Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 15
1.1. Роль иммунотерапии при метастатическом почечно-клеточном раке на современном этапе 15
1.2. Общие положения о Т-регуляторных клетках 19
1.3. Иммунорегуляторные функции ингибиторов PD-1/PD-L1 24
1.4. Молекулярно-биологические факторы прогноза 29
1.5. Лабораторно-диагностические критерии прогнозирования 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы 43
2.1. Общая характеристика больных 43
2.2. Метод проточной цитометрии 52
2.3. Специальные биохимические исследования 53
2.4. Иммуногистохимическое исследование 54
2.5. Метод комплексной реносцинтиграфии 55
2.6. Статистические методы исследования 60
ГЛАВА 3. Результаты иммунологического мониторинга больных мпкр, получающих инф-альфа 62
Глава 4. Изучение влияния иммунотерапии инф-альфа на иммунорегуляторные cd4+cd25+foxp3+cd127low т-клетки убольных МПКР 67
ГЛАВА 5. Клиническое исследование по изучению эффективности и токсичности ниволумаба у больных МПКР 76
5.1. Эффективность и токсичность ниволумаба 76
5.2. Прогностическое значение клинико-морфологических и иммунологических факторов у больных мПКР при проведении иммунотерапии ниволумабом 80
ГЛАВА 6. Комплексный мониторинг биохимических и радионуклидных показателей у больных мпкр на фоне иммунотерапии 91
6.1. Анализ биохимических и радионуклидных показателей на фоне иммунотерапии 95
6.2. Прогностическое значение лабораторно-диагностических и биохимических показателей
ГЛАВА 7. Обсуждение результатов 106
Заключение 114
Выводы 118
Практические рекомендации 119
Список сокращений 120
Список литературы
- Общие положения о Т-регуляторных клетках
- Специальные биохимические исследования
- Прогностическое значение клинико-морфологических и иммунологических факторов у больных мПКР при проведении иммунотерапии ниволумабом
- Прогностическое значение лабораторно-диагностических и биохимических показателей
Общие положения о Т-регуляторных клетках
Возможность возникновения спонтанных регрессий и стабилизаций (1% и 20% соответственно) позволила отнести ПКР к разряду иммуногенных и предопределила развитие иммунотерапевтического направления в лечении больных с диссеминированным ПКР. До недавнего времени неспецифические иммунотерапевтические методы с включением ИФН или интерлейкина-2 (ИЛ-2) являлись единственными лекарственными опциями для больных мПКР. Тем не менее частота объективных эффектов в общей популяции больных мПКР оставалась невысокой — всего 10–15 %, а медиана продолжительности жизни и 5 летняя выживаемость не превышали 12 мес. и 5 % соответственно [123]. Следует отметить, что неспецифическая иммунотерапия более эффективна у больных с благоприятными прогностическими характеристиками в соответствии с критериями MSKCC. Согласно критериям MSKCC факторами риска являются: соматический статус по шкале Карновского 80 %, повышение уровня лактатдегидрогеназы в 1,5 раза выше нормы, концентрация скорректированного Ca2+ в сыворотке крови 10 мг/дл, уровень гемоглобина 13 г/дл, время от постановки диагноза до начала лекарственной терапии 1 года [135]. По результатам анализа, представленного R. Motzer et al. в 2002 г., медиана выживаемости у пациентов, которые получали терапию ИНФ еще до внедрения в клиническую практику таргетных препаратов, в группах плохого, умеренного и благоприятного прогноза составляла 4, 10 и 20 мес. соответственно [134]. В рандомизированном клиническом исследовании, в котором изучалась эффективность ИНФ в сравнении с темсиролимусом у ранее не леченных больных с плохим прогнозом, в группе пациентов, получавших ИНФ, время до прогрессирования и общая выживаемость были существенно хуже (10,9 мес. против 7,3 мес.) [90]. Следовательно, терапия интерферонами у больных с плохим прогнозом практически неэффективна, а короткая продолжительность жизни больных с неблагоприятным прогнозом, как правило, не превышающая 7 мес., не позволяет реализоваться противоопухолевому эффекту при назначении более активных препаратов в качестве второй линии. Таким образом, иммунотерапия первой линии у больных с неблагоприятным прогнозом может негативным образом отразиться на показателях общей выживаемости. Следует отметить, что с внедрением в клиническую практику препаратов с целенаправленным («таргетным») механизмом действия (ингибиторы VEGF/VEGFR и mTOR) значительно улучшились результаты терапии больных мПКР всех прогностических групп. В сравнении с группой исторического контроля время до прогрессирования и медиана общей продолжительности жизни в общей популяции больных метастатическими формами ПКР выросли в среднем с 7 до 15 мес. и с 12 до 26 мес. соответственно. В то же время, не до конца определена длительность крайне редких (1%) полных ремиссий, достигаемых с помощью таргетных препаратов, и могут ли они трансформироваться в полное излечение больных, как это может наблюдаться в 1-3% случаев при использовании иммунотерапевтических методов у пациентов с благоприятным прогнозом [91,198].
