Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современные представления о диагностике и лечении мышечно-неинвазивного рака мочевого пузыря (обзор литературы) 11
1.1 Статистические данные о раке мочевого пузыря, этиопато-генетические аспекты 11
1.2 Диагностика и пути профилактики рака мочевого пузыря 19
1.3 Классификация мышечно-неинвазивного рака мочевого пузыря 20
1.4 Лечение мышечно-неинвазивного рака мочевого пузыря,
методы и результаты 26
1.5 Использование магнитного поля у онкологических больных 44
Глава 2. Материалы и методы исследований 47
2.1 Характеристика больных 47
2.2 Методика проведения адьювантной внутрипузырной химиотерапии 55
2.3. Методика иммунологических исследований 56
2.4. Методики биохимических исследований 57
2.5. Методики экспериментов 59
2.6. Методы статистического анализа 60
Глава 3. Экспериментальное исследование возможности повышения проницаемости мембран опухолевых клеток к цитостатикам под влиянием сканирующих магнитных полей 61
3.1 Результаты изучения противоопухолевой эффективности СК МП при использовании их в качестве самостоятельного фактора воздействия на рост саркомы 45 (без введения химиопрепаратов). 62
3.2 Изучение противоопухолевого влияния СК МП в сочетании с перитуморальным введением циклофосфана in vivo 64
3.3 Изучение некоторых биофизических механизмов влияния СК МП в сочетании с введением цитостатиков (доксорубицина и цисплатина) и накопления их в клетках саркомы-45 66
3.3.1. Исследование влияния СК МП на биодоступность в клетки опухоли доксорубицина 66
3.3.2. Исследование влияния СК МП на биодоступность в клетки опухоли цисплатина 72
З.З.З.Исследование влияния СК МП на биодоступность гемцитабина в клетки опухоли мочевого пузыря 76
Глава 4. Оценка эффективности внутрипузырной химиотерапии рака мочевого пузыря в сочетании с применением магнитного поля 83
Глава 5. Изучение содержания белков острой фазы, оценка функционального состояния альбумина и уровня эндогенной интоксикации у больных мышечно-неинвазивным раком мочевого пузыря при внутрипузырной химиотерапии гемцитабином при воздействии сканирующего магнитного поля 102
Глава 6. Изучение структуры интегральных адаптационных реакций при адъювантной внутрипузырной химиотерапии рака мочевого пузыря с применением магнитного поля 117
Выводы 142
Практические рекомендации 144
Литература 145
- Диагностика и пути профилактики рака мочевого пузыря
- Методика иммунологических исследований
- Изучение противоопухолевого влияния СК МП в сочетании с перитуморальным введением циклофосфана in vivo
- Изучение содержания белков острой фазы, оценка функционального состояния альбумина и уровня эндогенной интоксикации у больных мышечно-неинвазивным раком мочевого пузыря при внутрипузырной химиотерапии гемцитабином при воздействии сканирующего магнитного поля
Введение к работе
Актуальность проблемы. Рак мочевого пузыря (РМП) остается важнейшей проблемой в онкологии. По данным ВОЗ распространенность данной патологии в мире составляет около 4 % , это около 500 000 тысяч новых случаев в год (11-я по частоте встречаемости форм рака), особенно высоки показатели заболеваемости в развитых странах (Каприн А.Д., Старинский В.В., Петрова Г.В., 2015; SEER Cancer Statistics Review., 2014). Заболеваемость РМП в России составляет около 10 на 100 000 населения по данным за 2013г., что составляет прирост 2003г. по 2013г 16%. В Южном-Федеральном округе за 2013г. заболеваемость РМП составила 1500 человек, из них в Ростовской области 450 человек. Мужское население болеет в 3,5 раза чаще женского. Как и для большинства больных с впервые выявленными злокачественными новообразованиями средний возраст больных РМП равен 67 годам, однако с 30 лет показатели заболеваемости удваиваются каждые 5 лет (Каприн А.Д., Старинский В.В., Петрова Г.В., 2015).
Рак мочевого пузыря занимает лидирующее место (70 %) среди опухолей мо-чевыделительного тракта. Это тяжелое инвалидизирующее заболевание, для которого, несмотря, на разработку систем активного выявления, требуется тщательная дифференциальная диагностика, в связи с большой склонностью к рецидиви-рованию и прогрессированию (Чиссов В.И., Дарьялова С.Л., 2009).
Заболеваемость раком мочевого пузыря ежегодно возрастает, особенно в индустриально развитых странах, как в абсолютном числовом выражении, так и по отношению к частоте рака большинства других локализаций Вместе с тем, результаты лечения больных с данной патологией имеют лишь незначительную тенденцию к улучшению. Это связано со многими анатомо-физиологическими особенностями, способностью опухоли к рецидивированию с частотой возникновения рецидивов после органосохраняющих операций, составляющей 50-90%( Чиссов В.И., Дарьялова С.Л.,2000, Amling C.L.2001).
