Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
Лейкоциты и развитие рака 15
Врожденный иммунитет и развитие рака молочной железы 17
Адаптивный иммунитет и развитие рака молочной железы: роль В-лимфоцитов
Адаптивный иммунитет и развитие рака молочной железы: роль Т-лимфоцитов 23
Регуляторные клетки 27
ГЛАВА 2. Материалы и методы 36
2.1 Общая характеристика клинического материала 36
2.2 Лабораторные (иммунологические) методы исследований
2.2.1 Исследование иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови 47
2.2.2 Исследование цитотоксического потенциала клеток-эффекторов 48
2.2.3 Исследование иммунофенотипа лимфоцитов инфильтрирующих опухоль 49
2.2.4 Цитоморфологический анализ
2.3 Проточно-цитометрический анализ 50
2.4 Статистическая обработка результатов 51
ГЛАВА 3. Клинический анализ больных первично операбельным раком молочной железы 52
ГЛАВА 4. Исследование иммунофенотипа лимфоцитов периферической крови больных первично-операбельным раком молочной железы 58
4.1 Исследование линейных популяций CD45+ лимфоцитов периферической крови больных РМЖ 58
4.2 Исследование структуры Т-клеток периферической крови больных РМЖ 60
4.3 Исследование функциональной активности клеток эффекторного звена иммунитета больных РМЖ 64
4.4 Исследование супрессорных/регуляторных минорных популяций лимфоцитов периферической крови больных РМЖ 68
ГЛАВА 5. Исследование иммунофенотипа лимфоцитов инфильтрирующих опухоль больных первично-операбельным раком молочной железы 76
5.1 Количественное исследование степени инфильтрации CD45+ лимфоцитами опухолевой ткани больных РМЖ 76
5.2 Исследование линейных популяций CD45+ лимфоцитов инфильтрирующих опухоль больных РМЖ 80
5.3. Исследование структуры Т-клеток и популяций активированных лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, больных первично-операбельным раком молочной железы 81
5.4 Исследование структуры и функциональной активности лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, эффекторного звена иммунитета больных РМЖ 83
5.5 Исследование супрессорных/регуляторных минорных популяций лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, больных РМЖ 84
5.6 Исследование иммунофенотипа CD45+ лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, больных РМЖ в зависимости от степени инфильтрации опухолевой ткани 86
ГЛАВА 6. Обсуждение полученных результатов 90
Выводы 110
Список сокращений 112
Список литературы
- Адаптивный иммунитет и развитие рака молочной железы: роль В-лимфоцитов
- Исследование цитотоксического потенциала клеток-эффекторов
- Исследование структуры Т-клеток периферической крови больных РМЖ
- Исследование структуры Т-клеток и популяций активированных лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, больных первично-операбельным раком молочной железы
Адаптивный иммунитет и развитие рака молочной железы: роль В-лимфоцитов
Эпидемиологические данные поддерживают утверждение о том, что цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) и NK-клетки, несомненно, играют жизненно важную функцию в сдерживании опухолевого развития [68], о чем свидетельствует увеличение заболеваемости вирусно-ассоциированными раковыми заболеваниями, включающие вирус папилломы человека, связанный с шейным и сквамозным раком, герпесвирусом-8-ассоциированной саркомой Капоши и вирусом Эпштейна-Барр, связанным с неходжкинской лимфомой у иммунодефицитных лиц [34, 127, 69, 31, 75]. По аналогии как с вирусно-ассоциированным раком, есть данные, раскрывающие рост заболеваемости канцерогенно-ассоциированных раковых образований у иммунодефицитного населения, в том числе меланомы и аденокарциномы легких [69, 129]
Там, где воздействие канцерогеном и патогенное воздействие не считаются этиологическими факторами, однако, иммунодефицитные женщины демонстрируют пониженный относительный риск для общего эпителиального рака, включая аденокарциномы молочной железы [69, 129,151,76,122].
