавниковой.

Иммуногистохимическое исследование провели на серийных депарафинизированнных срезах опухолевой ткани с помощью биотин-стрептавидинового иммунопероксидазного метода с антителами к рецепторам эстрогенов (ER), прогестерона (PR), андрогенов (AR), рецептору эпидермального фактора роста 2 типа (HER2/neu) и Ki-67. Оценку иммуногистохимической реакции гормональных рецепторов провели только в инвазивном компоненте опухоли полуколичественным методом с учетом интенсивности окрашивания и количества антиген-позитивных клеток по методике Allred et al. Индекс пролиферативной активности опухоли оценивали по экспрессии Ki-67 с использованием моноклональных антител к MIB-1 (Dako).

Гистологические и иммуногистохимические методы выполнены в отделе патологической анатомии опухолей человека ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России.

Уровень экспрессии альфа и бета-эстрогенов отдельно определялся методом проточной цитофлуориметрии (ПЦФ) в лаборатории медицинской химии НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России.

На базе лаборатории иммунологии гемопоэза НИИ КО ФГБУ «Национальный
медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России
провели имммунологические исследования. Использовали методики

иммунофлуоресцентного фенотипирования опухолей на криостатных срезах с помощью
а) прямой и непрямой реакций иммунофлуоресцентности, б) метода проточной
цитометрии. Результаты анализировали с помощью программы WinMDI. В тех случаях,
когда требовалась дополнительная компенсация параметров флуоресценции,

использовали программу FCS, версия 3.

Генетические исследования провели на базе лаборатории Патогеномики и транскриптомики ФГБНУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» (заведующий лабораторией — д.б.н., проф. Брага Э.А.) совместно с к.б.н. Логиновым В.И., к.б.н. Бурденным А.М. и к.б.н. Прониной И.В. Анализ метилирования ДНК провели с использованием двух независимых методов. Метилирование генов RASSF1A, RAR2, SEMA3B и MGMT изучили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), специфичной к метилированному аллелю. Анализ метилирования промоторных районов генов RHOA, GPX1, USP4, DAG1, NKIRAS1 провели с применением 2 метилчувствительных рестриктаз — HpaII и HhaI и последующей ПЦР. Метод метил-специфичной ПЦР использовали для определения метилирования генов MIR-129-2, MIR-34B/C, MIR-9-1, MIR-9-3, MIR-193A.

Полученные результаты диссертационного исследования обработаны

стандартными пакетами STATISTICA, v. 10 и SPSS, v. 21. Отдаленные результаты лечения больных РМЖ оценены по критерию выживаемости с помощью интервального метода построения таблиц "Life table", рекомендованного Международным противораковым Союзом (UICC). Для сравнения таблиц выживаемости использованы тесты Wilcoxon (Breslouw) и Mantel-Cox. Достоверность различий между

количественными показателями вычислена по критерию t Стьюдента для нормально распределенных величин или по непараметрическому критерию Манна-Уитни. Для сравнения качественных параметров применяли точный критерий Фишера и %. Различия считали значимыми при p<0,05 (точность 95%). Степень взаимосвязи параметров оценена с помощью корреляционного анализа по Спирмену. Показатели выживаемости рассчитаны по методу Каплана-Майера. Различия выживаемости в группах определены по log-rank test. Оценена общая выживаемость пациентов и выживаемость без признаков прогрессирования РМЖ. Проведен регрессионный анализ по Коксу. Для определения порогового значения экспрессии андрогеновых рецепторов, повлиявшего на отдаленные результаты лечения люминального РМЖ, был использован ROC-анализ с построением ROC-кривых.

Личный вклад автора

Автором предложен дизайн исследования, самостоятельно проведен анализ литературы по теме диссертации. Диссертант принимал участие в диагностике больных люминальным раком молочной железы, непосредственно участвовал в операциях, составил базу данных и проводил сбор информации по пациентам. Систематизировав и самостоятельно проведя анализ результатов исследования, сделал выводы и практические рекомендации.

Соответствие паспорту специальности

Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.01.12 онкология, конкретно — пункту 4.