Особую проблему представляет лечение опухолей мочевого пузыря с инвазией не глубже слизистого и подслизистого слоя (Та,Т1N0M0), встречающихся в 70% случаев. Основным методом хирургического лечения рака мочевого пузыря без инвазии мышечной оболочки является трансуретральная резекция. Частота рецидивов при хирургическом подходе составляет 52%.(Матвеев Б.П. ,2003г). Адъювантная внутрипузырная химиотерапия и БЦЖ-терапия снижают частоту развития рецидива и прогрессирования заболевания до 37% (Матвеев Б.П. ,2003г). Однако эти высокие показатели свидетельствуют о необходимости дальнейшего повышения эффективности лечения (Серегин И.В., Самойленко В.М., 2009). Кроме того, у некоторых больных отмечаются общие и локальные осложнения в виде циститов различной степени тяжести, аллергических реакций и прочих изменений, не купирующихся к моменту следующей инстилляции. Это приводит либо к отмене внутрипузырной химиотерапии, либо - увеличению сроков лечения, а значит, снижает эффективность профилактирования рецидивов заболевания. Возрастает актуальность поиска факторов модулирующих внутрипузырную терапию рака мочевого пузыря.
Степень разработанности темы. В связи с высоким процентом рецидиви-рования мышечно-неинвазивного рака мочевого пузыря идет поиск эффективных и менее токсичных фармакологических препаратов. Одним из перспективных препаратов для внутрипузырной терапии при раке мочевого пузыря без инвазии мышечной оболочки является гемцитабин. Это противоопухолевый препарат из группы антиметаболитов. По данным исследований при системном применении, гемцитабин в мочевом пузыре оказывает необходимое воздействие, вызывающее гибель опухолевых клеток, и характеризуется умеренным уровнем токсичности по отношению к ткани мочевого пузыря (Серегин И.В., Самойленко В.М., 2009; Addeo R. et al. 2010).
Наряду с этим осуществляется разработка способов модификации лекарственного лечения с помощью физических факторов, снижающих количество
5 осложнений при внутрипузырной химиотерапии и улучшающих биодоступность
и действенность химиопрепаратов. С этой целью используется электромагнитное поле, электромагнитная СВЧ-гипертермия, ультразвуковое излучение, лазер, фо-рез (Гранов А.М. и соавторы, 1997г.; Колганов А.С, 2006г.; Теплов А.А. и соавторы, 2010г.; Павленко К.А., Кочин А.В., 2011г). Развитие технологии электромагнитных воздействий определяет новые перспективные способы целевой доставки лекарственных веществ в ткани, возможности увеличения проницаемости тканей мочевого пузыря для химиопрепарата при внутрипузырной терапии, за счет сканирования частоты сигнала и сложной структуры поля. Электромагнитное воздействие обеспечивает возможность охвата всего объема мочевого пузыря, оптимизирует транспорт препарата в ткани, следовательно, повышает барьеры опухолевой прогрессии.
Все перечисленное указывает на необходимость разработки новых вариантов внутрипузырной химиотерапии мышечно-неинвазивного рака мочевого пузыря.
Цель исследования. Улучшить результаты лечения больных мышечно-неинвазивным раком мочевого пузыря путем применения внутрипузырной химиотерапии, модифицированной сканирующим электромагнитным полем.
Поставленная цель достигалась решением следующих задач:
-
Разработать в эксперименте способ повышения эффективности химиотерапии с помощью сканирующего электромагнитного поля на моделях опухолей in vivo, изучить изменения мембранной проницаемости клеток опухоли методом флуоресцентных зондов in vitro.
-
Разработать методику внутрипузырной химиотерапии путем введения хи-миопрепаратов в сочетании с одновременным локальным воздействием сканирующим электромагнитным полем.
-
Изучить в сравнительном аспекте непосредственные и ближайшие результаты лечения больных мышечно-неинвазивным раком мочевого пузыря после
6 адьювантной внутрипузырной химиотерапии в сочетании со сканирующим электромагнитным полем.
4. Дать комплексную оценку разработанной методики адьювантной внутри-пузырной химиотерапии модифицированной сканирующим электромагнитным полем на основе изучения биохимических, иммунологических показателей и структуры адаптационных реакций у больных мышечно-неинвазивным раком мочевого пузыря.
Научная новизна работы
В диссертационной работе впервые:
- исследовано в эксперименте противоопухолевое влияние сканирующего
электромагнитного поля, как самостоятельного фактора, так и в сочетании с хи
миотерапией; выявлены эффекты торможения роста перевивных опухолей у жи
вотных и показана возможность повышения проникновения цитостатиков в опу
холевые клетки, приводящая к полной регрессии злокачественного образования;
разработана новая малоинвазивная методика адъювантной внутрипузырной химиотерапии, модифицированной сканирующим электромагнитным полем у больных мышечно-неинвазивным раком мочевого пузыря, позволяющая достоверно улучшить показатели 2-х летней безрецидивной выживаемости путем целевой доставки лекарственного препарата;
исследованы и сравнены показатели, характеризующие адаптационные реакции организма, иммунный статус, содержание белков острой фазы в плазме крови, функциональное состояние альбумина и выраженность эндогенной интоксикации в крови больных мышечно-неинвазивным раком мочевого пузыря после адь-ювантной внутрипузырной химиотерапии в сочетании со сканирующим электромагнитным полем, свидетельствующие о нормализации гомеостатических параметров и повышении неспецифической резистентности организма.
