Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Роль иммунной системы в патогенезе и клиническом течении рака яичников (обзор литературы)
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 25
2.1 Общая характеристика больных и методов исследования 25
2.2 Клиническая характеристика обследованных больных 26
2.3 Методы лечения 28
2.4 Методы исследования 31
2.4.1 Общеклинические и специальные онкологические методы исследования
2.4.2 Иммунологические методы 32
2.4.3 Статистические методы 36
ГЛАВА 3. Состояние клеточного иммунитета и цитокиновой регуляции у больных раком яичников и их динамика в ходе лечения
3.1 Исходные показатели системы иммунитета у больных раком яичников
3.2 Динамика показателей клеточного иммунитета и содержания цитокинов в ходе комбинированного лечения рака яичников
ГЛАВА 4. Результаты специфической иммунотерапии в отношении показателей противоопухолевого иммунитета 59
4.1 Клинические результаты лечения в сравниваемых группах 72
Заключение 80
Выводы 84
Практические рекомендации 85
Список использованных источников 86
- Методы лечения
- Иммунологические методы
- Динамика показателей клеточного иммунитета и содержания цитокинов в ходе комбинированного лечения рака яичников
- Клинические результаты лечения в сравниваемых группах
Методы лечения
Одним из ключевых направлений в лечении злокачественных новообразований в конце ХХ века стала иммунотерапия [1, 114,146]. Применение специфических и неспецифических методов воздействия на иммунную систему позволило значительно улучшить результаты у пациентов с рядом опухолей наиболее частых локализаций: рака легких, почек, предстательной железы и др. [5, 130].
В то же время, при многих новообразованиях попытки осуществления иммунотерапии по схемам, принятым в международной онкологической практике, оказались недоказательными в плане клинической эффективности или вовсе безрезультатными [34, 51, 119, 133]. Это связывают с минимальной иммуногенностью некоторых новообразований, отсутствием эффективных подходов к ее повышению, а также со снижением функциональных показателей иммунной системы, вызванных как наличием опухоли, так и проводимым лечением [3, 78]. Последнее, особенно лучевая и химиотерапия, как известно, вызывают развитие системных нарушений, в том числе и состояния иммунитета [84].
Системные изменения, связанные с воздействием внешних факторов, имеют наиболее существенный отклик в компонентах, наиболее ранних в филогенетическом плане [2, 87]. Для иммунной системы таковой является клеточное звено, обеспечивающее ключевые механизмы противоопухолевой защиты [4, 124]. Среди различных типов взаимодействия организма и опухоли одним из основных является взаимодействие между различными иммунными механизмами. Главная задача иммунной системы – контроль за генетическим постоянством внутренней среды организма. Любые генетически, а следовательно антигенно чужеродные клетки, попадающие в организм или возникающие в нем вследствие мутаций или других процессов, изменяющих геном, стимулируют иммунный ответ, направленный на элиминацию этих клеток [6, 8]. Иммунный ответ на опухолевые клетки возможен в том случае, если они содержат антигены, отсутствующие в нормальных клетках данного индивидуума [10]. Доказано, что независимость опухолевых клеток относительна. Между ними и организмом хозяина складываются сложные взаимоотношения [70]. Они начинаются с момента трансформации нормальных клеток в опухолевые и продолжаются в течение всего развития основного заболевания, от характера этого взаимодействия зависит, каким будет прогноз злокачественного процесса [23, 28].
В большинстве случаев для эффективного лечения онкологических заболеваний необходим комплексный подход, подразумевающий оперативное вмешательство, различные варианты лучевой терапии, химиотерапию и биотерапию [11, 17-19, 49, 92]. Для лечения больных с гормонозависимыми опухолями используют блокаторы рецепторов андрогенов, эстрогенов, а также глюкокортикоиды [20, 79, 123, 149].
