Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Адгезионная концепция злокачественного роста 13
1.1.1. Молекулярные основы контактных взаимодействий 14
1.1.2. Межклеточные контакты в процессе опухолевого роста 18
1.1.3. Значение адгезии при злокачественном росте 20
1.2. Цитокины и адгезия 24
1.2.1. Участие цитокинов в контактных взаимодействиях между клетками 24
1.2.2. Роль цитокинов в опухолевом процессе 33
1.3. Фитоадаптогены в онкологии 36
1.3.1. Фитоадаптогены — индукторы дифференцировки 36
1.3.2. Воздействие фитоадаптогенов на разные системы организма 37
1.3.3. Гормономодулирующие свойства фитоадаптогенов 39
1.3.4. Фитоадаптогены - регуляторы межклеточных
взаимодействий 45
Глава 2. Материалы и методы исследования 51
2.1. Лабораторные животные 51
2.2. Описание эксперимента на лабораторных животных 52
2.3. Материалы исследования 53
2.4. Среды 54
2.5. Реактивы 54
2.6. Методы исследования 55
2.6.1. Анализ экспрессии лейкоцитарных интегринов методом непрямой иммунофлуоресценции 55
2.6.2. Определение цитокинов в сыворотке крови экспериментальных животных иммуно ферментным методом 56
2.6.3. Иммуногистохимический анализ CD8, CDlla, CDllb антигенов на лимфоцитах, инфильтрирующих
гепатокарциномы 58
2.7. Определение концентрации тестостерона и кортикостерона в сыворотке крови экспериментальных животных 60
2.8. Статистический анализ результатов 60
Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 61
3.1. Исследование экспрессии лейкоцитарных интегринов у мышей-самцов инбредной линии СВА при воздействии сухого экстракта фитоадаптогена в разных режимах применения 61
3.2. Оценка влияния сухого экстракта фитоадаптогена на сывороточный уровень интерлейкинов 6 и 10 у высокораковых мышей при спонтанном гепатоканцерогенезе 67
3.3. Определение воздействия сухого экстракта фитоадаптогена на частоту возникновения, количество и размеры гепатокарцином у высокораковых мышей 74
3.4. Морфологическое исследование ткани печени высокораковых мышей в разных режимах применения сухого экстракта фитоадаптогена 82
3.5. Иммунофенотипирование опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов гепатокарцином у высокораковых мышей, получавших сухой экстракт фитоадаптогена 89
3.6. Изучение воздействия сухой формы фитоадаптогена на продолжительность и качество жизни мышей с высокой частотой спонтанного опухолеобразования 96
3.7. Воздействие сухого экстракта фитоадаптогена в разных режимах применения на концентрацию тестостерона и кортикостерона в сыворотке крови мышей высокораковой линии СВА 106
Заключение 112
Выводы 122
Список литературы
- Молекулярные основы контактных взаимодействий
- Описание эксперимента на лабораторных животных
- Определение цитокинов в сыворотке крови экспериментальных животных иммуно ферментным методом
- Морфологическое исследование ткани печени высокораковых мышей в разных режимах применения сухого экстракта фитоадаптогена
Введение к работе
Актуальность исследования
Дефицит тканевонеспецифических молекул адгезии мембран злокачественных клеток (IСАМ-1,2), в частности, способствует подавлению экспрессии контррецепторов из семейства лейкоцитарных интегринов (например, LFA-1, Мас-1), обеспечивающих прикрепление иммунных эффекторов (натуральных киллеров, цитотоксических лимфоцитов и др.) к клеткам-мишеням [Бочарова О.А., 2014; Sumagin R., Prizant Н. et al., 2010; Kadioglu A., De Filippo K.et al., 2011]. Это приводит в том числе к защите опухоли от иммунологического надзора. Очевидно, коррекция экспрессии лейкоцитарных интегринов может внести вклад в реализацию противоопухолевого эффекта.
Вместе с тем, известно, что снижение активности иммунных эффекторов в отношении опухолевых клеток связано как с ослаблением их адгезионных взаимодействий с клеточными мишенями [Барышников А.Ю., 2008; Kadioglu A., De Filippo K.et al., 2011], так и с нарушением цитокиновой регуляции [Liang J„ 20011; Kim D., Oh S., Kwon H. et al., 2009]. Изучение возможности восстановления регуляции адгезионных механизмов при участии реактивности цитокинов в опухолевом процессе неспецифическими препаратами с адгезиогенным действием является актуальным.
Интерес в данном случае представляют фитоадаптогены, нормализующие межклеточную адгезию, усиливая процессы дифференцировки тканей и иммунологическую реактивность организма [Бочарова О.А., 2009; Guo L. et al., 2009].