Новизна предлагаемой методики подтверждена решением патентной экспертизы о выдаче патента на изобретение №2527154 от 27 августа 2014 года заявка
7 №2013113844/14 (020451) «Способ повышения биодоступности химиопрепаратов
в опухоль», и получением приоритетной справки от 10.07.2014г по заявке
№2014128367 на изобретение «Способ лечения рака мочевого пузыря».
Теоретическая и практическая значимость работы
Разработана и клинически апробирована методика адъювантной внутрипу-зырной химиотерапии гемцитабином мышечно-неинвазивного рака мочевого пузыря с одновременным локальным воздействием сканирующим электромагнитным полем, позволяющая статистически достоверно увеличить продолжительность безрецидивного периода с 6 до 18 месяцев и более. Удовлетворительная переносимость и малоинвазивность оригинальной методики и, вследствие этого, высокая выполнимость позволяют использовать е в специализированных онкологических учреждениях.
Методология и методы диссертационного исследования
Диссертация логически структурирована и состоит из экспериментального раздела и клинической части. Использованы экспериментальные методы воспроизведения опухолевого процесса, экспериментальная противоопухолевая терапия физическими факторами, экспериментальные исследования методом флуоресцентной микроскопии на клеточных взвесях опухолевых тканей животных и человека, обосновывающие целесообразность применения сканирующего электромагнитного поля в клинике. В клинической части исследования использовались лабораторно-инструментальные, биохимические, иммунологические, биофизические, статистические методы исследования, доказывающие эффективность проведения адъювантной внутрипузырной химиотерапии модифицированной сканирующим электромагнитным полем.
Основное положение, выносимое на защиту
Оптимизация внутрипузырной химиотерапии рака мочевого пузыря достигается с помощью сканирующего электромагнитного поля, путем повышения проницаемости мембран опухолевых клеток к цитостатикам, нормализации систем-
8 ных показателей гомеостаза, включая интегральные адаптационные реакции. Разработанная методика адъювантной внутрипузырной химиотерапии модифицированная сканирующим электромагнитным полем, выполняемая после трансуретральных резекций мочевого пузыря у больных мышечно-неинвазивным раком мочевого пузыря улучшает непосредственные и отдаленные результаты лечения, снижая частоту возникновения рецидивов.
Внедрение результатов исследования
Разработанная новая методика адъювантной внутрипузырной химиотерапии, модифицированная сканирующим электромагнитным полем, внедрена в работу отделения онкоурологии ФГБУ РНИОИ МЗ РФ.
Степень достоверности результатов диссертации
Результаты получены на сертифицированном оборудовании.
Экспериментальная часть исследования выполнена на 126 белых беспородных крысах-самцах с перевивной саркомой 45. В клиническую часть исследования было включено 60 больных мышечно-неинвазивным раком мочевого пузыря. Объем проведенных исследований достаточен для решения поставленных задач и не вызывает сомнений в достоверности полученных результатов.
Личный вклад автора
Автором осуществлн анализ отечественной и зарубежной литературы по исследуемой проблематике. Разработаны план и программа исследования, определены и освоены методики исследования. Автором осуществлены обобщение, анализ полученных материалов, сформулированы выводы и практические рекомендации, оформлена диссертация.
Апробация работы
Апробация диссертации состоялась 14 мая 2015 года на заседании Ученого Совета Ростовского научно-исследовательского онкологического института. Основные положения и результаты диссертации доложены и обсуждены на XVII Международной научной конференции «Онкология - XXI век». г. Эльче (Вален-
9 сия, Испания), 6-12 мая 2013г., II научно-практической конференции с международным участие «Медицина: достижения нового века» 24-26 февраля 2013г., XVIII Международной научной конференции онкологии-XXI века, ASCO Annual-Meeting 2014, IV международной научно-практической конференции "Актуальные направления фундаментальных и прикладных исследований" 4-5 августа 2014 г., всероссийской конференции молодых ученых-онкологов, посвященная памяти академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной клинической онкологии» 25 апреля 2014 г.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Основные научные положения и выводы, описанные в диссертационной работе, соответствуют паспорту специальности 14.01.12 – онкология, п.1.-осуществление профилактики возникновения злокачественных опухолей на основе изучения факторов внешней и внутренней среды организма -
Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 12 печатных работах (из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России).
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 166 страницах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов исследования, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, включающего 184 литературных источников (69 отечественных (40 источников за последние 10 лет) и 122 зарубежных), работа содержит 28 таблиц и 20 рисунков.