Альтернативной стратегией по увеличению частоты контроля над заболеванием является комбинирование данных терапевтических подходов. Комбинированная терапия может включать в себя комбинацию таргетных препаратов и иммунотерапии (ИНФ, HD IL-2). Результаты международных рандомизированных исследований AVOREN и GALGB, в которых изучалась эффективность комбинации ИНФ и бевацизумаба в группе больных с благоприятным и промежуточным прогнозом, способствовали существенному удлинению времени до прогрессирования заболевания с 8 до 14,5 мес. Однако, 2 летняя выживаемость в обеих группах оказалась практически идентичной – 72% и 76% соответственно. Количество пациентов, достигших полного или стойкого ответа оставалось небольшим, нет точной информации о значимости ИНФ в данной комбинации [64,161]. Подобные результаты получены при комбинировании бевацизумаба и HD IL-2. Во II фазе исследования эффективность данной комбинации носила аддитивный характер, 8% пациентов достигли полного ответа, что характерно для терапии HD IL-2, и медиана времени до прогрессирования составила 9 мес., что также наблюдается при терапии бевацизумабом в монорежиме. Интересно отметить, что согласно данным небольшого ретроспективного анализа, назначение HD IL-2 после терапии сунитинибом или сорафенибом привело к неожиданно высокому риску кардиотоксичности и не продемонстрировало противоопухолевой эффективности. Поэтому, если рассматривается вопрос о назначении HD IL-2, то лучше проводить ее в качестве терапии I линии. По данным результатов рандомизированного исследования III фазы, в котором проводилось прямое сравнение сунитиниба с монотерапией ИНФ у пациентов с хорошим и промежуточным прогнозом, не было выявлено достоверных различий в общей выживаемости (26.4 vs 21.8 мес. соответственно). Отсутствие различий в общей выживаемости объясняется тем, что в случае прогрессирования на фоне терапии ИНФ 33% пациентов продолжали терапию сунитинибом, и 32% пациентов получали другие ингибиторы VEGF/VEGFR[136].
По этой же причине в других рандомизированных исследованиях показатели общей выживаемости пациентов с благоприятным и промежуточным прогнозом, которые в качестве первой линии получали комбинацию бевацизумаба и ИНФ или пазопаниб, достоверно не отличались от показателей в контрольных группах, которым проводилась терапия ИНФ или плацебо [161, 182].
Все эти данные говорят о том, что существует группа пациентов с благоприятным прогнозом, в отношении которой иммунотерапевтический метод может быть использован в первой линии наравне с таргетным подходом без ущерба для показателей общей выживаемости. Как правило, это пациенты, у которых отсутствуют симптомы заболевания, удалена первичная опухоль и минимальная степень распространения болезни. Так, при наличии метастазов в легких менее 10, размером менее 2см отмечен длительный контроль над заболеванием при использовании интермиттирующего режима ИНФ- в первой линии [10]. Основной целью остается возможность выбора лечебной стратегии на основе модели, включающей не только клинические факторы, но и патологические, молекулярные и биологические характеристики опухоли. Необходимость идентифицировать предикторные факторы ответа (или резистентности) и таким образом определить группу пациентов, наиболее чувствительную для иммунотерапии, остается главной задачей.