В предыдущих исследованиях на модели спонтанного гепатоканцерогенеза у мышей высокораковой инбредной линии СВА было выявлено, что кратковременное в раннем онтогенезе и долговременное в зрелом и позднем онтогенезе на фоне возникших гепатом воздействие на примере комплексного фитоадаптогена (содержащего компоненты нескольких адаптогенов) в форме жидкого экстракта приводит к усилению экспрессии лейкоцитарных интегринов на эффекторах иммунитета [Бочарова О.А., Барышников А.Ю. и др., 2013]. Оно сопровождается признаками лейкоцитарной инфильтрации и деструкции опухолевых узлов, а также подавлением сывороточного уровня ИЛ-6 и ИЛ-10 [Бочарова О.А., Барышников А.Ю. и др., 2014]. Полученные результаты оказались существенными для снижения частоты спонтанного опухолеобразования при обоих режимах введения препарата и увеличения средней продолжительности жизни [Бочарова О.А., Бочаров Е.В. и др., 2014]. Однако проведенные исследования оставили невыявленным фенотип клеток, инфильтрирующих опухоль, а также вопрос о том, экспрессированы ли на этих клетках, в
частности, молекулы лейкоцитарных интегринов при использовании комплексного фитоадаптогена. Также целесообразной является оценка роли гормонов, особенно стресс-гормона кортикостерона и полового гормона тестостерона, при увеличении продолжительности жизни высокораковых животных.
Наряду с этим, с фармакологической точки зрения более современной и перспективной является сухая форма экстракта. Изучение влияния сухой формы, практически субстанции препарата фитоадаптогена, на модели спонтанного гепатоканцерогенеза у мышей позволит с более высокой степенью объективности оценить результаты подавления опухолевого процесса и повышения продолжительности жизни животных.
Таким образом, исследование воздействия сухого экстракта комплексного фитоадаптогена на экспрессию лейкоцитарных интегринов, содержание некоторых цитокинов и гормонов, частоту спонтанных гепатокарцином высокораковых мышей, а также оценка значимости коррекции нарушений для снижения уровня опухолеобразования и повышения выживаемости является актуальным.
Цель исследования: изучение экспрессии молекул лейкоцитарных интегринов на клетках периферической крови и лейкоцитах, инфильтрирующих опухоль, при воздействии сухого экстракта фитоадаптогена у высокораковых мышей линии СВА, а также значимости её коррекции при спонтанном гепатоканцерогенезе.
Задачи исследования
-
Исследование экспрессии лейкоцитарных интегринов на клетках периферической крови у мышей-самцов линии СВА с высокой частотой спонтанного опухолеобразования при воздействии сухого экстракта фитоадаптогена в раннем и зрелом онтогенезе.
-
Оценка влияния сухого экстракта фитоадаптогена на сывороточный уровень ИЛ-6 и ИЛ-10 у высокораковых мышей.
-
Определение воздействия сухого экстракта на частоту возникновения, количество и размеры гепатокарцином у мышей-самцов линии СВА.
-
Морфологическое исследование ткани печени высокораковых мышей при разных режимах применения сухого экстракта фитоадаптогена.
-
Иммунофенотипирование опухоль-инфильтрирующих лейкоцитов в ткани печени высокораковых мышей, получавших сухой экстракт фитоадаптогена в разных режимах.
-
Исследование воздействия сухого экстракта фитоадаптогена на концентрацию тестостерона и кортикостерона в сыворотке крови мышей высокораковой линии СВА.
7. Изучение воздействия сухой формы препарата на продолжительность и качество жизни мышей с высокой частотой спонтанного опухолеобразования.
Научная новизна
Впервые описано воздействие сухого экстракта фитоадаптогена на экспрессию лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Мас-1 клетками периферической крови, сывороточный уровень цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-10 у мышей-самцов высокораковой линии СВА в онтогенезе.
Получены новые данные об инфильтрации спонтанных гепатокарцином высокораковых мышей цитотоксическими С08+лимфоцитами, экспрессирующими CD 11а и CD lib лейкоцитарные интегрины, при воздействии сухого экстракта фитоадаптогена.
Впервые определено воздействие фитоадаптогена в форме сухого экстракта на содержание гормонов тестостерона и кортикостерона в сыворотке крови мышей высокораковой линии.
Впервые проведена оценка влияния комплексного фитоадаптогена в сухой форме на уровень спонтанного опухолеобразования, продолжительность и качество жизни животных.
Практическая значимость исследования
Инфильтрация цитотоксическими С08+лимфоцитами, экспрессирующими лейкоцитарные интегрины CD 11а и CD lib, спонтанных гепатокарцином высокораковых мышей может иметь значение для подавления опухолевого процесса и увеличения продолжительности жизни животных.
Модель генетически обусловленного гепатоканцерогенеза мышей с учетом коррекции показателей лейкоцитарных интегринов и некоторых цитокинов периферической крови, сывороточного содержания гормонов кортикостерона и тестостерона, снижения уровня опухолеобразования, фенотипа опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов, а также увеличения выживаемости и улучшения соматического состояния экспериментальных животных может применяться для исследования препаратов-геропротекторов, перспективных для профилактики и комплексной терапии онкологических заболеваний.
Выявление эффективности сухого экстракта фитоадаптогена на модели спонтанного гепатоканцерогенеза у мышей имеет практическое значение при его использовании в качестве субстанции для исследований различных форм препарата при разных способах его применения.
Эффект снижения частоты и размеров опухолей, выявленный при усилении экспрессии лейкоцитарных интегринов под воздействием как жидкого, так и сухого экстрактов фитоадаптогена в разных режимах введения на модели спонтанного гепатоканцерогенеза у мышей, имеет значение для повышения объективной оценки результатов подавления опухолевого процесса и увеличения продолжительности жизни животных.