Изучение функциональной цитотоксической активности NK-клеток опередило период количественного определения данной популяции с помощью моноклональных антител, которые были разработаны спустя 10 лет после идентификации этой клеточной популяции. Ранее полученные данные о функционировании NK-клеток свидетельствуют о том, что NK -клетки играют важную роль при раннем и метастатическом раке молочной железы [110]. У некоторых больных раком молочной железы показана недостаточная функциональная активность NK клеток против клеток-мишеней миелоидной линии К562. Уровни NK активности клеток ниже у женщин при наличии пораженных лимфатических узлов по сравнению с пациентками без пораженных л/узлов, 18% против 31% литической активности, соотв. Цитотоксическая активность NK клеток была значительно ниже (р 0.005) у лиц с высокой семейной заболеваемостью раком по сравнению с людьми с низким уровнем заболеваемости. Так же было замечено, что пациенты с раком головы и шеи с NK активностью клеток менее чем 60 литических единиц (LU) были более склонны к развитию отдаленного метастатического заболевания, чем аналогичные больные с LU 60(5) [110,51,97,152,139].
Уровни NK–клеточной активности являются более низкими у женщин с наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы (N+) по сравнению с больными без метастазов (N0). NK–клеточная цитотоксичность была значительно более низкой у больных с высокой частотой семейного рака в сравнении с пациентами, у которых рак в семье встречался редко. У женщин с поздними стадиями РМЖ отмечено подавление NK–клеточной цитотоксичности в сравнении со здоровыми женщинами. Подавление NK–клеточной активности может быть важным медиатором ускорения опухолевого роста при стрессе [27]. Существуют данные, что NK–клеточный дефицит усугубляется по мере опухолевой прогрессии и зависит от клинической стадии заболевания. Тем не менее, роль NК–клеточной активности в контроле РМЖ остается не до конца понятной. По данным 4 методов изучения NK–клеток, их активность у больных РМЖ и у женщин с доброкачественными процессами в молочной железе не различалась. По данным G. Sachs и соавт. (1995), активность LAK–клеток, а не NK–клеток взаимосвязана с количеством регионарных аксиллярных лимфатических узлов, пораженных метастазами у больных РМЖ. Активность NK–клеток (по лизису клеток–мишеней К–562 и MCF–7) не различалась у больных РМЖ и у пациенток с доброкачественными процессами. Однако большее отношение к прогнозу имела активность в отношении клеток MCF–7. В пуле туморинфильтрирующих лимфоцитов РМЖ NK–клетки составляют небольшую пропорцию. Их функциональная роль не совсем ясна. В целом следует отметить, что в настоящее время отношение к роли NК–клеток не столь однозначное. Помимо позитивной роли в противовирусной и противораковой защите эти клетки могут также угнетать CD8+ Т–цитотоксический иммунный ответ. Кроме того, установлена регуляторная роль NK–клеток в адаптивном иммунитете.
Например, после удаления NK–клеток усиливается антигенная презентация в ходе инфекции вирусом лимфоцитарного хориоменингита. Аналогичным образом удаление NK–клеток улучшает формирование Т–клеток памяти. Активация NK– клеток ведет к продукции ими интерлейкина–10, который способствует вирусиндуцированному подавлению CD8+–клеток. Последние данные свидетельствуют о том, что отсутствие ингибиторного рецептора 2B4 на NK– клетках ведет к редукции вирусспецифического CD8+ Т–клеточного ответа и более длительной персистенции вируса. Нарушения цитотоксической активности NK-клеток может играть определенную роль на начальных этапах канцерогенеза. Значительные различия наблюдались в нескольких параметрах иммунной системы между здоровыми и женщинами с распространенным раком молочной железы до начала курса химиотерапии на основе таксанов. Отмечались подавление NK и токсичности лимфокин-активированных клеток-киллеров, пониженные уровни интерлейкина IL-2, GM-CSF , интерферона , повышенный уровень фактора некроза опухолей и IL – 6 [163]. Активность NK-клеток была на 175 % ниже, а TNF активность была на 100% выше у больных раком молочной железы до начала лечения по сравнению со здоровой группой [27].
Несмотря на то, что активность NK клеток может быть связана с факторами инициации рака и выживанием, мало данных о том, является ли повышение активности NK-клеток клиническим преимуществом у больных раком, не говоря уже о том, является ли модуляция активности клеток NK-клеток у людей достижимой.
Исследование цитотоксического потенциала клеток-эффекторов
До хирургического лечения с первой стадией заболевания было 18 (25,7%) пациенток, со IIA стадией -18 (25,7%), со IIB стадией - 34 (48,5%). Диагноз был установлен на основании клинико-рентгенологических методов исследования.