Специальные биохимические исследования
В настоящее время проводится изучение растворимых форм PD-L1/PD-1(s). Продемонстрирована отрицательная прогностическая значимость sPD-L1 в плазме у пациентов с диффузной B-крупноклеточной лимфомой. Более того, резкое снижение sPD-L1 на фоне лечения ассоциировалось с полной ремиссией. Отсутствие связи между sPD-L1 и экспрессией PD-L1 указывает на тот факт, что не только опухолевые клетки способны синтезировать данные молекулы (при помощи матриксных металлопротеиназ) в присутствии провоспалительных факторов [28,165].
Точная функция sPD-1 еще до конца не изучена, но описан факт двойного антагонизма. С одной стороны, sPD-1 функционально блокирует и ингибирует иммунорегуляторный эффект связывания PD-1 на активированных Т-клетках с лигандами, активируя антиген-специфический иммунный ответ [177]. С другой стороны, sPD-1 функционирует подобно мембранной форме, демонстрируя иммунную регуляцию за счет обратной передачи сигнала через PD-L1 и PD-L2 к дендритным клеткам, приобретающим супрессивный фенотип [104]. Несколько клинически-опосредованных факторов были изучены в качестве потенциальных биомаркеров к анти-PD-1/PD-L1 терапии. В исследовании II фазы по изучению ниволумаба у пациентов при мПКР медиана общей выживаемости была значительно выше в группе с благоприятным прогнозом согласно MSKCC (n=56) (не достигнута, 95% CI 24,9- не достигнута) по сравнению с промежуточным (n=70) и плохим (n=42) (20,3 мес., 95% CI 13,4- не достигнута и 12,5 мес., 95% CI 8,1-18,6 мес., соответственно, р- не указана) [139,140]. Таким образом, стратификация пациентов согласно MSKCC уместна при иммунотерапии ингибиторами контрольных точек. Также количество предшествующих линий несет прогностический характер. Пациенты, получившие ранее только одну линию (n=50) имели значительно лучшие показатели медианы общей выживаемости (не достигнута, 95% CI 19,8- не достигнута) по сравнении с пациентами, получившими 2 и более линий (n=118) (18,7 мес., 95% CI 13,4-26, р не указана) [139,140]. Таким образом, функциональная значимость экспрессии PD-L1 ограничена опухолевой гетерогенностью, отсутствием стандартов относительно ИГХ пороговых уровеней, недостатком данных насчет преимущества оценки экспрессии на опухолевых клетках или TILs, или обоих. Также в большинстве исследований используется архивный материал. В то время, как динамическая природа иммунной системы и эффект ранее проведенных линий терапии не позволяют архивный материал расценивать репрезентативным относительно статуса PD-L1. Более того, экспрессия PD-L1 несет прогностическую значимость, но не строго предиктивную. Возможно, изучение растворимых форм sPD-L1/PD-1, а также циркулирующих опухолевых cfDNA и microRNA в сыворотке/плазме крови позволят преодолеть опухолевую гетерогенность и идентифицировать наиболее значимые предикторные и прогностические биомаркеры [9].
По данным литературы описаны случаи протеинурии, необратимой почечной недостаточности на фоне иммунотерапии и таргетной терапии у больных мПКР, приводящие к редукции и/или отмене препарата, что может отразиться на объективном ответе [83,100,171,184]. Все больные с мПКР после нефрэктомии автоматически должны быть отнесены к группе повышенного риска развития хронической болезни почек (ХБП).
В начале XXI века Национальным почечным фондом США (National Kidney Foundation – NKF) проведен анализ многочисленных публикаций по вопросам диагностики и лечения заболеваний почек, прогностической роли ряда показателей, терминологических понятий, который лег в основу создания концепции ХБП. В дальнейшем в разработке данной модели принимали участие эксперты Европейской почечной ассоциации – европейской ассоциации диализа и трансплантации (ERA-EDTA), KDIGO (Kidney Disease Improving Global
Outcomes) и ряда национальных нефрологических ситуаций [22].
К настоящему времени понятие и классификация ХБП получили мировое признание. Понятие наднозологическое, базирующееся на единстве основных патогенетических механизмов прогрессирования патологического процесса в почках, общности многих факторов риска развития, прогрессирования заболевания при повреждениях органа разной этиологии и вытекающих отсюда способов первичной и вторичной профилактики. В России признаки ХБП отмечаются более чем у 1/3 больных с хронической сердечной недостаточностью; снижение функции почек наблюдается у 36% лиц в возрасте старше 60 лет. Таким образом, распространенность ХБП сопоставима с такими социально значимыми заболеваниями, как гипертоническая болезнь и сахарный диабет [22].