Личный вклад автора
В ходе научной деятельности диссертантом самостоятельно собран экспериментальный материал, проведена статистическая обработка полученных данных с использованием современных компьютерных программ и анализ результатов исследования.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.01.12 -онкология, пунктам 1-2.
Положение, выносимое на защиту
Инфильтрация спонтанных гепатокарцином высокораковых мышей цитотоксическими С08+лимфоцитами, экпрессирующими CD 11а и CD lib лейкоцитарные интегрины, может иметь существенное значение для подавления опухолевого процесса, а также повышения выживаемости и качества жизни высокораковых животных.
Апробация диссертации
Апробация работы состоялась 27 марта 2015 года в НИИ ЭДиТО ФГБНУ «РОНЦ
им. Н.Н.Блохина» на совместной научной коференции с участием лабораторий
иммунофармакологии, экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей,
фармакологии и токсикологии, клеточного иммунитета, экспериментальной
химиотерапии, медицинской биотехнологии.
Основные положения диссертации доложены на XVII, XVIII, XIX международном конгрессе «Phytopharm» (Вена, 2013 г.; Санкт-Петербург, 2014 г.; Бонн, 2015 г.); XXI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2014 г.); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием "Отечественные противоопухолевые препараты" (Москва, 2014 г.; 2015 г.)
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.
Объём и структура диссертации
Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 17 рисунками. Библиография включает 205 источников, из которых 59 — отечественных и 146 — зарубежных.
Молекулярные основы контактных взаимодействий
Нарушение взаимной адгезивности клеток наследственно предрасположенной к новообразованию ткани может быть результатом потери или инактивации единственного аллеля (нулевой гомозиготности, или гемизиготности) гена гликопротеина - "контактина" (вероятно, из семейства кадхеринов), тканеспецифически регулирующего межклеточные взаимодействия, поддерживающего тканевую архитектуру, отвечающего за дифференцировку и клеточный гомеостаз нормальной ткани. В нормальном онтогенезе содержание "контактина" в соответствующей ткани является максимальным при становлении взрослой функции (высокой степени дифференцированности), убывая со временем при развитии процессов старения [Бочарова О. А., Модянова Е. А., 1982; Umerava К., Asakura S. Et al., 1994; Lascombe I., Clairotte A. Et al, 2006].
Нарушение адгезии обеспечивается дефицитом сначала тканевоспецифических, а затем и -неспецифических (например, из семейства ICAM сверхсемейства иммуноглобулинов) факторов гомотипической (клетка-клетка одноименной ткани) адгезии [Kimura К., Endo Y. et al., 2000; Kato Y., Hirano T. et al, 2005; Margulis A., Zhang W. Et al., 2005; Lascombe I., Clairotte A. et al, 2006; Milrgineanu E., Cotrutz С et al, 2008].
Дефицит тканевоспецифических факторов адгезии ограничивает, возможно, один из центральных механизмов тканевой противоопухолевой защиты, нарушая регуляцию процессов деления и дифференцировки [Модянова Е. А., Бочарова О. А., Маленков А. Г., 1983; Thedieck С, Kuczyk М. Et al., 2005; Heidemann J., Maaser С. et al., 2006; Tsanou E., Peschos D. Et al., 2008]. Дефицит гистонеспецифических молекул гомотипической адгезии возникает намного позже. Он усугубляет ослабление контактных взаимодействий клеток опухоли [Лобанов С.Л., Клименков А.А. и др., 1990; Umerava К., Asakura S., 1994; Shin H. C, Shiozawa Т., 2004; Blank C, Brown I. et al, 2005; Mukoyama Y., Zhou S. et al, 2005; Spizzo G., Went P., 2006].
Недостаточность гистонеспецифических молекул адгезии на мембране опухолевых клеток индуцирует, во-первых, снижение экспрессии соответствующих лигандов из семейства лейкоцитарных интегринов (например, LFA-1, Мас-1) на поверхности иммунных эффекторов [Enns А., Gassmann P. Et al, 2004; Maksan S. M., Araib P. et al., 2004], а во-вторых, -усиление на мембранах опухолевых клеток экспрессии молекул адгезии к субстрату, например антигенов поздней активации VLA и цитоадгезинов из семейства интегринов [Yoneda Т., 2002; Takatsuki Н., Komatsu S. et al, 2004; Heidemann J., Maaser C. et al., 2006]. Первое приводит к недостаточности взаимодействий молекул из семейства ICAM с их лигандами, обеспечивающими прикрепление иммунных эффекторов к клеткам-мишеням, сводя к минимуму элиминацию клеток мишеней макрофагами, нейтрофилами, натуральными киллерами, цитотоксическими лимфоцитами, что вносит существенный вклад в экранирование опухоли от механизмов противоопухолевого надзора [Zhou J., Sargiannidou I., 2000; Shirai A., Furukawa M.et al., 2003; Kawaguchi Т., 2005]. Второе способствует формированию собственной сосудистой сети опухоли (путем индукции экспрессии, например, молекул VCAM-1), ее инвазии в окружающие ткани и гетеротипической адгезии, что индуцирует усиление пролиферации и еще большее подавление апоптоза, а также по линии обратной связи — дополнительное разобщение клеток опухоли [Genda Т., Sakamoto М., 2000; Ivaska J., 2000; Zhou J., Sargiannidou I., 2000; Boumaer Steege J. C., Baeten C. Ir. et al, 2004; Liu K., Caldwell S. A. et al, 2005]. Так появляются метастазы, которые через новый виток адгезивных нарушений усугубляют ускользание опухоли от иммунологического надзора и контроля пролиферации, беспрепятственно "съедая" подлежащие и другие ткани, что, в конечном итоге, приводит к гибели организма. Следовательно, нарушение адгезивных взаимодействий в ткани-мишени инициирует создание сначала местных, а потом и общих условий для развития новообразования. Иными словами, дефицит тканевоспецифического адгезивного фактора в самом начале процесса неоплазии, запуская каскад патологических реакций, приводит к более сложным нарушениям адгезии, которые в свою очередь являются критическими для "тоталитарного" поведения опухоли и "колонизации" ею других тканей и органов. Согласно данной гипотезе, нарушение адгезии играет роль ключевого механизма опухолевого процесса, поскольку обеспечивает основные свойства опухоли: потерю местного (тканевого) контроля пролиферации, анаплазию, инвазию, метастазирование и ускользание от иммунологического надзора [Бочарова О.А., Карпова Р.В., 2006].