Степень достоверности и апробация результатов

Анализ результатов обследования и лечения 478 больных РМЖ, проведенных в ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России в период с января 1998 г. по декабрь 2016 г., позволяет считать материал исследования достаточным. Всем пациентам по показаниям выполнен необходимый объем обследований на современном уровне с учетом последних научно-технических достижений. По показаниям все пациенты получили необходимое лечение в объеме моно-, комбинированной и комплексной терапии.

Основные положения диссертации обсуждены и доложены на II конференции общества специалистов онкологов по опухолям органов репродуктивной системы (Москва, 29-30 октября 2012 г.), на ежегодной конференции ESMO (Вена, 28 сентября — 2 октября 2012 г.), VIII Российской научно-практической онкологической конференции (Ульяновск, 25-26 октября 2012 г.), XIV Российской с международным участием конференции "Иммунология гемопоэза" (Суздаль, 2017 г.).

Апробация диссертации состоялась 24 октября 2017 г. на совместной научной
конференции отделения хирургического № 5 (опухолей молочных желез), отделения
хирургического № 2 (диагностики опухолей), отделения химиотерапии, отделения
клинической фармакологии и химиотерапии, отделения хирургического № 12
(реконструктивной и пластической онкологии) отдела общей онкологии, отделения
химиотерапии и комбинированного лечения злокачественных отделения хирургического
№ 13 (клинических биотехнологии) торако-абдоминального отдела, отделения
амбулаторной химиотерапии (дневной стационар), лаборатории клинической

онкогенетики, отдела патологической анатомии опухолей человека, лаборатории
иммунологии гемопоэза, лаборатории клинической иммунологии опухолей

централизованного клинико-лабораторного отдела НИИ КО ФГБУ «НМИЦ онкологии
им. Н.Н.Блохина» Минздрава России, кафедры онкологии Федерального

государственного бюджетного образовательного учреждения дополнительного

профессионального образования Российская медицинская академия непрерывного профессионального образования Министерства здравоохранения Российской Федерации и кафедры онкологии Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский университет).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 23 печатные работы, в том числе 14 статей в журналах, рекомендованных перечнем ВАК при Минобрнауки России.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 262 страницах машинописного текста, состоит из введения, семи глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 53 источника отечественной и 280 источников зарубежной литературы. Работа иллюстрирована 76 таблицами и 33 рисунками.

Общая характеристика люминального рака молочной железы

Многие десятилетия РМЖ классифицировали только по клинико-морфологическим параметрам с учетом размеров, распространенности, степени злокачественности и морфологической формы опухоли. В последние годы XX века начали использовать молекулярные маркеры — рецепторы эстрогенов (ER) и Her2-neu. В 1982 г. Moll и соавт. впервые выделили «люминальный» и «базальный» РМЖ по названию слоев нормального эпителия молочной железы в зависимости от экспрессии цитокератинов в опухоли [215]. В 1987 г. Dairkee и соавт. показали, что экспрессия базальных цитокератинов связана с быстрым рецидивом заболевания [102]. В 1998 г. группа Мalzahn сообщила, что «базальный» РМЖ представляет собой преимущественно эстроген-негативные опухоли с низкой степенью дифференцировки и плохим прогнозом [204]. В 2000 г. Perou и соавт. впервые опубликовали сообщение об индивидуальных экспрессионных профилях опухолей, полученных с помощью микрочипов с гибридизационными пробами к 8102 мРНК [241]. Авторы выделили 465 генов, координированно варьировавших в образцах, и составили из них пять шаблонов, разделив все опухоли на молекулярные подтипы с различными мишенями для терапии и различным прогнозом. Два из них имели положительный ER-статус и отнесены к люминальным подтипам А и В; третий — отличался гиперэкспрессией рецепторов Her2; четвертый — нормальной экспрессией генов молочной железы, пятый — представлен базальными или трижды-негативными опухолями. В 2001 г. та же группа исследователей во главе с Srlie [282] представила подтипы РМЖ на основе изучения 78 образцов ткани молочной железы и анализа экспрессии уже 1753 генов. В результате были выделены 4 основных подтипа:

люминальный А;

люминальный В;

гиперэкспрессирующий Her2-neu (не люминальный);

трижды-негативный.