Стратификация тяжести ХБП согласно KDOQI (National Kidney Foundation Kidney Disease Outcomes Quality Initiative) и KDIGO по уровню скорости клубочкой фильтрации (СКФ) позволило значительно повысить идентификации ХБП (таблица 2) [61,109].
Прогностическое значение клинико-морфологических и иммунологических факторов у больных мПКР при проведении иммунотерапии ниволумабом
Иммуногистохимическое исследование (ИГХ) на PD-L1 и FOXP3 проводилось на базе патологоанатомического отделения (зав. отд. – Н.А. Савелов) МГОБ №62 в период с 2016 по 2017гг. ИГХ выполнено на срезах опухолевой ткани, приготовленных по стандартной методике. Срезы толщиной 4 мкм монтировали на позитивно заряженные стёкла, в течение 30 мин выдерживали при комнатной температуре в вертикальном положении, а затем досушивали при +56С в термостате в течение 60 мин. Иммунное окрашивание произведено в полностью автоматическом иммуностейнере Leica BOND III с использованием предустановленных настроек иммуностейнера и стандартных реагентов производства Leica Biosystems. Демаскировка антигенов проведена в иммуностейнере с использованием EDTA-содержащего буфера (Epitope Retrieval Solution 2 BOND, pH=9.0) в течение 20 мин. Первичные антитела к PD-L1 (клон SP142, 1:100, Spring Bioscience, USA) и FOXP3 (клон EP340, 1:100, Cell Marque, USA) инкубировались в течение 20 минут. Использованная система детекции -Bond Polymer Refine Detection. Для усиления сигнала использован DAB Enhancer BOND. После окрашивания срезы проводились через батарею спиртов и ксилол и заключались под покровное стекло.
Оценка иммунного окрашивания. PD-L1: оценивалась экспрессия в лимфоцитах, инфильтрирующих строму опухоли. Оценивался процент площади, занимаемой окрашенными лимфоцитами, от всей площади инвазивной опухоли. FOXP3: оценивалась экспрессия в лимфоцитах, инфильтрирующих строму опухоли. Оценка производилась в зонах наибольшего скопления лимфоцитов в пяти полях зрения (х40). Оценивалось среднее количество БОХРЗ-позитивных лимфоцитов в 5 полях зрения.
В лаборатории радиоизотопной диагностики (РИД) (зав. лаб. - проф. СВ. Ширяев) ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России разработана и более 15 лет применяется в детской и взрослой клинике системная экспертиза нефроурологического состояния на базе комплексной реносцинтиграфии (СЭНС-КР) (С. Г. Аверинова, к.б.н. А.В. Кашкадаева) [1918, 11, 19]. СЭНС-КР - это высокая технология, реализованная в разработке автоматизированного рабочего места (АРМ) врача-радионефроуролога (руководитель проекта - А.П. Алехин).
Комплексную реносцинтиграфию (КР) проводят на 2-детекторной гамма-камере с одновременной записью в 2 проекциях, что дает возможность изучить всю систему почечного очищения, начиная с сердечного кровотока и заканчивая мочевым пузырем. Диагностическая имитация почечного очищения от нефротропного вещества начинается с внутривенного введения 99тТс-технефора. 99тТс-технефор, российский препарат из группы дифосфонатов, проявляет себя по гемодинамике как гломерулотропный препарат, концентрируясь в нефронах в основном посредством фильтрации, с частичным подключением секреции. По качеству визуализации (даже при слабой функции почек) 99тТс-технефор значительно превосходит традиционный гломерулотропный 99mTc-DTPA и стоит ближе к тубулотропному 99mTc-MAG3 (в России выпускают его аналог - 99тТс технемаг). 99тТс-технефор менее подвержен накоплению в селезенке и печени, по сравнению с вышеуказанными традиционными радиофармпрепаратами (РФП), обеспечивая меньшие ошибки при количественных оценках [19,166,167].