В пользу данной гипотезы можно привести следующие доводы. Во-первых, сложно отыскать какой-либо иной фактор (функция апоптоза, рецепция факторов роста, экспрессия онкогенов и др.), нарушение которого объясняло бы все этапы развития опухоли. Во-вторых, опираясь на эту гипотезу, легко объяснить возникновение опухоли, как правило, в одном органе и разную агрессивность метастазирования (в связи с существованием индивидуального интегринового профиля) для опухолей разных локализаций [Gui G.P., Wells С.А., 1995; Ahmed N., Riley С. et al, 2005]. В-третьих, экспрессию молекул VLA-интегринов некоторые авторы расценивают как наиболее существенный (по сравнению со всем комплексом используемых параметров — клинических, гистологических, биохимических и др.) маркер для прогноза опухолевого процесса [Takatsuki Н., Komatsu S. et al, 2004]. В-четвертых, ослабление межклеточной адгезии в ткани является специфическим свойством именно опухолевого процесса (патологии с увеличением клеточной массы ткани). Патологии другого рода, с потерей клеточной массы органа (воспаления, деструктивные процессы), характеризуются усилением межклеточной адгезии и соответственно повышением экспрессии, в частности, молекул ICAM-1, ICAM-2, LFA-1, LFA-3, Мас-1 в ответ на медиаторы воспаления (провоспалительные цитокины, гормоны, клеточный стресс, инфекции). Последнее влечет за собой увеличение хелперно-супрессорного (CD4+/CD8+) соотношения, активацию натуральных киллеров, макрофагов, нейтрофилов. Подавление повышенной экспрессии этих молекул с помощью моноклональных антител, а также глюкокортикоидов и кортикостероидов приводит к терапевтическому эффекту, снижая степень воспалительной реакции [Horvathova М., Ferencik М., 2000; Patella V, Incorvaia С, et al., 2011]. В редких случаях спонтанной регрессии злокачественной опухоли на мембранах ее клеток определена повышенная экспрессия, например, ICAM-1 при множественной инфильтрации опухоли лейкоцитами, в том числе Т-лимфоцитами [Danese S., Semeraro S. et al, 2005].
Справедливость данной концепции может быть также подтверждена эволюционной взаимосвязью молекул кадхеринов (тканевоспецифически опосредующих контактные взаимодействия клеток путем объединения их цитоскелетов в единые гистосистемы, что является фундаментом гисто- и органогенеза); CJM (cell junction molecules), участвующих в формировании сложных межклеточных контактов; ICAM (гистонеспецифически участвующих в поддержании тканевой интеграции и служащих лигандами молекул лейкоцитарных интегринов); интегринов, обеспечивающих гетеротипическую адгезию к другим тканям; IgG; рецепторов факторов роста; белков главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I, которые необходимы для обеспечения реакций именно клеточного иммунитета. Иммуноглобулины и другие перечисленные выше молекулы кодируются генами вариабельных и константных участков, возникшими в ходе эволюции в результате дупликации исходного предшественника, который весьма похож на ген одной из молекул кадхеринов [Edelman G.M., 1986].
Описание эксперимента на лабораторных животных
В возрасте 4, 8 и 22 месяцев на лимфоцитах периферической крови животных исследовали уровень экспрессии лейкоцитарных интегринов CD11а и CD1 lb с использованием наборов фирмы BD Biosciences (США).