Диагностика и пути профилактики рака мочевого пузыря
Как было показано выше, РМП представляет собой распространенную злокачественную опухоль с существенными социальными последствиями для здравоохранения. Программы первичной профилактики наиболее тесно связаны с этиологией РМП и включают в себя влияние на курение, профессиональные вредности, сопровождающиеся контактом с ароматическими аминами и полициклическими углеводородами. На данные причины приходится приблизительно 70% всех случаев повышенного риска, и первичная профилактика, устраняющая эти риски, играет важную роль в сохранении общественного здоровья (Burger M. et al., 2012). Отказ от курения после консультации специалистами и под контролем врачей общей практики - важная мера первичной профилактики РМП. Другие программы первичной профилактики нацелены на ликвидацию профессиональных вредностей в промышленности. Принятые меры безопасности для профилактики РМП, связанного с профессиональной деятельностью, снизили заболеваемость, но последние популяционные исследования все-таки относят к данной патологии около 7% возникновения заболевания (Burger M. et al., 2012). Промышленные предприятия, использующие красители, химикаты, резиновую продукцию, должны четко объяснять риски длительного воздействия этих агентов работникам, которые кроме ношения средств защиты в течение рабочего дня должны периодически проходить медицинские осмотры, по крайней мере, цитологическим исследованием мочи (Brausi M.A., 2012).
Раннее выявление данной патологии дополняет первичную профилактику в качестве другой важной стратегии снижения смертности от РМП. Скрининг для ранней диагностики РМП подвергся широкой критике как в значительной степени неэффективное мероприятие. В качестве необходимого условия для всех скрининговых тестов в мире, ВОЗ требует наличия валидных, достоверных и недорогих тестов с приемлемой чувствительностью, специфичностью и высокой положительной прогностической ценностью. В 2010 г. U.S. Preventive Services Task Force (USPSTF) в своем обзоре не обнаружило исследований, которые бы - 19 адекватно оценивали чувствительность или специфичность тестов на гематурию, цитологию мочи или уринарные биомаркеры у лиц с отсутствием симптомов (Moyer V.A., 2011). Однако три исследования, включенные в UPSTSF - обзор, продемонстрировали связь между скринингом и снижением риска смертности от РМП. К сожалению, эти исследования трудно интерпретировать из-за существенных методологических недостатков. Требуется дальнейшее изучение диагностической точности скрининг-тестов мочи, в том числе новых, таких, как UroVysion FISH (флуоресцентная гибридизации in situ), ImmunoCyt и NMP-22 (белков ядерного матрикса) в репрезентативных популяциях (Messing E.M. et al., 2006).
Слизистая мочевого пузыря, как известно, выстлана уротелиальными переходными клетками, которые могут трансформироваться в различные злокачественные опухоли. В Европе и США значительное большинство РМП демонстрирует уротелиальное происхождение, далее следуют значительно менее распространенные гистологические типы: саркомы, перстневидно-клеточная карцинома, плоскоклеточная карцинома, мелкоклеточная карцинома и аденокарциномы (Lopez-Beltran A., 2008). Упомянутые неуротелиальные злокачественные опухоли редкие, но весьма высокозлокачественные, быстро распространяющиеся новообразования с плохим прогнозом.
Понимание морфологии уротелиальньной карцинома имеет решающее значение в определение прогноза как наиболее важного фактора риска прогрессирования - это класса опухоли, а не стадия заболевания (Millan-Rodriguez F. et al., 2000). Классификация опухолей мочевого пузыря ВОЗ (2004) представляет стандартную систему, используемую в клинике (Андреева Ю.Ю., Франк Г.А., Завалишина Л.Э., 2005; Montironi R., Lopez-Beltran A., 2005). Деление на низкозлокачественнные («low-grade») и высокозлокачественнные («high-grade») классы пришло на смену старой системе с устранением 2 класса заболевания, который зачастую был источником значительных вариаций. Кроме
- 20 того, папиллярная Ta grade 1 опухоль на сегодняшний день нередко описывается как доброкачественный процесс благодаря крайне индолентному течению.
До 80% уротелиальньных неинвазирующих мышечный слой опухолей на момент клинической манифестации могут включать папиллярные уротелиальньные новообразования с низким злокачественным потенциалом (PUNLMP), CIS, низко- и высокозлокачественнные уротелиальньные карциномы. Мышечно-инвазивный РМП по определению высокозлокачественное новообразование с распространением через субэпителиальную соединительную ткань в мышечную.