Все составляющие современного комплексного лечения онкологических заболеваний оказываются факторами, индуцирующими иммуносупрессию по клеточному типу, что крайне опасно, так как опухоль, в свою очередь, также использует механизмы супрессии для уменьшения отвечаемости организма на ее наличие. В этих условиях резко возрастает риск развития вторичных инфекций, реактивации существующих очагов воспаления. Для вторичного иммунодефицита, возникающего при злокачественных опухолях, характерно, главным образом, снижение количественных и функциональных показателей клеточного иммунитета, затрагивающих Т-лимфоциты, NK клетки, моноциты/макрофаги, а также другие клетки, значимые для обеспечения эффективной противоопухолевой защиты [22]. Выделяется три степени иммуносупрессии, ассоциированной с опухолевым ростом [26].
К этому можно добавить, как уже сказано выше, системное иммуносупрессивное действие противоопухолевого лечения.
Вторичный иммунодефицит при злокачественных опухолях выражается в снижении количественных и функциональных показателей клеточного иммунитета, в то время как показатели гуморального иммунитета практически соответствуют норме даже на поздних стадиях развития опухоли. Давно известно о наличии в сыворотке опухоленосителей блокирующих факторов, затрудняющих реализацию цитотоксического потенциала эффекторными клетками разного типа [25].
Считают, что этими факторами могут быть антитела к опухолевым клеткам. Экранирование опухолевых клеток такими антителами от повреждения цитотоксическими лимфоцитами названо феноменом усиления опухолевого роста. При этом сами антитела также неспособны индуцировать комплемент-зависимый цитолиз, так как на опухолевых клетках кроме того экспрессируются факторы контроля комплемента, препятствующие реализации цитолиза. Связывание антител с мембранными опухолевыми антигенами приводит к экранированию последних от цитотоксических лимфоцитов. Кроме того, в крови опухоленосителей присутствуют растворимые опухолевые антигены, которые активно секретируются опухолевой клеткой или «слущиваются» (shedding) с поверхности мембраны и связываются с рецепторами соответствующих цитотоксических лимфоцитов, препятствуя реализации их функций [27, 51, 80, 101, 151].
Иммунологические методы
Все больные распространенным РЯ лечатся комбинацией циторедуктивной хирургии и химиотерапии.
Пациенты, у которых выполнение циторедуктивной операции на первом этапе проблематично в связи с большим количеством метастазов в брюшной полости, либо общее состояние не позволяет провести агрессивное хирургическое вмешательство (выраженный плеврит и пр.) являются идеальными кандидатами для неоадъювантной химиотерапии.
Первичная циторедуктивная операция: При правильном отборе, в целом первичная циторедуктивная операция хорошо переносится больными и теоретически преследует три основные задачи: 1. Улучшение общего состояния за счет устранения постоянной тошноты и рвоты, связанной с метастатическим поражением большого сальника и уменьшением объема асцита 2. Удалением гипоксических участков опухоли, и увеличением количества митозов в опухоли в ответ на их хирургическое удаление и тем самым создание условий для химиотерапии Цель циторедуктивной операции - полное удаление опухоли или максимальное удаление всех видимых глазу очагов опухоли (Bristow et al, 2002). «Оптимальной» циторедуктивная операция считается при остаточной опухоли менее 2 см. Адъювантная химиотерапия
В идеале химиотерапия 1 линии при эпителиальном раке яичников должна включать препараты платины. Несмотря на то, что нет достоверной разницы в показателях выживаемости после химиотерапии карбоплатином и цисплатином, все же принимая во внимание удобство использования и достоверно меньшую токсичность карбоплатин остается препаратом выбора номер один (DuBois, Neijt & Thigpen, 1999; Ozols, 1999; Neijt et al, 2000).