Кровь забирали в стерильную центрифужную пробирку, содержащую 20 ед/мл гепарина. Реакцию выполняли в пластиковых пробирках (фирмы «Falcon»). К 100 мкл гепаринизированной цельной крови добавляли 20 мкл соответствующих моноклональных антител и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего клетки отмывали центрифугированием в PBS в течение 7 минут при 1500 об/мин. Надосадочную жидкость удаляли, осадок ресуспендировали. Затем к клеткам добавляли по 20 мкл меченой флуоресцеинизотиоционатом антисыворотки барана против иммуноглобулинов мыши и инкубировали 30 мин при 4С. Для удаления эритроцитов к клеткам добавляли 2 мл лизирующего раствора и тщательно перемешивали на вортексе. Инкубировали при комнатной температуре в защищенном от света месте в течение 10 мин. Центрифугировали 7 мин при 1500 об/мин. После проведения процедуры лизиса эритроцитов клетки отмывали дважды в PBS, после чего ресуспендировали в PBS, содержащем 1% формалина и 0,1% азида натрия.
Реакцию учитывали на проточном цитофлуориметре FACScanto Пс (Becton Dickinson, США) в гейте лимфоцитов.
Уровень цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-10 в сыворотке крови экспериментальных животных в возрасте 4, 8 и 22 месяца определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием наборов фирмы «Diaclone» (Франция).
Количественное определение интерлейкинов проводили с помощью иммуноферментного метода (ИФА), основанного на реакции антиген (АГ)-антитело (AT), с высокой специфичностью и высокой чувствительностью, усиленной за счет биотина, конъюгированного с AT, и обладающего высоким к нему сродством стрептавидина, конъюгированного с ферментом пероксидазой (пероксидаза КФ 1.11. 1.7.) [Clark R., 1981; Иммунологические методы, 1987]. В работе был использован неконкурентный ИФА-метод двойных AT — «сэндвич вариант». Для этого варианта использованы два моноклональных AT с различной эпитопной специфичностью к АГ. Одно из них иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность реакционных лунок микропланшета), второе конъюгировано с биотином. На первой стадии анализа АГ из калибровочных, контрольных и исследуемых проб связывается с AT, находящимися на внутренней поверхности лунок. На второй стадии комплекс АГ-АТ взаимодействует со вторыми AT, конъюгированными с биотином. Количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству АГ в исследуемом образце. Далее в лунки вносится конъюгат стрептавидин-пероксидаза (КФ 1.11.1.7), а на последней стадии — субстратная смесь. Во время инкубации с субстратной смесью (перекись водорода с тетраметилбензидином происходит окрашивание раствора в синий цвет (разной степени интенсивности) в лунках. Остановка реакции — добавление кислоты, изменение окраски в желтый цвет. Степень окраски прямо пропорциональна количеству связавшегося определяемого АГ с AT. После измерения экстинкции раствора в лунках на основании калибровочной кривой рассчитывается концентрация исследуемого вещества (АГ) в определяемых образцах. Калибровочные, контрольные и исследуемые пробы анализируются в двух повторностях.
Определение уровня интерлейкина-6 в сыворотке крови экспериментальных животных. Образцы и стандарты в объеме 100 мкл помещали в лунки 96-луночного микропланшета с предварительно иммобилизованными на дне моноклональными антителами к ИЛ-6. В среду (во все лунки) добавляли 50 мкл биотинилированного раствора с антителами к ИЛ-6, стрипы инкубировали при температуре 37С в течение 2-х часов при постоянном встряхивании. По окончании инкубации содержимое лунок удаляли и промывали 3-4 раза буферным раствором. Затем вносили 100 мкл раствора конъюгата стрептавидин-пероксидаза и инкубировали 30 мин при 37С, постоянно встряхивая. Отмывали 3-4 раза буферным раствором. В планшет добавляли 100 мкл субстратного раствора перекиси водорода с тетраметилбензидином и инкубировали 12-15 минут на шейкере. Реакционную смесь в лунке при развитии окраски останавливали добавлением 50 мкл стоп-реагента H2SO4. Величину абсорбции измеряли при длине волны 450 нм на спектрофотометре «Униплан» (Россия).
Определение уровня интерлейкина-10 в сыворотке крови экспериментальных животных Образцы и стандарты в объеме 100 мкл помещали в лунки 96-луночного микропланшета с предварительно иммобилизованными на дне моноклональными антителами к ИЛ-10. В среду во все лунки добавляли 50 мкл биотинилированного раствора с антителами к ИЛ-10, стрипы инкубировали при температуре 37С в течении 3-х часов при постоянном встряхивании. По окончании инкубации содержимое лунок удаляли и промывали 3-4 раза промывочным буфером. Вносили 100 мкл раствора конъюгата стрептавидин-пероксидаза и инкубировали 30 мин при 37С, постоянно встряхивая. Отмывали 3-4 раза буферным раствором. В планшет добавляли субстратный раствор 100 мкл перекиси водорода с тетраметилбензидином и инкубировали 25-30 минут на шейкере. Реакционную смесь в лунке при развитии окраски останавливали добавлением 50 мкл стоп-реагента H2SO4. Величину абсорбции измеряли при длине волны 450 нм на спектрофотометре «Униплан» (Россия).
Анализ CD8, CDlla, CDllb антигенов проводили на парафиновых срезах гепатокарцином мышей СВА в возрасте 22 мес, получавших сухой экстракт фитоадаптогена в профилактическом и лечебном режимах введения.
Печень обезвоживали в спиртах восходящей концентрации и заливали в парафин. Гистологические срезы фиксировали на стеклах с адгезивным полилизиновым покрытием (Thermo Scientific, Barrington, IL, USA).