Впоследствии существование данных подтипов подтверждено многими независимыми исследованиями [162; 283; 303; 323]. Выявлен аналогичный шаблон экспрессии первичной и метастатической опухоли [317]. Однако молекулярную классификацию Perou и Srlie подвергли критике ввиду малого количества опухолевых образцов и кластерного иерархического анализа, приемлемого только для ретроспективного изучения большой когорты больных [203].

Следующий этап развития классификации РМЖ связан с использованием SSP-предикторов (SSP — single sample predictor), позволяющих посредством коэффициента корреляции оценить близость экспрессионного профиля анализируемой опухоли к «среднему экспрессионному профилю» центроиду — каждого подтипа РМЖ [162; 301]. Метод нашел применение в клинике, однако результаты во многом завесили от используемой панели генов и варианта статистической обработки [265; 281]. Сравнение классификации подтипов по трем разным диагностическим панелям SSP-предикторов выявило низкую конкордантность (k = 0,238-0,780) для люминальных А- и В-подтипов РМЖ и невозможность точной идентификации 10-30% опухолей [318]. Кроме того, молекулярная классификация РМЖ с помощью экспрессионного профайлинга и SSP-предикторов отличалась высокой стоимостью и трудоемкостью.

В 2009 г. предложена упрощенная (суррогатная) модель молекулярной классификации РМЖ по иммуногистохимическим маркерам, включающим экспрессию ER, прогестерона (PR), Her2 и уровня пролиферативной активности Ki-67.

Следует отметить, что стандартизация индекса Ki-67 до сих пор активно обсуждается, так как он важен для диагностики люминальных А- и В-Her2 негативного подтипов РМЖ [68; 84; 104; 143]. Первоначально Cheang с соавт. предложили полуколичественную оценку экспрессии Ki-67 c пограничным уровнем, 14%. Чувствительность и специфичность метода составили соответственно 77% и 78% [84]. В настоящее время по рекомендации XIV Международной конференции по раку молочной железы St. Gallen-2015 уровень Ki-67 следует оценивать, исходя из опыта местной патоморфологической лаборатории. В тех случаях, когда медиана значений Ki-67 при гормонозависимом РМЖ составляет 20%, показатель, 10%, следует расценивать как низкий, а 0% — как высокий [41]. Если надежное и достоверное определение индекса Ki-67 недоступно, в качестве альтернативы можно использовать оценку гистологической степени злокачественности опухоли.

Согласно консенсусу, принятому на конференции St. Gallen-2015, в настоящее время определить подтип РМЖ можно с помощью мультипараметрических молекулярных тестов — PAM-50 или Mamma Print/Blue Print [67; 77]. Учитывая тот факт, что основной целью врача-клинициста является правильное назначение специфической терапии, а не выделение формального подтипа РМЖ, эксперты рекомендуют использовать несколько мультипараметрических молекулярных маркеров [115; 119]. Однако в большинстве стран мира проведение таких исследований невозможно по логистическим и/или финансовым причинам, поэтому предложены суррогатные иммуногистохимические методы определения ER, PR, индекса Ki-67 и сверхэкспрессии или амплификации Her-2 с помощью in situ гибридизации (FISH) [228; 250].

Следует отметить, что к сегодняшнему дню выполнено много исследований, сравнивающих подтипы РМЖ, определенные по PAM-50 и суррогатной классификации [249]. Prat и соавт. объединили результаты изучения 5994 опухолевых образцов и выявили несоответствие у трети пациентов. По мнению авторов, 3-4 биомаркера не отражают всех особенностей различных подтипов РМЖ, что послужило дальнейшему поиску молекулярно-генетических показателей [249].

Следует обратить особое внимание на три основных исследования молекулярно-генетических показателей РМЖ:

The Cancer Genome Atlas Project (TCGA),

The International Cancer Genome Consortium (ICGC),

The Molecular Taxonomy of Breast Cancer International Consortium (METABRIC).

Основная цель данных исследований — улучшение существующей классификации РМЖ и выделение групп пациентов, у которых можно эффективно реализовать новые терапевтические возможности. Так, в проекте «Атлас ракового генома» (The Cancer Genome Atlas Project — TCGA) проведен анализ метилирования, изменений хромосомных копий, соматических и герминогенных мутаций ДНК, экспрессии микроРНК и мРНК, экспрессии белка и фосфор-протеина в 500 образцах первичных опухолей [82]. В результате выделено 4 группы, соответствующие 4 основным подтипам РМЖ, определенным по экспрессии мРНК [240]:

люминальный А;

люминальный В;

НЕЯ2-гиперэкспрессирующий;

базальноподобный.