Обработку данных, записанных в 2 проекциях, проводят по результатам 2-фазной регистрации: этап первый - 21-минутный (1 мин - ангиофаза) базовый тест с введением меченого вещества; этап второй - отсроченный (после 25 мин перерыва) 21-минутный досмотр (иногда 7-минутный тест) без введения РФП, но на фоне щадящей водной нагрузки (200-300 мл) и/или спазмолитического (реже диуретического) препарата. Опорожнение мочевого пузыря пациентом перед базовым исследованием и досмотром является обязательной функциональной пробой.
При комплексной реносцинтиграфии удалось добиться самых низких лучевых нагрузок на пациентов и персонал. Взрослым вводят внутривенно 74 МБк 99тТс-технефора (эффективная лучевая нагрузка 0,6 мЗв) или реже 99тТс-технемага, с учетом возраста и веса. При исследовании в один день почек и костной системы по схеме «почки-кости» взрослым вводим 370-555 МБк 99тТс-технефора.
В интерпретации данных исходят из концентрационно-скоростной модели мочевыделения. Доказано, что уровень концентрирования и гломеруло-, и тубулотропного радиофармпрепарата в паренхиме является хорошо воспроизводимым показателем концентрационной функции почки. В лаборатории РИД ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России разработан способ получения уродинамических кривых, показывающих процесс концентрирования меченой мочи в отделах системы. Алгоритм основан на формуле «функциональной лупы» (ФЛ). При преобразовании ФЛ составляющая ренального кровотока (вместе с тканевым фоном) моделируется кривой кровотока в зоне правого сердца (с проецирующейся на нее нисходящей ветвью грудной части аорты).
Анализ начинается с ренограмм почек. Ренограмма – это единственная кривая, по которой можно последовательно во времени проследить процессы массового «окрашивания» специализированных ренальных структур, включающихся в радионуклидное мочевыделение после внутривенного введения РФП. На этой временнй очередности основано вычисление важных показателей функции почки. На ренограмме условно выделяют 3 раздела: «сосудистую» ангиофазу; «паренхимную» фазу и наиболее длительную «уродинамическую» фазу, которая является сложной суммой гидродинамики в чашечках, лоханке, а также рефлюксов из отделов мочеточника (рис. 1). С помощью разработанного инструментария «виртуальной биопсии» по изображениям базового исследования и досмотра достоверно идентифицируются любые отделы системы почечного очищения. После преобразования ФЛ для измерений активности РФП в отделах МВС получают спектр уродинамических кривых и диагностических показателей функциональных задержек для ренальной коры, чашечек, лоханки, а также мочеточников и мочевого пузыря. Такие функциональные кривые визуализируют «полезный сигнал» - динамику изменения концентрации РФП в моче каждого отдела МВС.
Прогностическое значение лабораторно-диагностических и биохимических показателей
Более 20 лет назад иммунотерапия с включением IL-2 и ИНФ была единственной возможной лечебной опцией у больных с метастатическим ПКР, позволяющей в определенных случаях добиться полных ремиссий и длительных стабилизаций. Высокая токсичность HD (high-dose) IL-2 ограничивает использование данного вида терапии среди пациентов с хорошей функцией органов и в специализированных учереждениях, где есть опыт использования данного препарата. Во многих исследованиях изучались предикторные и прогностические маркеры эффективности иммунотерапии IL-2 и ИНФ-, но на данный момент ни один из них не был валидизирован. Известно, что пациенты со светлоклеточным гистологическим типом и благоприятным статусом имеют лучший прогноз в отношении иммунотерапии.
С 2005г. при мПКР зарегистрировано 9 новых таргетных препаратов: а) ингибиторы тирозинкиназных рецепторов – сунитиниб, сорафениб, пазопаниб, акситиниб, кабозантиниб, ленватиниб (в комбинации с эверолимусом); b) анти VEGF моноклональные антитела – бевацизумаб в комбинации с ИНФ-; с) ингибиторы mTOR – эверолимус и темсиролимус. Но учитывая отсутствие новых препаратов, цитокинотерапия рассматривается в качестве возможной опции у определенной когорты больных. Более того, появился новый класс иммунотерапевтических препаратов, ингибиторы контрольных точек, демонстрирующие значительную роль при лечении пациентов мПКР. Таким образом, оптимальная последовательность назначения данных препаратов позволила бы повысить эффективность и улучшить отдаленные результаты у пациентов мПКР. Для решения данной задачи необходим поиск предикторных и прогностических маркеров, позволяющих проводить селекцию среди больных, наиболее чувствительных к тому или иному виду терапии.