Часть срезов окрашивали гематоксилин-эозином стандартным методом. Препараты изучали под микроскопом фирмы Leica DM LB2 при х50, х200, х400 кратном увеличении с последующим фотографированием.
На других срезах проводили непрямое иммуногистохимическое окрашивание CD8, CDlla, CDllb антигенов на лимфоцитах, инфильтрирующих гепатокарциномы с использованием авидин-биотин-пероксидазного комплекса (ABC).
Окраске предшествовали стадии демаскировки антигена и деактивации эндогенной пероксидазы. Для этого депарафинированные в ксилоле и проведенные по спиртам до воды срезы погружали в раствор 0,01-молярного цитратного буфера (рН 6) и кипятили в течение 20 минут в микроволновой печи с последующим охлаждением до комнатной температуры в течение 20 минут. Затем срезы погружали в 0,3% раствор перекиси водорода в 0,01-М фосфатном буфере (рН 7,4) на 30 минут и троекратно промывали фосфатным буфером. Пространство между срезами высушивали фильтровальной бумагой, срезы окружали гидрофобной полоской с помощью Super pap pen.
На первой стадии иммуногистохимического окрашивания срезы обрабатывали первичными мышиными моноклональными антителами к исследуемым антигенам (CD8, CDlla, CDllb) в разведении 1:30 - 1:50 0,01-М фосфатным буфером (рН 7,4) с добавлением 0,3% детергента — Triton XI00 и 2% нормальной ослиной сыворотки для блокировки неспецифического связывания антител. Реакцию с первичными антителами проводили в течение 12 часов (ночь) при 4С во влажной камере. Затем препараты промывали 3 раза 0,01-М фосфатным буфером (рН 7,4).
На второй стадии срезы покрывали раствором вторичных поликлональных ослиных антител против иммуноглобулина мыши, конъюгированных с биотином, в 0,01-М фосфатном буфере с добавлением 0,3% детергента — Triton XI00 и выдерживали 1 час при комнатной температуре. Затем препараты промывали 3 раза 0,01-М фосфатным буфером (рН 7,4).
Определение цитокинов в сыворотке крови экспериментальных животных иммуно ферментным методом
Обсуждая полученные результаты, можно отметить, что при воздействии сухого экстракта комплексного фитоадаптогена фм-40, как и при влиянии жидкой формы препарата, наблюдали снижение уровня наследственного опухолеобразования у самцов высокораковой линии СВА.
Иными словами, сухая форма фм-40, вероятно, обладает адгезиогенным действием, как и его водно-спиртовый вариант. Полученные результаты выявили, что применение сухой формы фм-40 в раннем онтогенезе может вызывать долговременное усиление тканевой интеграции, или взаимной адгезивности клеток ткани-мишени, в данном случае печени. Вместе с тем, очевидно, наблюдается повышение функциональной активности Т-лимфоцитов, что сопровождается ростом экспрессии молекул лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Мас-1 и снижением сывороточного уровня ИЛ-6 и ИЛ-10. В результате, в позднем онтогенезе определено снижение частоты спонтанных гепатокарцином (доли мышей с опухолями), а также числа и объёма опухолей у одного животного).
При введении фитоадаптогена высокогепатомным мышам СВА кратковременно (в течение одного месяца) в другое время, минуя критический период завершения дифференцировки ткани печени, описанные эффекты реализуются не в полной мере.
Применяя фитоадаптоген, например, только в период завершения полового созревания (в течение третьего месяца постнатального онтогенеза), совпадающего с окончанием увеличения абсолютной массы тимуса (завершением формирования главного органа клеточного иммунитета), а также в период образования первых опухолей (в течение восьмого месяца онтогенеза), долговременная коррекция тканевых и иммунных параметров не наблюдается. Кроме того, высокий уровень частоты наследственных опухолей печени, соответствующий интактным высокогепатомным самцам линии мышей СВА не изменяется. Однако средний размер опухолей в данном случае оказался меньшим, чем в контроле, что, по-видимому, свидетельствует о задержке опухолевого роста даже при кратковременном повышении изучаемых характеристик [Бочарова О.А. и др., 1997].
Следует подчеркнуть, что в настоящей работе сухой экстракт фм-40 применяли в зрелом онтогенезе в течение всего периода роста опухолей (с 6-ти мес до естественной гибели животных, т.е в течение минимум 17-20 мес), а не в течение одного месяца. В результате было выявлено, что у животных в возрасте 8 месяцев частота возникновения опухолей на мышь не отличалась от уровня контрольных животных. Вместе с тем в позднем онтогенезе у мышей данной группы наблюдали снижение частоты спонтанного опухолеобразования, так же как и во 2-й группе, примерно, на 30% по сравнению с контрольными животными. Число и общий объем опухолей на мышь в 3-й группе также оказался достоверно ниже по сравнению с не леченными животными.
Можно полагать, что приём препарата в сухой форме на первых этапах образования опухолей (начиная с 6-го месяца постнатального онтогенеза), способствует эффективной элиминации опухолевых клеток иммунными эффекторами. Последнее лизис опухолевых клеток происходит, возможно, благодаря поддержанию подавления ускользания опухоли от иммунобиологического надзора, в том числе с помощью усиления экспрессии лейкоцитарных интегринов и связанной с этим инфильтрации и деструкции опухоли иммунными эффекторами.