Суррогатная модель молекулярно-генетической классификации РМЖ, основанная на показателях экспрессии ER, PR, HER2 и уровня пролиферативной активности Ki67, включает [12; 14; 33; 46; 122; 142; 227; 276]:

1. Люминальный А (высокодифференцированный рак ER+PR+Her2-Ki-67 20%).

2. Люминальный В:

люминальный B-Нег2-негативный (низкодифференцированнный рак ER+PR±Her2-Ki-67 20%),

люминальный B-Нег2-позитивный (ER+PR±Her2+Ki-67 любой).

3. Не люминальный Her2-экспрессирующий (ER-PR-Her2+ Ki-67 любой).

4. Трижды-негативный (ER-PR-Her2-Ki-67 любой).

Люминальный РМЖ диагностируют примерно у 70% больных, его отличает экспрессия рецепторов эстрогенов и/или прогестерона и потенциальная чувствительность к гормонотерапии [39; 265]. Однако в исследовании Sun и соавт. [288], результаты которого опубликованы в 2015 г., среди люминальных подтипов (ER+) при генно-экспрессионном анализе PAM-50 идентифицировано 18,7% других — не люминальных — опухолей. Рандомизированные клинические исследования показали, что в период менопаузы неоадъювантная гормонотерапия ингибиторами ароматазы эффективна у 40-60% больных люминальным РМЖ (ER+/PR+) [120; 274; 275]. В период пременопаузы чувствительность к неоадъювантной эндокринотерапии, включающей овариальную супрессию и тамоксифен или ингибиторы ароматазы, еще ниже [96; 97]. Резистентность к гормонотерапии может быть обусловлена факторами роста и нарушениями регуляции клеточного цикла, так как известно, что циклин-зависимые киназы (CDK 4/6) контролируют рост эстроген-позитивного РМЖ [66; 80; 122; 123; 259; 288; 299]. Неоадьювантная гормонотерапия люминального РМЖ остается предметом активного научного поиска.

На конференции St. Gallen-2015 классификацию суррогатного определения биологических подтипов РМЖ, принятую в 2013 г., предложено заменить лечебно-профилактической классификацией и выделять следующие клинические группы РМЖ: трижды-негативный, гормон-рецептор-негативный и Her2-позитивный, гормон-рецептор-позитивный и Her2-позитивный, гормон-рецептор-позитивный и Her2-негативный, который включает люминальный А, промежуточный и люминальный В (таблица 1). При этом уровень ER в пределах 1-9% считается сомнительным, у таких больных нельзя ограничиться только эндокринотерапией. Оценку Ki-67 нужно проводить с учетом местных лабораторных показателей.

Отдаленные результаты лечения люминального РМЖ в зависимости от экспрессии Ki-67

Отдаленные результаты лечения люминального РМЖ в зависимости от экспрессии Ki-67 проанализированы у 373 больных, из которых 140 получили комбинированное лечение и 233 — комплексное. Пациенты, которым проведено только хирургическое лечение, не вошли в исследование ввиду малочисленности (n=7).

В группу сравнения включены 88 больных, у 22 из них верифицирован сверхэкспрессирующий HER2+ подтип, у 66 — трижды-негативный подти РМЖ.

Экспрессия Ki-67 выявлена:

у 46 (32,9%) из 140 больных люминальным РМЖ, получивших комбинированное лечение;

у 127 (54,5%) из 233 пациенток, получивших комплексное лечение. Проведенный нами анализ показал, что у больных люминальным РМЖ с Ki 67-позитивным ( 20%) статусом результаты и комбинированного, и комплексного лечения хуже (таблица 13):

1. Достоверно выше частота смертности. После комбинированного воздействия она составила 15,2%, в то время как у пациенток с Ki-67-негативным (20%) статусом только 1,1%, р=0,0018. После комплексного лечения — соответственно 18,1% и 2,8%, р=0,0001.