Однако после хирургического лечения и рестадирования оказалось: с in situ 2 (2,8%), с I стадией – 29 (41,4%) пациенток, со IIА стадией- 24 (34,2%), со IIВ стадией- 12 (17,1%), с IIIA стадией- 3 (4,2%) пациенток. Диагноз был поставлен после планового гистологического исследования.
По данным гистологического исследования хирургически удаленных опухолей, наиболее часто встречался инфильтративный протоковый рак – в 54 (77,1%) наблюдениях, инфильтративно дольковый рак – в 9 (12,8%) случаях, редкие формы рака – в 7 (10%) случаев (рис.8).
У всех больных РМЖ определялся рецепторный статус опухоли, пролиферативный индекс (Ki67), экспрессия рецептора эпидермального фактора роста HER2neu.
Опухоль рассматривалась как рецептор положительная, если уровень рецепторов эстрогенов и/или прогестерона был 3 баллов. Распределение больных РМЖ по рецепторному статусу. У большинства больных опухоль содержала рецепторы эстрогенов и прогестеронов (РЭ+РП+) – в 42 (60%) случаях. У 18 (25,7%) пациенток не обнаружены оба вида рецепторов (РЭ-РП-). Опухоль положительная по рецепторам эстрогенов и отрицательная по рецепторам прогестерона (РЭ+РП-) была обнаружена у 8 (11,4%) больных, а отрицательная по рецепторам эстрогенов и положительная по рецепторам прогестерона (РЭ-РП+)- у 2 (2,8%) больных (рис.10).
Определение гиперэкспрессии / амплификации гена HER2neu определяли у 70 больных. Как видно из рисунка 11, в 9 (12,8%) случаях опухоль не содержала рецепторы к HER2neu (0), у 28 (40%) больных, уровень рецепторов к HER2neu оценивался как (1+), у 23 (32,8%) больных HER2neu экспрессия оценивалась как (2+), причем в 2-х из этих случаев FISH реакция оказалась положительной, у 10 (14,2%) больных HER2neu (3+). Из общего количества пациентов, у 3 (4,2%) выявлен тройной негативный рак молочной железы. Все пациенты с гиперэкспрессией HER2neu получали дополнительную таргетную терапию Трастузумабом. Рисунок 11 — Распределение больных РМЖ по гиперэкспрессии/ амплификации гена HER2neu.
Послеоперационное лечение назначалось в зависимости от гистологического заключения, распространенности процесса, возраста больной и результатов иммуногистохимического исследования уровня экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона, гиперэкспрессии/амплификации рецепторов HER2neu. Адъювантную терапию проводили всем 70 (100%) больных (рис.12). (21,4%) больным была назначена эндокринотерапия, 10 (14,2%) больным была назначена только химиотерапия, комбинированную химиолучевую терапию проводили в 6 (8,5%) случаях, сочетанную химиотерапию и эндокринотерапию проводили в 19 (27,1%) случаях, у 6 (8,5%) пациенток использовали сочетание гормональной и лучевой терапии. Комплексная терапия, включавшая лучевую терапию, гормональную терапию и химиотерапию использовалась в 14 (20%) случаях. В 12 (17,1%) случаях совместно с химиотерапией проводилась таргетная терапия Трастузумабом. Рисунок 12 — Распределение больных первично-операбельным РМЖ по типу адъювантной терапии.
В настоящее время, все пациентки – живы, что составляет 100%. Как представлено на рисунке 13, у 45 (64,2%) пациенток не обнаружено метастазов в лимфатических узлах (критерий N0), у 24 (34,2%) имелись метастазы в 1-4 лимфатических узлах (критерий N1), в 1 (1,4%) случае определялись конгломераты из 5-9 увеличенных лимфатических узлов. (критерий N2).
Рисунок 13 — Распределение больных РМЖ по количеству пораженных лимфатических узлов. Иммунологические исследования структуры лимфоцитов периферической крови и лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, больных первично-операбельным РМЖ проводилось в лаборатории клинической иммунологии опухолей централизованного клинико-лабораторного отдела НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России (зав. лабораторией, профессор З.Г.Кадагидзе).
Морфологическая часть исследования проводилась в отделе патологической анатомии опухолей человека ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» Минздрава России (зав отделом, профессор А.И.Карселадзе).