Применение препаратов платины вместе либо последовательно с паклитакселом поддерживается результатами трех рандомизированных исследований 3 фазы (McGuire et al, 1996; Piccart et al, 2000; Muggia et al, 2000). Рекомендованная схема химиотерапии первой линии представлена в следующей таблице №2:
Схема химиотерапии и режим дозирования для распространенного РЯ День цикла Препараты Доза и путь введения Кол-во циклов Частота повторения 1 Паклитаксел 175 мг/м2 в/в 6 Каждые 3 недели Карбоплатин AUC 5-6 в/в Исследование ICON (2000) показало, что монохимиотерапия карбоплатином обеспечивает выживаемость, не хуже, чем при сочетании карбоплатина с паклитакселом, но с меньшей токсичностью. Этот факт необходимо помнить, особенно это важно при решении вопроса о химиотерапии у пожилых и ослабленных пациентов. Характерная особенность эпителиального РЯ – распространение опухоли по поверхности брюшины в пределах брюшной полости. Мета-анализ эффективности внутрибрюшинной химиотерапии показал снижение относительного риска прогрессирования и относительного риска смерти на 21% (Клинические рекомендации ESMO. Редакторы русского перевода С.А. Тюляндин, Д.А. Носов, Н.И. Переводчикова, 2010 г.). Эти данные стали основанием для внедрения внутрибрюшинной химиотерапии с использованием препаратов платины в качестве первой линии лечения больных III стадией РЯ после проведения оптимальной циторедуктивной операции. Неоадъювантная химиотерапия. К сожалению, не все пациенты распространенным раком яичников являются идеальными кандидатами для первичной циторедуктивной операции ввиду распространенности опухолевого процесса (главным образом выраженные асциты и экссудативные плевриты, экстраперитонеальные метастазы) либо слабого общесоматического состояния (ECOG 3). Для таких пациентов, после морфологического подтверждения диагноза, методом выбора является НАХТ карбоплатином/±паклитаксел (таблица 2).
Интервальная (промежуточная) циторедуктивная операция у таких больных может быть выполнена после 2-3 курсов НАХТ при улучшении общесоматического статуса по ECOG2 и хорошем клиническом ответе, который определяется по регрессии асцита и экссудативного плеврита, уменьшении опухоли и значительной регрессии уровня СА125 в крови (если был повышен исходно). Специфическая иммунотерапия Принципиально схема активной специфической иммунотерапии предусматривала активацию иммунокомпетентных клеток и их стимуляцию опухолевым антигеном. Способ выполнялся следующим образом. Осуществлялся забор 50 мл нативной венозной крови. Для предотвращения свертывания непосредственно после взятия добавлялся гепарин. Осуществлялось выделение лейкоцитов из крови путем центрифугирования на градиенте фикол-верографин (плотность 1,076) раздельно в 5 пробирках по 10 мл. Полученные на градиенте лейкоциты снимали пипеткой и переносили в общую пробирку с питательной средой (раствор Хенкса или среда 199), далее – повторно выделяли на аналогичном градиенте плотности в одной пробирке. Снятые с градиента плотности лейкоциты ресуспедировали в питательной среде объемом 10 мл. В среду добавляли 10000 МЕ IL-2 (ронколейкин 0,01 мг) и инкубировали в термостате при 37С в течении 6 часов.
Биопсийный материал злокачественного новообразования в объеме 2-3 мл разводили в 10 мл дистиллированной воды и гомогенизировали 500 Вт ультразвуковым гомогенизатором (Cole Parmer, США) в течение 15 минут, что гарантировало полное разрушение клеточных элементов при сохранении основных белковых антигенных детерминантов. Для исключения попадания неразрушенных клеток в среду инкубации и далее – в организм материал подвергали фильтрации (фильтры NucleoSpin, Macherey-Nagel, Германия) с последующим осаждением на ультрацентрифуге (10000 g в течение 10 минут). Полученный гомогенат добавляли к инкубированным лейкоцитам в количестве 1 мл на 5 мл питательной среды с лейкоцитами и инкубировали далее 12 часов. Далее полученную взвесь лейкоцитов разделяли на порции по 5 мл и выделяли на градиенте фикол-верографин, ресуспендировали в питательной среде трижды, окончательно выделяли и вводили в организм реципиента путем внутривенной инфузии. Вся методика выполнялась в стерильных условиях.
Динамика показателей клеточного иммунитета и содержания цитокинов в ходе комбинированного лечения рака яичников
При включении способов специфической иммунокоррекции в комплекс лечения больных раком яичников после комбинированного лечения не было зарегистрировано существенной динамики к нормализации содержания Т-киллеров. По относительной величине показателя отмечалась даже тенденция к снижению.