2. Достоверно выше частота прогрессирования заболевания (после комбинированного лечения она составила — 17,4%, после комплексного — 20,5%, в то время как у пациенток с низким статусом Ki-67 соответственно только 3,2% (р=0,0059) и 6,6% (р=0,0018). При этом время до прогрессирования было короче на 5-6 мес., однако различия не достигли статистической значимости.

3. Достоверно выше частота отдаленных метастазов (после комбинированного лечения — 17,4%, после комплексного — 18,9%. У больных с Ki-67-низким статусом соответственно 3,2% (р=0,0059 и 5,7% (р=0,0019).

4. Достоверно ниже общая 5-летняя выживаемость (после комбинированного лечения — 76,3%, после комплексного — 76,6%. У пациенток с Ki-67-низким статусом соответственно 96,7% (р=0,00076) и 97,4% (р=0,00001; таблица 13, рисунки 9, 11).

5. Достоверно ниже 5-летняя выживаемость без признаков прогрессирования люминального РМЖ (после комбинированного лечения — 50,4%, после комплексного — 54,4%. У больных с Ki-67-низким статусом соответственно 88,3% (р=0,0031) и 91,5% (р=0,00008; таблица 13, рисунки 10, 12).

Проведенный нами анализ не выявил статистически значимых различий результатов комплексного и комбинированного лечения у больных с аналогичным статусом Ki-67.

Учитывая отсутствие статистически значимых различий эффективности комплексного и комбинированного лечения больных с аналогичным статусом Ki-67, мы объединили эти группы для последующего анализа отдаленных результатов лечения в зависимости от молекулярного подтипа РМЖ и экспрессии Ki-67. Так как Ki-67-позитивные опухоли полностью отсутствуют в группе люминального А-подтипа, а Ki-67-негативные — в группе B-Her2-негативного подтипа, анализ по всем параметрам возможен только в группах люминального B-Her2-позитивного, HER2+ и трижды-негативного подтипов (таблицы 14-16).

Как видно из таблицы 14, различия отдаленных результатов лечения в зависимости от экспрессии Ki-67 наиболее ярко проявились в группе B-Her2 87 позитивного РМЖ. У больных с Ki-67-положительным статусом заболевание прогрессировало достоверно чаще (37,1%) в виде отдаленных метастазов. Частота смертности была высокой и составила 34,3%. Аналогичные показатели у больных с Ki-67-отрицательным статусом достоверно лучше — 10% (р=0,028) и 5% (р=0,013). Пятилетняя общая выживаемость в группе с экспрессией Ki-67 составила 57%, выживаемость без признаков прогрессирования заболевания — только 48,9% (таблица 15, рисунки 13 и 14). У пациенток с Ki-67-негативным статусом показатели достоверно выше — соответственно 91,7% (р=0,0017, таблица 15, рисунок 15) и 88,2% (р=0,0048; рисунок 16).

Проведенное нами сравнение результатов лечения Ki-67-положительных B-Her2-позитивных и негативных опухолей выявило преимущество последних. Частота прогрессирования заболевания и смертности больных этой группы достоверно ниже и составила 15,2% и 13% (таблица 16), а выживаемость достоверно выше. У пациенток B-Her2-позитивным РМЖ заболевание прогрессировало в 37,1% случаев (р=0,0053), смертность достигла 34,3% (р=0,005). Как видно из табл. 3.2.3, пятилетняя общая выживаемость в группе Ki-67-положительного B-Her2-негативного РМЖ составила 82,4, а у больных B-Her2-позитивным РМЖ — только 57%, (р=0,0025; рисунок 13), выживаемость без признаков прогрессирования заболевания — 81,7% и соответственно 48,9% (р=0,0048, рисунок 14).

Сравнение результатов лечения B-Нег2-позитивных и HER2+ опухолей не выявило статистически значимых различий.

Среди Ki-67-негативных опухолей наиболее обнадеживающие результаты получены у больных РМЖ люминальным подтипом А. Эта группа отличилась минимальной частотой смертности пациенток (1,7%) и прогрессирования заболевания (4,4%) при максимальной 5-летней общей выживаемости (98,2%; рисунок 15) и выживаемости без признаков прогрессирования РМЖ (94,5%; рисунок 16). Все различия достигли статистической значимости при сравнении с HER2+ и трижды-негативными подтипами (таблицы 13 и 15).