Иммунологические исследования структуры иммунокомпетентных клеток, а также анализ минорных субпопуляций, включая регуляторные и эффекторные лимфоциты, проводили путем многопараметрового иммунофенотипирования лимфоидных клеток периферической крови (n=70) и лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль (n=62). По техническим причинам исследование образцов опухолевой ткани у 8 из 70 (11,4%) пациенток провести не удалось. В контрольную группу доноров вошли практически здоровые женщины (n=39).
Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови больных первично-операбельным РМЖ и здоровых доноров проводили методом многопараметрового цитометрического анализа с использованием коммерческих наборов моноклональных антител к поверхностным дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека, конъюгированных FITC, PE, PE-Cy5, PC5 (BD Biosciences, Bekman Coulter). Использовали двух, трех- и четырех-цветное окрашивание клеток с подбором различных комбинаций следующих реагентов, представленных в таблице 2.
Исследование структуры Т-клеток периферической крови больных РМЖ
Важнейшим показателем состояния клеточного звена иммунной системы является анализ соотношения субпопуляций CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов в структуре Т-клеток. Ранее данный показатель обозначался как иммунорегуляторный индекс (ИРИ), в данный момент, как соотношение CD4/CD8 и в норме оно составляет 1,2-2,4 [19].
В исследуемой группе больных первично-операбельным раком молочной железы медиана данного показателя оказалась равна 1,0 (0,73-1,59) (данные статистически значимо не отличались от контрольной группы 1,19 (0,9-1,48)), что свидетельствует либо о низких показателях уровня CD4+, либо, напротив, о повышенных значениях CD8+ лимфоцитов. Анализ частоты встречаемости нарушений соотношения CD4/CD8 выявил, что 43 пациентки (61,3%) из 70 имеют показатели, отличные от нормы. Так 37 (52,8%) больных первично-операбельным раком молочной железы имеют показатели ниже среднего значения по группе (ниже 1,0) и соотношение CD4/CD8 составило в среднем 0,69, у 6-ти (8,5%) больных РМЖ данный показатель оказался выше значений по группе – 3,3 и лишь, 27 (38,5%) первичных больных РМЖ имели показатели соотношения CD4/CD8 соответствующие нормальным значениям. Нами были определены 4 различных варианта нарушений соотношения CD4/CD8 среди больных с низким показателем (менее 1,0): 1 вариант – норма CD4 vs CD8 – 7 (18,9%) больных; 2 вариант – CD4 vs норма CD8 – 13 (35,1%) больных; 3 вариант – CD4 vs CD8 – 15 (40,6%) больных; 4 вариант – CD4 vs CD8 – 2 (5,4%) больных. Следует заметить, что среди различных вариантов нарушений соотношения CD4/ CD8 ни в одном случае не были зафиксированы высокие показатели уровня CD4 лимфоцитов, только норма или низкие значения. Однако популяция CD8 клеток у 37 больных (59 %) превышала нормальные значения, у 13 больных (35,1%) соответствовала норме, и лишь у 2 больных (5,4%) были выявлены низкие параметры.
Среди всех Т-клеток на долю CD4+ лимфоцитов приходится 2/3, причем, как правило, все CD4+лимфоциты являются CD3+Т-клетками. Оказалось, что еще до начала лечения у больных первично-операбельным раком молочной железы в целом по группе в структуре Т-клеток статистически достоверно снижено число СD45+CD3+CD4+ Т-лимфоцитов по сравнению с группой доноров и составило 34,4(27,4-44,7) против 41,1 (36,4-51,2) (р 0,003). (Рисунок 14). Рисунок 14 — Dotplot анализ фенотипа CD4+ Т-лимфоцитов больной РМЖ (А) и донора (Б): А — коэкспрессия антигенов CD3 и CD4 на СD45+лимфоцитах периферической крови больной РМЖ; Б — коэкспрессия антигенов CD3 и CD4 на СD45+лимфоцитах периферической крови здорового донора. Ключевыми клетками эффекторного звена иммунитета является популяция CD8 лимфоцитов. Данная субпопуляция гетерогенна по своему фенотипу