Среди неинвазивных опухолей наименее агрессивны папиллярные уротелиальные опухоли с низким злокачественным потенциалом (PUNLMP), их выделяют в отдельную категорию от папиллом из-за более высокой способности к рецидивированию (Montironi R., Lopez-Beltran A., 2005). Аналогично доброкачественным папилломам, уротелиальные опухоли с низким злокачественным потенциалом (НЗП) при морфологическом исследовании демонстрируют минимальную цитологическую атипию с утолщением слоя клеток, содержащих более крупными ядра, с редкими митотическими фигурами. Прогрессирование в инвазивный рак или развитие метастатической болезни наблюдается редко, но рецидивирование после резекции возникает у одной трети больных (Holmang S., Johansson S.L., 2002; Oosterhuis J.W. et al., 2002; Montironi R., Lopez-Beltran A., 2005). Несмотря на доброкачественное, по сути, течение уротелиальных опухолей с НЗП рекомендации ВОЗ содержат следующее заявление: «пациенты с этими опухолями имеют риск развития новой опухоли мочевого пузыря, как правило, аналогичной гистологии, поэтому последующее наблюдение за пациентами является оправданным» (Epstein J.I. et al., 1998).
В отличие от доброкачественного клинического течения, ассоциируемого с уротелиальными опухолями с НЗП, CIS характеризуются более высокими темпами прогрессирования, являясь высокозлокачественными опухолями в пределах поверхностного эпителия (Montironi R., Lopez-Beltran A., 2005). Морфологический диагноз основывается на присутствии тяжелой ядерной - 21 анаплазии и потери клетками присущих им особенностей. Опухолевые клетки имеют тенденцию к увеличению с умеренной или обильной цитоплазмой и грубым хроматином. По определению, CIS высокозлокачественные поражения, связанные с генетическими изменениями, встречающимися в других высокозлокачественных уротелиальных новообразованиях. Аномальная экспрессия цитокератина 20, белков р53 и RB, наличие NMP-22 может коррелировать со степенью ответа на БЦЖ (Bacillus Calmette-Guerin) терапию (Cordon-Cardo C., Cote R.J., Sauter G. 2000.). CIS можно отличить от других высокозлокачественных опухолей путем оценки внешнего вида при цистоскопии. CIS имеют красноватый бархатистый внешний вид и иногда могут быть ошибочно приняты за отечные изменения последствия лучевого цистита. Несмотря на свое скромное название, CIS быстро прогрессируют до инвазивного РМП, а в некоторых случаях способны к стелющемуся «педжетоидному» распространению на мочеточники и простатическую часть уретры (Montironi R., Mazzucchelli R., Scarpelli M. 2002.). Низкозлокачественнные папиллярные уротелиальные карциномы проявляются фиброваскулярными стеблями и папиллярными ветвлениями с меньшей ядерной атипией. Генетические аномалии отличаются от высокозлокачественных поражений и часто включают делецию 9q (Holmang S. et al. 2001.). Данные опухоли иммунореактивны для цитокератина-20 и CD-44. Широкий спектр цитологических и структурных аномалий может существовать в пределах одного очага поражения, поэтому нельзя недооценивать важность изучения всего образца в целях регистрации наиболее выраженных ненормальностей. Прогрессируют эти опухоли редко и в большинстве наблюдений представлены одиночными поражениями (Miyamoto H. et al. 2010.).
Методика иммунологических исследований
Материалом для биохимических исследований служила кровь, плазма или эритроциты больных МНРМП и здоровых доноров. Забор крови производили из локтевой вены в утреннее время натощак. Кровь забирали в стеклянные пробирки, содержащие раствор гепарина (1000ЕД/мл) из расчета 0,05 раствора на 1мл крови, которую затем центрифугировали при 1500 об/мин. в течение 20 мин. Биохимические показатели определялись у больных МНРМП до начала лечения, сразу после завершения комбинированного лечения и через 3 мес. после выполнения ТУР опухоли мочевого пузыря и практически здоровых людей, условно обозначенных донорами, сопоставимых по основным антропометрическим данным с лечившимися пациентами. Для изучения влияния различных вариантов комбинированного лечения на состояние дезинтоксикационных систем организма были исследованы следующие биохимические тесты эндотоксикоза: уровень общей концентрации альбумина (ОКА) унифицированным колориметрическим методом (Ольвекс Диагностикум, Спб.), уровень эффективной концентрации альбумина (ЭКА) по методу С. А. Чегера в модификации И. А. Мельника., П. В. Барановского 1985г. Выраженность токсемии у больных изучали по содержанию молекул средней массы (МСМ) при двух длинах волн: 254нм и 280 нм, методом Габриэляна Н. И., Липатовой В.И. 1984 г. Степень сорбции токсических лигандов или связывающую способность альбумина (ССА) оценивали по отношению ЭКА/ОАК100%, что соответствует отношению свободных связей пула молекул альбумина к общему количеству его связей. Сорбционную способность молекулы альбумина оценивали с помощью индекса токсичности (ИТ), рассчитываемый по формуле ИТ=ОКА/ЭКА-1, по Ю. А. Грызунову., Г. Е. Добрецову 1994 г. Дополнительно, рассчитывали коэффициент интоксикации, отражающий баланс между накоплением и связыванием токсических лигандов по формуле, предложенной С.Б. Матвеевым и коллегами в 2003г. КИ=(МСМ254/ЭКА) 1000.