В рамках проведенного клинического исследования продемонстрировано, что иммунотерапия с включением ИНФ- способна индуцировать противоопухолевый клеточный иммунитет у больных мПКР, о чем свидетельствует увеличение содержания CD3+CD8+ Т лимфоцитов в периферической крови больных через 2 мес. от начала лечения.
В ходе нашего исследования также было выявлено несоответствие фенотипа CD4+CD25+Foxp3+CD127low- клеток (Treg) с их функциональными свойствами, что не позволяет использовать Treg в качестве отрицательного предикторного фактора, как утверждалось ранее.
Для исследования механизмов, лежащих в основе приобретения Treg иных поверхностных фенотипов и функциональных характеристик, мы проанализировали концентрации сывороточных факторов TGF- и IL-17A до и через 2 мес. от начала иммунотерапии ИНФ- у больных мПКР. Полученные результаты позволили предположить наличие конверсии Treg в Th17, ассоциированное с частичным эффектом, что может иметь важное значение для разработки новых иммунотерапевтических подходов в онкологии.
Впервые определен благоприятный прогностический фактор при иммунотерапии ИНФ-, - среднее содержание гемоглобина (MCH), позволяющий отбирать пациентов, наиболее чувствительных к ИНФ-. Повышенное содержание эндогенного эритропоэтина также следует принимать во внимание при определении тактики лечения, учитывая описанные случаи объективного эффекта в случае его повышения.
Использование ниволумаба в рамках программы расширенного доступа позволило добиться объективных эффектов в 21,7%. Наличие клинического эффекта, благоприятный прогноз согласно модели MSKCC, развитие гипотиреоза, повышенная концентрация IL-17A и сниженная концентрация TGF- в сыворотке больных определяли наиболее благоприятный прогноз при иммунотерапии ниволумабом. В то время как количество предшествующих ранее линий не показало достоверного влияния на выживаемость без прогрессирования. Применение ниволумаба у больных мПКР ассоциировалось с низкой токсичностью и хорошей переносимостью. Аутоиммунные осложнения 3-4 ст. отмечены лишь в 13% случаев, хорошо контролируемые глюкокортикоидными препаратами. Невысокая частота побочных эффектов позволяет изучать данный препарат в комбинированных или последовательных/альтернирующих режимах с другими ингибиторами контрольных точек, а также таргетными препаратами. На основании полученных данных в настоящее время данный препарат зарегистрирован на территории РФ. У 41 пациента мПКР, подвергшегося нефрэктомии, (18 - на фоне иммунотерапии ИНФ-, 23- на фоне иммунотерапии ниволумабом) проводился комплексный мониторинг функции почки на базе биохимических (биохимический анализ крови, общий анализ мочи, проба Реберга) и радионуклидных показателей (комплексная реносцинтиграфия).
В плане поиска диагностики маркеров ранних стадий нарушения почечной функции нами были проанализированы в сыворотке крови у 40 пациентов мПКР до начала иммунотерапии (ИНФ и ниволумаб) и через 2 мес. после TGF- как фактор склероза почечной паренхимы и IL-17A, обладающий сильными провоспалительными свойствами и индуцирующий тяжелую аутоиммунную патологию, включая нефриты. На фоне иммунотерапии с включением ИНФ- и ниволумаба была отмечена тенденция к росту TGF- (p=0,1) и достоверный прирост IL-17A (p 0,0005). Выявлены статистически значимые корреляции между биохимическими показателями с включением IL-17A, TGF- и РН, - D, скорость выведения 99mTc-технефора из паренхимы, и Rnfsс, устойчивый признак нефросклероза (предположительно, склероза междолевых артерий почки), соответственно. Полученные данные биохимические и РН маркеры позволяют не только установить нарушения почечной функции на ранней стадии, но еще и дифференцировать причину развития данной патологии, - нефросклероз или аутоиммунное состояние, что имеет чрезвычайно важное значение в определении тактики лечения ХБП.