Иными словами, можно полагать, что коррекция ослабленной гомотипической адгезии (обусловливающей высокую наследственную предрасположенность ткани к опухолям) адгезиогенным препаратом в виде сухого экстракта в завершающий период ее дифференцировки вызывает долговременный эффект усиления тканевой интеграции. Последнее может способствовать коррекции экспрессии изученных лейкоцитарных интегринов и цитокинов, приводя к снижению частоты возникновения и размеров опухолей у экспериментальных животных. Кратковременное воздействие (в течение одного месяца) в любой другой период постнатального онтогенеза, вероятно, не приводит к выраженному повышению взаимной адгезивности клеток печени, отсюда - лишь замедление роста опухолей без изменения частоты их возникновения.
Долговременный (в течение многих месяцев) вариант применения адгезиогенного препарата в виде сухого экстракта, вероятно, всё же способствует поддержанию коррекции адгезивных взаимодействий на некотором уровне. В данном случае выявлены соответствующие изменения экспрессии изученных лейкоцитарных интегринов на иммунных эффекторах и сывороточного уровня определенных цитокинов. Следовательно, при этом возможно снижение процента мышей с гепатомами, торможение их роста и подавление общего объёма опухолей у одного животного.
Усиление взаимной адгезивности клеток печени при подавлении сывороточного содержания ИЛ-6 и ИЛ-10 может нарушать защиту опухолевых клеток в том числе специфическими антителами, что, вероятно, связано с усилением экспрессии молекул гетеротипической адгезии (включая LFA-1, Мас-1, 1С AM-1,-2,-3), обеспечивающих контактные взаимодействия иммунных эффекторов и клеток-мишеней [Eukaszewicz М. et al, 2007; KimD. Et al, 2009].
Таким образом может быть обусловлено долговременное повышение иммунореактивности, которая, вероятно, приводит к гибели опухолевых клеток. В результате выявлено снижение интенсивности наследственного опухолеобразования при том и другом режиме применения адгезиогенного препарата в виде сухой формы.
Следует подчеркнуть, что профилактические в отношении опухолей эффекты препаратов принято корректным выявлять либо при лечебном воздействии на предраковое заболевание, либо учитывая превентивное действие на спонтанное опухолеобразование у линейных животных. В наших предыдущих работах показан лечебный эффект водно-спиртовой формы фм-40 в отношении предракового заболевания лейкоплакии слизистой оболочки полости рта [Бочарова О.А., Чекалина Т.Л. и др., 2003; Бочарова О.А., Пожарицкая М.М. и др. 2004б)в)], а также его профилактическое действие в отношении спонтанного опухолеобразования у самцов высокораковой линии СВА [Бочарова О.А., Бочаров Е.В. и др., 20146)]. Следовательно, с высокой долей вероятности можно утверждать, что фм-40 в виде сухого экстракта также обладает профилактическим действием в отношении опухолевых заболеваний.
Морфологическое исследование ткани печени высокораковых мышей в разных режимах применения сухого экстракта фитоадаптогена
Из таблицы следует, что средняя продолжительность жизни мышей контрольной группы составила 665,0±20,1 дней (22,1±0,7 месяца). Во 2-й группе при введении комплексного фитоадаптогена в форме сухого экстракта в профилактическом режиме (примерно, за пять месяцев до возникновения гепатом) выживаемость животных увеличилась до 778,6±19,1 дней (25,6±0,4 месяцев, pi_2 0,001). Таким образом, разница в выживаемости мышей между первой и второй группой оказалась 113 дней. В 3-й группе при введении препарата с шестимесячного возраста и на протяжении дальнейшего онтогенеза) выживаемость мышей повысилась до 811,5±26,8 дней (26,7±0,9 месяцев, рьз 0,001). Следовательно, мыши 3-ей группы жили более длительно, по сравнению с контрольной группой на 146 дней.
На рисунке 17 представлены кривые выживаемости мышей-самцов линии СВА при разных схемах введения сухого экстракта комплексного фитоадаптогена фм-40. На основании построенных (по методу Каплан-Мейера) графиков, следует, что медиана выживаемости животных контрольной группы составила 617,0 дней (20,5 месяцев). Этот же показатель в опытных группах равен 760,0 дней (2-я группа) и 805,0 дней (3-я группа), или 25,3 и 26,8 мес соответственно. Таким образом, разница по этому показателю между 1-й и 2-й группой составляет 143 дня, в то время как между 1-й и 3-ей - 188 дней.
Вместе с тем, следует указать, что самый высокий показатель выживаемости во 2-й группе (1 мышь) составил 1001 день (ЗЗмес). В 3 группе самый высокий показатель выживаемости отмечен у 2 животных -1094 дня (36 мес). В контрольной группе ни одно животное не пережило 1000 дней. Максимальная продолжительность жизни в контроле выявлена у 2 мышей - 990 дней (32 мес). Самая низкая выживаемость в контрольной группе составила 410 дней (14 мес, 11 дней). В опытных группах 2 и 3 самая низкая выживаемость была зафиксирована на уровне 570 дней (19 мес) и 547 дней (18 мес) соответственно.