Для оценки состояния окислительного метаболизма в динамике лечения изучены показатели интенсивности свободнорадикальных процессов и функционирования антиоксидантной системы крови. Об интенсивности образования радикалов в плазме судили по световой сумме быстрой вспышки перекись-индуцированной люминолзависимой хемилюминесценции (ХЛ), отражающей содержание супероксид-анион радикала и гидроксильного радикала (Шестаков В.А. и соавт.1979.). Интенсивность липопероксидации оценивали спекторфотометрическим методом по накоплению в плазме продуктов реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-активных соединений) в пересчете на концентрацию малонового диальдегида (МДА) (Стальная И.Д., Горешвили Т.Г. 1977.). Состояние ферментативного звена антиоксидантной системы в 1% гемолизата эритроцитов изучали посредством определения активности супероксиддисмктазы (СОД), каталазы, глутатионпероксидазы (ГПО), глутатионтрансферазы (ГТ), глутатионредуктазы (ГР) и активности каталазы в плазме общепринятыми спекторфотометрическими методами. Активность супероксиддисмутазы в эритроцитах крови определяли методом H. P. Misra., I.Fridovich 1972 г. Активность каталазы в эритроцитах и плазме крови определяли колориметрически с молибдатом аммония по методу М. А. Королюка и соавт. 1988 г. Активность глутатионзависимых ферментов определяли в эритроцитах: глутатионпероксидазы по по методу В.П. Моин 1986 г.; глутатионредуктазы по - 58 методу А.Б. Юсупова 1989 г.; глутатионтрансферазы по методу А. В. Арутюняна и соавт. 2000 г. Исследованы компоненты неферментативного звена антиоксиданнтной системы, а именно содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах, оксидазную активность и содержание церрулоплазмина в плазме. Содержание восстановленного глутатиона в эритроцитах определяли по методу А. В. Арутюняна и соавт. 2000 г. Содержание церрулоплазмина на биохимическом анализаторе COBAS INTEGRA 400 (Roche), а оксидазную активность церрулоплазмина колориметрическим методом.
Опыты проводились на 126 белых беспородных крысах-самцах с перевивной саркомой 45 с соблюдением международных норм и стандартов гуманного обращения с животными. Штамм клеток С-45 предоставлен институтом канцерогенеза РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Переменное магнитное поле в сканирующем режиме частот от 1 до 150 Гц, индукцией 20 мТл (СК МП) и постоянное магнитное поле, индукцией 20 мТл создавалось магнитотерапевтическим аппаратом «Градиент-4М». Методика экспериментальной химиотерапии осуществлялось следующим образом: под капсулу краевой зоны опухоли двукратно с интервалом 5 дней производили медленное, капельное введение раствора химиопрепарата (ХП) в количестве 0,5 мл концентрацией 0,5 мг/мл и одновременно осуществляли двустороннее воздействие на опухоль магнитным полем с помощью разнополюсных индукторов. Изучали динамику роста опухоли, путем замера и вычисления объема по формуле для эллипсоида: Vоп= аbc/6 (см3). По окончанию эксперимента животных декапитировали, определяли весовые параметры тимуса, надпочечников. Осуществляли идентификацию интегральных адаптационных реакций по показателям лейкограммы Шиллинга в мазках крови, окрашенных по Романовскому-Гимза, посчитанных на 200 клеток. Методом флуоресцентной микроскопии изучали изменения интенсивности флуоресценции, для чего использовали липофильный флуоресцентный зонд катион ДСМ (4-(n-диметил-- 59 аминостирил)-1-метилпиридиний) и зонд анион АНС (1-анилино-нафталин-8-сульфонат) с исследованием под люминесцентным микроскопом AxioImager. M2 Zeiss. Микросъемку препаратов осуществляли цифровой камерой AxioCamHRC, а измерения проводились с помощью программного обеспечения AxioVision, rel.4.8, инструмента Outline. Объем измерений включал от 100 до 400 клеток опухоли в каждой пробе с длиной волны возбуждения ДСМ - 480 нм с волной эмиссии 520 нм, для АНС эти параметры составили 375 нм и 450 нм соответственно.
Изучение противоопухолевого влияния СК МП в сочетании с перитуморальным введением циклофосфана in vivo
Таким образом, статистически достоверно доказано позитивное влияние внутрипузырной адъювантной химиотерапии, модифицированной сканирующим магнитным полем, на частоту рецидивирования поверхностного рака мочевого пузыря.
Клинические примеры: Пример №1. Б., 35 лет (ИБ: С-1873/в, АК 2908/в). Находится под наблюдением РНИОИ с февраля 2013 г. Жалобы при поступлении: рези при мочеиспускании, впервые на эти жалобы пациент обратил внимание за 1 месяц до обследования в РНИОИ Данные лабораторно-инструментального обследования. Общий анализ крови от 13.02.13 Клинический диагноз: рак мочевого пузыря T1N0M0. кл.гр 2 Проведено лечение: 13.02.2013 выполнена ТУР мочевого пузыря: выполнена видеоуретроцистоскопия. Объем мочевого пузыря 300 мл, устья мочеточников расположены типично. На левой боковой стенке мочевого пузыря, на 1,5 см выше левого устья экзофитная опухоль до 2,5 см на тонкой ножке. Рис.4.2 Больной Б. (ИБ: С-1873/в) в центре опухоль, расположенная на левой стенке мочевого пузыря, при видеоцистоскопии.