Таким образом, проведенное нами исследование показало:

1. Отсутствие статистически значимых различий результатов комплексного и комбинированного лечения больных люминальным РМЖ с аналогичным статусом Ki-67 (р 0,05).

2. Результаты комбинированного, и комплексного лечения люминального РМЖ зависят от экспрессии Кі-67 и хуже у больных с Ki-67-позитивным статусом за счет:

достоверно более высокой частоты смертности пациентов и прогрессирования заболевания в виде развития отдаленных метастазов,

достоверного снижения 5-летней общей выживаемости и выживаемости без признаков прогрессирования люминального РМЖ.

3. Результаты лечения Ki-67-положительного B-Нег2-негативного РМЖ достоверно лучше по сравнению с B-Нег2-позитивным подтипом.

4. Наиболее обнадеживающие результаты лечения получены у больных люминальным РМЖ подтипа А с Ki-67-негативным статусом.

Клинико-генетический статус люминального РМЖ

В корреляционный клинико-генетический анализ включено 127 больных люминальным РМЖ. Использованы следующие факторы: возраст пациенток; Т-, N-, G- критерии и общая стадия опухоли; гистологический тип опухоли; наличие Her-2, Ki-67 и рецепторов андрогенов. У 6 из 127 больных выявлены билатеральные опухоли, поэтому мы анализировали результаты исследований 133 парных образцов опухолевой и гистологически неизмененной ткани молочных желез.

Генетический профиль включал 9 белоккодирующих генов (RASSF1A, SEMA3B, RAR-beta2, MGMT, USP4, GPX1, RHOA, DAG1, NKIRAS) и 5 генов микроРНК (MIR-9-1, MIR-9-3, MIR-34B/C, MIR-129-2 и MIR-193A).

Величина статистически значимой взаимосвязи клинических факторов и частоты метилирования изученных генов в образцах люминального РМЖ и парных им гистологически неизмененных тканей молочных желез отражена в таблице 35.

Обнаружена прямая взаимосвязь между:

1) возрастом больных и метилированием генам MIR-129-2;

2) Т-, N-, G- критерии, общей стадиями опухоли и метилированием генов RASSF1A, SEMA3B, RAR-b2, MGMT. При этом связь гена MGMT с размерами опухоли (Т-стадия) и общей стадией заболевания отличалась максимальными значениями (соответственно R=0,457 и R=0,471). Что касается генов микроРНК, то метилирование MIR-193a статистически значимо связано с N- и G- критериями опухоли (соответственно R=0,337 и 0,307), а MIR-34b/c — с Т-критериями и общей стадией люминального РМЖ (соответственно R=0,385 и R=0,357);

3) наличием HER-2/neu и метилированием RAR-b2;

4) наличием Ki-67 и метилированием MGMT и MIR-34b/c.

В парных образцах условно нормальной ткани молочных желез больных люминальным РМЖ выявлена прямая статистически значимая взаимосвязь между:

- возрастом пациенток и метилированием гена GPX;

- N-, общей стадиями опухоли и SEMA3B;

- G-стадией опухоли и USP4;

- наличием Ki-67 и USP4, MIR-9-1.

Обратная взаимосвязь наблюдалась между:

- наличием андрогенов и метилированием RAR-b2;

- Т-, общей стадиями опухоли и MIR-9-3.

Во всех случаях значения R не превысили 0,385 (таблица 35).

Учитывая отсутствие статистически значимой взаимосвязи клинических факторов и метилирования генов USP4, GPX1, RHOA, DAG1, NKIRAS в образцах люминального РМЖ, на следующем этапе анализа мы рассмотрели только частоту метилирования генов RASSF1A, SEMA3B, RAR-beta2, MGMT и генов микроРНК. Полученные результаты приводим в таблицах 36-40 в зависимости от представленности клинических составляющих.

У больных старше 50 лет частота метилирования гена MIR-129-2 составила 58,6% и в 2,6 раза превысила показатель более молодых пациенток (22,2%, p=0,015). Других статистически значимых зависимостей от возраста не обнаружено (таблица 36).