Как видно из представленных результатов, показатели продолжительности жизни в опытных группах 2 и 3, так же как и медианы выживаемости, значимо превосходят таковые в контроле.
Таким образом, продолжительность жизни мышей, наследственно предрасположенных к возникновению гепатом, в среднем не достигает двухлетнетнего возраста.
Выживаемость высокогепатомных животных, подверженных кратковременному в раннем и долговременному в зрелом онтогенезе воздействию комплексным фитоадаптогеном в сухой форме достоверно превышает таковую у мышей без применения препарата.
Оба режима использования сухого экстракта комплексного фитоадаптогена способствует удлинению жизни экспериментальных мышей практически на 113 дней (более 3 мес) и 146 дней (более 4 мес) соответственно. Между тем, если сравнивать эффекты разных режимов воздействия препарата по медиане выживаемости, то последняя при использовании препарата в течение 1-го мес раннего онтогенеза превышает контрольную величину на 143 дней (около 5 мес), в то время как при воздействии в зрелом онтогенезе - на 188 дней (примерно на 6 мес).
Вместе с тем во 2-й группе 1 мышь (2,7%) прожила 1001 день (33 мес). При этом у самца выявили 1 гепатому объемом 520 мм . В 3-й группе 7 мышей (17,1%), принимавших сухой экстракт, прожили больше 1000 дней, что в среднем составило 1076±17,5 дня (около 35 мес), что соответствует примерно 99 человеческим годам. Рекорд по долгожительству при этом побили 2 самца, прожившие 1094 дня (36 мес, или 3 года), что соответствует 102-м человеческим годам. У этих самцов наблюдали по одной опухоли объемом 260,0 и 28,1 мм3.
Таким образом, в данной работе получены результаты увеличения продолжительности жизни у высокораковых мышей-самцов на 17% при введении сухого экстракта фм-40 в раннем онтогенезе и на 22% при введении препарата в зрелом онтогенезе. Эти результаты, вероятно, имеют существенное значение, учитывая тот факт, что при этом выявлен противоопухолевый эффект. Сопоставляя полученные результаты по увеличению продолжительности жизни экспериментальных мышей с данными других исследователей, можно отметить их значимость.
В частности, генетическая модификация гормонов гипофиза, щитовидной железы, ферментов поджелудочной железы, рецепторов инсулина, гормона роста привела в созданию уникальных мышей (в единственном числе), которые прожили соответственно около 4-х лет (мышь Yoda) [Ladiges W. et all, 2009], свыше 4-х лет (1551 день, мышь Чарли) и 1819 дней (последняя не дожила 6 дней до своего пятилетия) [Bartke А., 2007; Jiang Н. et all., 2008]. В основном большинстве исследователи пытаются продлить жизнь мышам, используя низкокалорийную диету. Так, с помощью ограничения калорийности питания американские ученые добились замедления процессов старения у группы лабораторных мышей. Шестеро из них прожили в среднем 1356 дней (примерно 3,5 года) при хорошем качестве жизни, что особенно подчеркивается [Schumacher В. et all, 2008]. Однако в этих исследованиях продление жизни зафиксировано у мышей без опухолевых патологий [Blagosklonny М. et all., 2009].
Вместе с тем нашей работе ближе результаты, полученные при введении скрещенным инбредным мышам (C57Bl/6xBALB/c) антибиотика рапамицина. Рапамицин, введенный в пищу мышам, начиная с возраста 270 и 600 дней, приводил к увеличению выживаемости на 14% у самок и 9% у самцов, замедляя рост опухолей, процессы старения, либо то и другое у мышей, предрасположенных к развитию опухолей. Рапамицмн - антибиотик, синтезируемый почвенной бактерией Streptomyces hygroscopicus. Известно, что рапамицин и низкокалорийная диета подавляет TOR-сигнальный путь, в том числе рапамицин-киназу и увеличивает таким образом выживаемость беспозвоночных, включая дрожжи, нематоды и дрозофилы. Низкокалорийная диета для продления жизни может применяться только, начиная с раннего онтогенеза. Иначе выживаемость не увеличивается. Низкокалорийная диета также вызывает снижение веса животного. Рапамицин может продлевать жизнь без снижения веса животных, если его применять и в среднем и в позднем онтогенезе. Однако рапамицин имеет побочные эффекты, являясь иммуносупрессором. Следовательно, испытания рапамицина на человеческом контингенте практически не возможны [Harrisson D. et all., 2009; Miller R.A., Harrison D.E. et al, 2011].
Мы продемонстрировали, что сухая форма нетоксичного и неканцерогенного комплексного фитоадаптогена, применяемого с питьевой водой в раннем, среднем и позднем онтогенезе, увеличивала выживаемость мышей, повышала вес животных и вызывала иммуномодулирующий эффект, не обладая побочными эффектами. Это отличает наши результаты от таковых с рапамицином и низкокалорийной диетой.
Поэтому полученные результаты значимы для обсуждения механизмов противоопухолевых и геропротекторных эффектов препарата, а также для дальнейших исследований его использования для лечения и профилактики возрастных заболеваний у людей.