и представлена как специфическими, так и неспецифическими CD8 клетками. Несмотря на то, что в целом по группе общий уровень СD45+CD8+ лимфоцитов больных первично-операбельным раком молочной железы сопоставим с показателями контрольной группы 33,5 (10,1) и 36,3 (7,6) соотв., в структуре CD8 у больных РМЖ с высоким уровнем достоверности снижено число специфических цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) с фенотипом CD45+CD3+CD8+ по сравнению с донорами и составило 22,1 (13,1-28,37) против 28,7 (24,6-31,9) (р 0,001). Также было обнаружено, что неспецифические эффекторные NK-клетки с фенотипом CD45+CD3-CD8+ достоверно выше в группе больных РМЖ против показателей здоровых лиц 10,3 (6,57-15,8) и 8,0 (5,6-11,2) (р 0,016) соответственно. (Рисунок 15)
Таким образом, для больных первично-операбельным раком молочной железы в структуре Т-клеток характерно статистически достоверно сниженное количество как CD45+CD3+CD4+, так и CD45+CD3+CD8+ по сравнению с показателями донорской группы. Рисунок 15 — Dotplot анализ фенотипа CD8+ Т-лимфоцитов больной РМЖ (А) и донора (Б): А — коэкспрессия антигенов CD3 и CD8 на СD45+лимфоцитах периферической крови больной РМЖ; Б — коэкспрессия антигенов CD3 и CD8 на СD45+лимфоцитах периферической крови здорового донора. Суммарные данные по анализу линейных (Т, В, NK) популяций и структуры субпопуляций CD4 и CD8 Т-клеток больных первично-операбельным раком молочной железы по сравнению с донорами представлены в таблице 4. Таблица 4 — Содержание линейных популяций и структуры Т-клеток лимфоцитов периферической крови больных РМЖ по сравнению с донорами Фенотип клеточной субпопуляции Больные РМЖ(n=70) Медиана иквартилиМ(25%-75%)или x(s) Доноры(женщины) (n=39)Медиана иквартилиМ(25%-75%)или x(s) Р CD45+CD3+ 72,3 (59,17-76,7) 75,0 (70,9-80,0) CD45+CD3+CD4+ 34,4(27,4-44,7) 41,1 (36,4-51,2) Р=0,003 CD45+CD3+CD8+ 22,1 (13,1-28,37) 28,7 (24,6-31,9) Р= 0,001 CD45+CD3-CD8+ 10,3 (6,57-15,8) 8,0 (5,6-11,2) Р=0,016 CD45+CD8+ 33,5 (10,1) 36,3 (7,6) CD4/CD8 1,0 (0,73-1,59) 1,19 (0,9-1,48) CD45+CD3-CD16+CD56+ 16,8 (10,9-24,8) 16,0 (11,5-21,3) CD45+CD3+CD16+CD56+ 11,6 (7,1-16,3) 8,7 (4,7-13,5) Р=0,022 CD45+CD3-CD19+ 5,7 (3,5-8,2) 5,1 (3,5-6,9) 4.3 Исследование функциональной активности клеток эффекторного звена иммунитета больных РМЖ
В данном исследовании помимо количественного фенотипического определения содержания популяций клеток, осуществляющих эффекторные функции в организме, была проведена оценка функциональной состоятельности клеток эффекторного звена иммунитета. Известно, что основными клетками-эффекторами у человека, осуществляющими клеточный цитолиз, являются цитотоксические CD8 Т-лимфоциты (ЦТЛ) с фенотипом CD45+CD3+CD8+ и NK-клетки с фенотипом CD45+/CD3–/CD16+56+. Причем ЦТЛ входят в структуру Т-клеток, а NK-клетки являются одной из трех основных линейных популяций лимфоцитов. Следует заметить, Т-клетки – это центральное звено клеточного адаптивного иммунитета, в то время как NK-клетки являются ключевым фактором врожденного иммунитета. Соединение механизмов клеточно опосредованного цитолиза со специфичностью распознавания клеток-мишеней служит основой иммунного цитолиза, опосредованного CD8+-Т-киллерами. Эта форма цитолиза отличается от цитотоксичности, вызванной NK-клетками, своим начальным этапом. ЦТЛ требуется распознавание молекул МНС I класса на клетке-мишени, что и обуславливает специфичность иммунологической цитотоксической реакции. Основное свойство NK-клеток состоит в том, что они способны лизировать клетки-мишени без предварительного контакта и развития реакции типа иммунного ответа. Однако центральной эффекторной функцией и ЦТЛ, и NK-клеток является повреждение клеток-мишеней, в частности опухолевых, и рассматривается как один из основных механизмов противоопухолевой защиты организма.