Как видно из таблиц 37 и 38, частота метилирования генов RASSF1A, SEMA3B, RAR-beta2, MGMT и MIR-34b/c у больных с Т4 стадией опухоли в 2,3 раза выше по сравнению с Т1 и достигает соответственно 53,3% (p=0,015), 60% (p=0,027), 46,7% (p=0,044) и 53,3% (p=0,00001). Достоверные различия метилирования гена MGMT наблюдаются уже при стадии Т3. (66,7%, p=0,0016).

У пациентов с N+ стадией люминального РМЖ также отмечено повышение частоты метилирования генов RASSF1A, SEMA3B, RAR-b2, MGMT, MIR-9-1, MIR-9-3, MIR-34B/C, MIR-129-2 и MIR-193a по сравнению N0-стадией. Однако статистической значимости достигли только показатели RASSF1A, RAR-b2, MGMT и MIR-193a (таблицы 37 и 38).

Аналогичные достоверные различия характерны и для частоты метилирования генов RASSF1A, SEMA3B, RAR-b2, MGMT у больных с G3 стадией опухоли по сравнению с G1. Если при G1 метилирование генов RASSF1A и SEMA3B наблюдалось лишь в единичных случаях (7,1%), а метилирования RAR-b2 и MGMT не было, то при G2 его частота увеличилась соответственно до 29,1%, 32,9% (p=0,042), 21,5% (p=0,046) и 7,6% и при G3 достигла 42,5% (p=0,014), 60% (p=0,0005), 47,5 (p=0,0007) и 22,5% (p=0,049), соответственно (таблица 37). При этом никаких статистически значимых изменений частоты метилирования генов микроРНК не было (таблица 38).

Общая стадия люминального РМЖ повлияла на частоту метилирования генов соответственно её составляющим. При стадии IIIа достоверно участилось метилирование генов RASSF1A, MGMT, MIR-9-1, MIR-9-3, MIR-129-2 и MIR-193a. Аналогичные статистически значимые изменения MIR-34b/c наблюдались при стадии 3b (таблицы 37 и 38).

Частота метилирования изученных генов в зависимости от морфологической формы люминального РМЖ и наличия Her2, Ki-67 и андрогеновых рецепторов представлена в таблах 39 и 40.

Проведенное нами исследование показало, что в группе пациентов с Her2 частота метилирования RAR-b2 достоверно выше (44%) по сравнению с подгруппой без маркера (23,1%, р=0,034; таблица 39). Наличие Ki-67 связано с аналогичными изменениями, они касаются метилирования генов RAR-b2 (38,5% vs 16,2%; р=0,003), MGMT (20% vs 2,9%; р=0,002) и MIR-34B/C (63,2% vs 25%; р=0,01).

Клинико-морфологические параметры люминального РМЖ в зависимости от экспрессии эстрогеновых б- и в-рецепторов

В исследование включено 88 больных люминальным РМЖ в возрасте от 34 до 80 лет (средний возраст — 57,4±10,9 лет, медиана — 58 лет).

Экспрессию рецепторов эстрогенов, прогестерона, андрогенов, Her2 и Ki-67 в образцах опухолей оценили по стандартной методике полуколичественного метода ИГХ по схеме Allred. Экспрессию ER и ER определили методом ПЦФ с использованием:

мышиных моноклональных антител IgG клона 14С8 (аЬ288, Abeam);

первичных моноклональных антител к ER (клон SP1, Abeam);

вторичных антител, конъюгированных с флуоресцентным красителем DyLight 650.

Все методики описаны в Главе 2.

Из 88 больных, включенных в исследование, у 86 (97,7%) общий эстрогеновый статус был положительным при использовании полуколичественного метода ИГХ, у 2 (2,3%) — отрицательным, но при ПЦФ у них выявлены ERp, что позволило установить люминальный рак. Экспрессию эстрогеновых а-рецепторов (ERa) выявили в 76 (86,4%) опухолевых образцах, Р-рецепторов (ЕБф) — в 86 (97,7%).

Достоверной взаимосвязи экспрессии ERa и ERp с общим эстрогеновым статусом опухоли не обнаружено (таблица 70). Это подтвердил и корреляционный анализ:

для ERa коэффициент корреляции (R) составил 0,162 при р=0,13;

для ERp R=- 0,023 при р=0,83.