Выполнена трансуретральная резекция и вапоризация опухоли и стенки мочевого пузыря. Гемостаз путем коагуляции. Вид стенки мочевого пузыря после удаления опухоли представлен на рис.4.3.
Гистологический анализ №8253-262 – G2 уротелиальный рак с инвазией субэпителиального слоя Больному определена лечебная тактика: адьювантная внутрипузырная химиотерапия гемцитабином с СК МП и ПМП, 6 процедур, одна процедура один раз в неделю. 14.02.13 Состояние больного удовлетворительное. Жалобы на наличие уретрального катетера. Гемодинамика стабильна. Диурез адекватный около 1700 мл, гематурии нет. Больному начат курс внутрипузырной адьювантной химиотерапии с СК МП и ПМП. Введено внутрипузырно 50 мл раствора гемцитабина в концентрации 40 мг/мл внутрипузырно с одновременным воздействием на область проекции мочевого пузыря сканирующим магнитным полем в сочетании с постоянным магнитным полем от индуктора, установленного в центре между полюсами пары индукторов сканирующего магнитного поля.
Индукция СК МП 10мТл, частота сигнала от 1 до 150 Гц, меняющаяся со скоростью 1 Гц/сек, индукция ПМП 20мТл. Время воздействия 10 минут.
После окончания магнитного воздействия пациент самостоятельно продолжает экспозицию омагниченного раствора химиопрепарата, лежа на правом боку 15 минут, на левом боку 15 минут, на животе 15 минут и на спине 5минут. Время полной экспозиции химиопрепарата составляет 60 минут.
Больной перенес курс адъювантной внутрипузырной химиотерапии, модифицированной СК МП, удовлетворительно. После первого введения химиопрепарата в утренние часы на следующий день отмечалась слабость и не большая тошнота, дополнительных назначений не потребовалось. После второго и третьего введения больной чувствовал себя удовлетворительно. Между четвертым и пятым введением, на третьи сутки после введения, больной отмечал однократный эпизод примеси крови в моче. К моменту пятого введения в ОАМ отмечалось: эритроциты до 10 х, лейкоциты 5-6 х, что позволило введение химиопрепарата. Пятое и шестое введение больной перенес удовлетворительно.
Данные клинических анализов после полного курса адъювантной внутрипузырной терапии. Больному определена лечебная тактика: адъювантная внутрипузырная химиотерапия гемцитабином с СК МП и ПМП, 6 процедур, одна процедура один раз в неделю. 17.05.13 Состояние больного относительно удовлетворительное. Жалобы на дискомфорт связанный с наличием уретрального катетера. Гемодинамика стабильна. Диурез адекватный около 1400 мл, гематурии нет.
Больному начат курс внутрипузырной адьювантной химиотерапии с СК МП и ПМП. Введено внутрипузырно 50 мл раствора гемцитабина в концентрации 40 мг/мл с одновременным воздействием на область проекции мочевого пузыря СК МП и ПМП, установленного в центре между полюсами пары индукторов сканирующего магнитного поля.
Индукция СК МП 10мТл, частота сигнала от 1 до 150 Гц, меняющаяся со скоростью 1 Гц/сек, индукция ПМП 20мТл. Время воздействия 10 минут.
После окончания магнитного воздействия пациент самостоятельно продолжал экспозицию омагниченного раствора химиопрепарата, лежа на правом боку 15 минут, на левом боку 15 минут, на животе 15 минут и на спине 5 минут. Время полной экспозиции химиопрепарата составляет 60 минут.
Больной перенес курс адъювантной внутрипузырной химиотерапии модифицированной СК МП, удовлетворительно. После первого и второго введения химиопрепарата изменения состояния больного не отмечалось. После третьего введения больной отметил появление учащенного мочеиспускания, ложные позывы к мочеиспусканию на протяжении нескольких часов сразу после введения. Жалобы были купированы пероральным приемом спазмолитиков. Остальные введения ВПХТ больной перенес удовлетворительно. Данные клинических анализов после полного курса адъювантной внутрипузырной терапии модифицированной СК МП.
Изучение содержания белков острой фазы, оценка функционального состояния альбумина и уровня эндогенной интоксикации у больных мышечно-неинвазивным раком мочевого пузыря при внутрипузырной химиотерапии гемцитабином при воздействии сканирующего магнитного поля
В основной группе больных при регулярном обследовании в те же сроки – 3, 6, 9, 12 месяцев ни в одном случае признаков рецидива и прогрессирования заболевания выявлено не было. Только спустя еще пол года, на период 18 месяцев в основной группе был зафиксирован один случай рецидивирования НРМП. На момент окончания наблюдений, составляющий 25 месяцев, этот случай остается единственным в основной группе больных. Таким образом, статистически достоверно доказано выраженное эффективное влияние используемого нового метода лечения.