В связи с этим, нами были изучены основные субпопуляции эффекторных лимфоцитов, содержащих перфорин — CD45+CD8+Perforin+ Т-лимфоциты и CD45+CD16+Perforin+ NK клетки. Ранее было показано, что уровень экспрессии перфорина в эффекторных лимфоцитах можно рассматривать как маркер их цитотоксической состоятельности [2].
Прежде всего, нами проведена оценка количества перфорин-содержащих эффекторных клеток всей группы больных РМЖ относительно показателей группы доноров. Оказалось, что количество CD45+CD16+ NK-клеток-эффекторов с экспрессией внутриклеточного перфорина у больных РМЖ не отличается от показателей донорской группы, однако число CD45+CD8+ клеток с экспрессией внутриклеточного перфорина у больных РМЖ доствоерно выше, чем у здоровых лиц. В тоже время оказалось, что функциональная активность и CD16 лимфоцитов, и CD8 лимфоцитов больных первично-операбельным раком молочной железы статистически значимо превышала показатели доноров (Таблица 5)
Исследование структуры Т-клеток и популяций активированных лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, больных первично-операбельным раком молочной железы
Многочисленные исследования роли инфильтрации лимфоцитами опухолевой ткани, проводимые во всем мире, свидетельствуют о позитивном прогностическом значении высокой степени инфильтрации лимфоцитами опухоли, причем независимо от нозологической формы злокачественного новообразования [74,16,125,158]. В работе были изучены образцы опухолевой ткани 62 первично-операбельных больных РМЖ. Дизайн исследования был аналогичен анализу периферической крови пациенток РМЖ. У 8 больных по техническим причинам анализ опухолевой ткани провести не удалось.
На первом этапе работы было проведено исследование количества лимфоидных клеток в полученных суспензиях, отражающих степень инфильтрации лимфоцитами опухолевой ткани больных РМЖ. В каждом образце клеточной суспензии лимфоидные клетки были идентифицированы с помощью метода проточной цитометрии с учетом малоуглового светорассеяния SSC в сочетании с окрашиванием МКА анти-CD45, а также с помощью цитоморфологического метода жидкостной цитологии.
Иммунологический проточно-цитометрический анализ цитограмм SSC vs CD45 образцов опухолевых клеток показал, что лимфоидные клетки c фенотипом CD45+ выявлялись в 100% случаев. При этом относительное содержание TIL c фенотипом CD45+ в полученных суспензиях значительно варьировало от 0,04% до 27,9%, медиана в исследуемой группе 62 больных составила 1,7 (0,4-4,2)%, медиана абсолютного числа CD45+ лимфоцитов в исследуемых образцах составила 500 (83,0-1026,0) клеток.
В тоже время цитоморфологический анализ с помощью метода жидкостной цитологии в некоторых случаях не позволил выявить лимфоидные клетки в исследуемых образцах. Так, у 22,7% пациенток РМЖ, образцы опухолевой ткани оказались негативными по содержанию CD45+ лимфоцитов.
В качестве примера приводим используемый прием гейтирования CD45+ лимфоцитов в суспензии клеток опухолевой ткани методом проточной цитометрии и цитоморфологический анализ с помощью метода жидкостной цитологии, окрашиванием по Лейшману. Рисунки 22,23
А – Образец опухоли больной РМЖ с низким содержанием CD45+ TIL Б – Образец опухоли больной РМЖ с высоким содержанием CD45+ TIL В – Образец опухоли больной РМЖ со средним содержанием CD45+ TIL жидкостной цитологии. Цитопрепарат Cytospin, окраска по Лейшману, Х400. По результатам проточно-цитометрического иммунологического анализа в зависимости от содержания числа CD45+ TIL, были сформированы 3 подгруппы пациенток первично-операбельным раком молочной железы. В первую группу вошли больные с уровнем CD45+ не превышающим 1,0%, во вторую группу вошли пациентки с уровнем CD45+ от 1,1% до 10%, третью группу составили больные с уровнем TIL свыше 10,1%. Оказалось, что наиболее часто (48,3%) встречаются больные второй подгруппы с диапазоном CD45+ TIL от 1,1% до 10%, 38,4% больных РМЖ имеют уровень CD45+ клеток не превышающим 1,0%, с меньшей частотой 13,3% больных в исследуемой когорте оказались пациентки с уровнем CD45+ TIL свыше 10% ( Рисунок 24).