Выявлена значимая положительная корреляция между ER-статусом опухолей и уровнем экспрессии ER (R=0,278, р=0,008). У пациенток с ER-положительным статусом он достиг в среднем 42,5% и достоверно (р=0,007) превысил аналогичный показатель больных с ER-отрицательным статусом (таблица 72).

Анализ коэкспрессии ERa и ERp в 88 образцах люминального показал:

экспрессию а- и р-эстрогеновых рецепторов (ERa+/ERp+) — у 85,3% (п=75) больных;

экспрессию только а-рецепторов (ERa+/ERp-) — у 1,1% (п=1);

экспрессию только р-рецепторов (ERa-/ERp+) — у 12,5% (п=11);

отсутствие экспрессии а- и р-эстрогеновых рецепторов (ERa-/ERp-) — у 1,1% (п=1).

Ниже представляем результаты анализа взаимосвязи ERa и ERp с клинико-морфологическими показателями люминального РМЖ.

Как видно из таблицы 73, у большинства (80,6%) из 88 больных был протоковый РМЖ I-IIа стадии (69,4%), G2 (88,6%).

Выявлена значимая положительная корреляция между ER-статусом опухоли и её стадией (R=0,301, р=0,0044), при этом степень злокачественности (R=-0,044, р=0,685) и гистологическая форма (R=0,096, р=0,374) РМЖ не играли существенной роли. У пациенток с ER-отрицательным статусом частота I стадии заболевания составила 58,3% и достоверно (р=0,026) превысила аналогичный показатель больных с ER-положительным статусом (таблица 73).

Различия обусловлены преимущественно состоянием регионарных лимфатических узлов. Как видно на рисунке 32, у пациенток с ER отрицательным статусом частота N0-опухолей достигла 100% и достоверно (р=0,0013) превысила показатель ER-положительного статуса (54%)

Корреляционный анализ подтвердил выявленные различия. Положительная корреляция (R) между ER-статусом и N-стадией опухоли составила 0,314 при р=0,0028.

Статистически значимых взаимосвязей ER-статуса люминального РМЖ и экспрессии Her2 и Кi67 не обнаружено. У ER-позитивных опухолей частота экспрессии Her2 составила 86,8%, Ki67 — 71%, в группе с ER-негативным статусом аналогичные показатели чуть ниже — 83,3% и 50%, соответственно, однако различия не достигли статистической значимости (таблица 73).

Значимых корреляций между ER-статусом и клинико-морфологическими показателями люминального РМЖ не обнаружено. Достоверных взаимосвязей с экспрессией Her2 и Кi-67 также не выявлено (таблица 74). Возможно, это обусловлено малым количеством пациенток с ER-отрицательным статусом (n=2/88). Однако, несмотря на это, проведенный нами корреляционный анализ показал:

значимую положительную корреляцию между ER и прогестероновым статусами люминального РМЖ (R=0,237, р=0,026). Среди ER-позитивных опухолей уровень экспрессии рецепторов прогестерона достиг 93% и был достоверно (р=0,007) выше, чем в группе с ER-негативным статусом (50%; таблица 74).

совпадение ER и андрогенового статусов опухолей (R=l). В этой группе нам удалось изучить экспрессию рецепторов андрогенов у 20 больных люминальным РМЖ (таблица 75). У 19 (95%) из них были положительные статусы андрогенов и ER, у 1 (5%) — отсутствие экспрессии обоих маркеров. Корреляционный анализ выявил значимую прямую взаимосвязь между андрогеновым статусом и коэкспрессией - и -рецепторов (R=0,542, р=0,0135).

Как видно из таблицы 76, подтип А статистически значимо (р=0,015) доминировал среди ER-положительных опухолей (63,2%), подтип В-Her2-негативный — среди ER-отрицательных (58,3%; р=0,02). Корреляционный анализ подтвердил достоверную обратную взаимосвязь подтипа люминального РМЖ и его ER-статуса (R=-0,232, р=0,0298).

Анализ коэкспрессии ER и ER показал, что частота ER-/ER+ опухолей среди В-Her2-негативного подтипа люминального РМЖ составила 24% и достоверно (р=0,012) превысила аналогичный показатель подтипа А (5,9%, рисунок 33).