В связи с полученным противоопухолевым эффектом вопрос о локальном влиянии СК МП и ПМП может быть объяснен предварительным исследование мембранных механизмов проницаемости препарата. Однако оставалось неясным, какое состояние внутренней среды и какие механизмы интегральной регуляции обеспечивали такое увеличение безрецидивного периода?
Этому способствовало изучение некоторых биохимических критериев прогноза развития синдрома системного воспалительного ответа С-реактивного белка, гаптоглобина и церулоплазмина. Известно, что эти показатели крови коррелируют с опухолевой прогрессией при многих солидных опухолях как на уровне процессов энергообеспечения, так и стимуляции неоангиогенеза, пролиферации и имунносупрессии опухолевых клеток. Согласно полученным в РНИОИ данным, повышение острофазных белков С-РБ, гаптоглобина и др. имело место у больных саркомой мягких тканей, а при метастазировании и рецидивировании опухолей возрастало еще больше. После проведения ВПХТ в сочетании с СК МП и ПМП содержание С-РБ снизилось на 81,7%, что было сопоставимо с показателями группы сравнения (без онкопатологии). Содержание гаптоглобина оставалось выше нормы, а церулоплазмина – увеличилось.
Для оценки уровня эндогенной интоксикации у больных НРМП до лечения и на этапах динамического наблюдения изучали уровень молекул средней массы (МСМ). После окончания ВПХТ гемцитабином уровень МСМ снизился, но оставался повышенным относительно группы с воздействием СК МП и ПМП и группы без онкопатологии на 19,2 и 36,6% соответственно.
Таким образом, у больных, в комплексном лечении которых была включена модифицированная СК МП и ПМП ВПХТ, имела место ослабление выраженности эндогенной интоксикации. Кроме того, оценивая интенсивность свободнорадикальных процессов методом хемилюминесценции (ХЛ), отражающим интенсивность образования свободных радикалов, накопления процессов ПОЛ и состояние антиоксидантной защиты, можно было видеть следующее. Если до начала лечения исходный уровень свободнорадикальных процессов был повышен, о чем свидетельствовало увеличение светосуммы ХЛ плазмы крови и содержания МДА в эритроцитах, то после ВПХТ модифицированной МП она снизилась почти на 45%, достоверно не отличаясь от значений в группе без онкопатологии. Подобная динамика выявлена по активности МДА.
Важным моментом перестройки биохимического статуса организма стало проявление тенденции к повышению СОД и каталазы к 3-ему месяцу после лечения в сочетании с СК МП и ПМП. Эта тенденция усиливалась и на последующих этапах и к 9 месяцу достигала уровня нормы в плазме крови и эритроцитах.
Подобные нормализующие изменения были характерны и для компонентов системы глутатиона. Итак проведенные биохимические исследования демонстрировали нормализацию параметров эндогенной интоксикации и восстановление сбалансированной работы антиоксидантной системы после приминения модифицированной СК МП и ПМП ВПХТ. Это свидетельствует об адекватности проведенного лечения, а также исходя из соотношения компонентов глутатионовой системы об отсутствии биохимических предпосылок формирования множественной лекарственной устойчивости. Чтобы полнее оценить эффективность противорецидивного влияния проводимого лечения нами была дана оценка интегральных адаптационных реакций организма, как механизма реализации влияния СК МП и ПМП на уровне организма как целого.
Было установлено, что у большинства пациентов основной и контрольной групп в исходном состоянии был представлен весь спектр адаптационных реакций: стресс острый и хронический, тренировка, спокойная и повышенная активация с преобладанием антистрессорных типов (69,6%). Были идентифицированы не только типы реакций, но и признаки их напряжения и неполноценности, связанные с накоплением случаев анэозинофилии, моноцитоза. После завершения лечения ВПХТ и СК МП и ПМП было установлено увеличение в 2 раза частоты развития реакции спокойной активации. Что было обусловлено переходом в эту реакцию из реакции тренировки и стресса в реакцию спокойной активации. При этом было зафиксировано существенное снижение признаков напряжения и неполноценности реакции за счет достоверного снижения случаев анэозинофилии, моноцитоза, а также отсутствия типа реакции переактивации.
Необходимо отметить, что доминирование реакции спокойной активации на протяжение 3-месячного периода наблюдения определило ту неспецифическую основу, которая и обеспечивала безрецидивное течение заболевания. Характеризуя основные черты реакции спокойной активации, необходимо выделить свойственную ей сбалансированную физиологическую стимуляцию регуляторных систем организма гипоталамуса, гипофиза, эндокринных желез, иммунной системы. Симптомокомплекс этой реакции заключается в состоянии умеренного физиологического возбуждения ЦНС, повышении секреции гормонов гипофиза (кроме АКТГ), ускорении процессов созревания и дифференцировки лимфоцитов в иммунных органах.