Распределение больных РМЖ в зависимости от содержания CD45+ лимфоцитов, инфильтрирующих опухолевую ткань 38,4% менее 1 % 1-10% свыше 10% Распределение больных первично-операбельным раком молочной железы в зависимости от содержания CD45+ лимфоцитов, инфильтрирующих опухолевую ткань.
Цитоморфологический анализ наличия лимфоидных клеток в данных подгруппах больных показал, что среди больных первой подгруппы в 45% случаев образцы опухолевой ткани оказались отрицательными, во второй подгруппе лишь 14,2% больных, в третьей подгруппе образцы клеточных суспензий всех пациенток имели положительный результат анализа содержания лимфоцитов.
Таким образом, анализ содержания общего пула CD45+ лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, больных первично-операбельным раком молочной железы с помощью проточно-цитометрического и цитоморфологического методов показал, что при иммунологическом исследовании лимфоциты выявлялись в 100% случаев, в то время как при использовании метода жидкостной цитологии у 22,7% больных РМЖ в образцах опухолевой ткани лимфоциты не были обнаружены. Значительная часть (38,4%) больных РМЖ имели уровень экспрессии CD45+ TIL до 1%, у 48,3% пациенток РМЖ число CD45+ TIL составило 1,1-10% и у 13,3% больных РМЖ определялось свыше 10% лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль.
Аналогично исследованиям циркулирующих лимфоцитов периферической крови, исследование линейной структуры CD45+ лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, проводили с помощью метода многопараметровой проточной цитометрии. Независимо от относительного содержания CD45+ TIL в исследуемых образцах, иммунофенотип лимфоцитов, инфильтрирующих опухолевую ткань, был изучен у всех 62 пациенток первично-операбельным раком молочной железы.
Прежде всего оценивали количество линейных (Т-В-NK) популяций лимфоцитов опухолевой ткани больных РМЖ. Было обнаружено, что у больных первично-операбельным раком молочной железы в структуре TIL значительно преобладают CD45+CD3+CD19- Т-клетки, их уровень составил 89,4 (83,4-95,1)%, количество NK-клеток с фенотипом CD45+CD3-CD16+CD56+ среди лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль, составило 0,9 (0,1-2,2)%, а CD45+CD3-CD19+ В-лимфоцитов – 1,1 (0,05-4,9)%. В качестве примера приводим цитограммы исследования линейных популяций CD45+ TIL методом проточной цитометрии (Рисунок 25). CD45+CD3-CD16+CD56+ NK клетки А »-:у-.-: 10 10 CD3 FITC CD45+CD3-CD19+ B лимфоциты CD45+CD3+ T лимфоциты Рисунок 25 — Dotplot анализ линейных популяций лимфоцитов CD45+ TIL больных РМЖ: А - Dotplot коэкспрессии CD3 и CD 16+56 антигенов на поверхности CD45+TIL Б - Dotplot коэкспрессии CD3 и CD 19 антигенов на поверхности CD45+TIL
Соотношение CD4/CD8 клеток, характеризующее субпопуляционную структуру CD3 лимфоцитов, в целом по группе оказалось равным 1,1 (0,8-1,6). На долю CD4 пришлось 49,9 (40,6-55,9)% антиген-положительных клеток, на долю CD8 – 43,1 (34,1-50,2)%, при этом в опухолевой ткани популяция CD8 клеток на 93,2% представлена CD45+CD3+CD8+ специфическими цитотоксическими Т лимфоцитами (ЦТЛ), а уровень неспецифических CD8 эффекторных клеток с фенотипом CD45+CD3-CD8+ составил лишь 1,0 (0,1-2,1)%. Количество клеток с экспрессией антигенов ранней CD25+ и поздней HLA-Dr+ активации и составило 16,0 (9,4-21,3)% и 1,0 (0-2,8)% соответственно. Не было выявлено активированных CD45+CD3+HLA-Dr+ Т клеток 0,7 (0,0-2,0)%, однако обнаружены активированные CD4 лимфоциты с коэкспрессией CD25+ 12,4 (6,2-14,7). В качестве примера приводим цитограммы лимфоцитов, экспрессирующих дифференцировочные антигены Т клеток и активационные молекулы (Рисунки 26,27).