В то же время была зарегистрирована практически полная нормализация абсолютного и относительного содержания в крови В-лимфоцитов.
Достоверный рост был выявлен в отношении абсолютной величины содержания активированных Т-хелперов, который составил 54,5% (р 0,05). По относительному показателю была зарегистрирована полная нормализация.
Отмечалась тенденция к уменьшению показателей концентрации в крови активированных общих лимфоцитов. В результате при проведении СИТ после комбинированного лечения достоверных различий по абсолютному значению данного показателя не было зарегистрировано, а по относительному, несмотря на сохраняющееся превышение над контролем на 26,3% (р 0,05), различия с состоянием непосредственно после комбинированного лечения составили 22,1% (р 0,05).
Наблюдалась полная нормализация иммунорегуляторного индекса. Индекс активации имел динамику к росту на 58,9% (р 0,05). Различия по данному показателю с контролем достигали 34,2% (р 0,01). Умеренная динамика к снижению ИТМЛ при проведении СИТ была незначимой.
Более значительные отклонения от средних величин, характерных для контрольной группы здоровых лиц, были выявлены при проведении терапии у пациентов с раком яичников III ст. (таблица 12). При этом использование в комплексе лечения СИТ обеспечивало наличие определенных тенденций в динамике иммунологических показателей, но недостоверных различий.
Так, в обеих подгруппах обследованных больных было выявлено значимое снижение абсолютного числа лейкоцитов в крови в обеих группах обследованных больных, при этом в основной группе зарегистрированы различия с контролем на 40,7% (р 0,01). Таблица 13 - Динамика показателей клеточного звена иммунитета у больных раком яичников III ст. при проведении СИТ на фоне комбинированного лечения
Примечание - Р1 - статистическая значимость различий больных с контролем на фоне противоопухолевой терапии, Р2 - статистическая значимость с контролем при проведении СИТ, РЗ - статистическая значимость различий показателей при проведении комбинированного лечения и комбинированного лечения + СИТ Не было существенных различий между обследованными подгруппами больных в отношении содержания общих лимфоцитов, также значимой была степень снижения этого показателя по отношению к контрольной группе (р 0,01). В отличие от всех ранее описанных групп, очень значительным было и уменьшение абсолютного содержания CD3+ клеток. Существенных различий по этому показателю, а также абсолютному и относительному содержанию CD3+CD4+ лимфоцитов и CD3+CD8+ клеток между группами больных в зависимости от проводимой терапии не было зарегистрировано.
Только умеренная и недостоверная тенденция к росту была выявлена в отношении абсолютного и относительного содержания CD3-CD56+CD16+ клеток в группе дополнительного применения СИТ по отношению к группе комбинированного лечения. Следует обратить внимание на нивелирование статистически значимых различий по относительному показателю в отношении практически здоровых лиц.
Отмечалась значительная динамика к увеличению абсолютного и относительного содержания Т-киллеров. В первом случае различия с величиной показателя в ходе специализированного лечения достигали 65,8% (р 0,05), во втором – 51,0% (р 0,05). По средним значениям обоих показателей значимость различий с контролем уменьшилась. Однако, в отношении содержания В-лимфоцитов, в отличие от группы больных раком яичников III ст., существенного роста не было выявлено.
Недостоверная тенденция к повышению как абсолютного, так и относительного содержание CD4+CD25+ клеток в крови не привели к нивелированию различий с контрольной группой практически здоровых лиц. В частности степень снижения абсолютного содержания данных клеток составила 52,4% (р 0,01).
Имелась тенденция к росту CD95+ клеток, в результате которой различия с показателем контрольной группы стали статистически значимыми (на 23,1%, р 0,05). Почти двукратное превышение сохранялось по относительной величине данного показателя (р 0,01). Иммунорегуляторный индекс у больных группы комбинированного лечения + СИТ был не только значимо снижен в сравнении с контрольной группой, но и имел тенденцию к дальнейшему уменьшению по отношению к группе больных, получавших специализированное лечение.
Индекс активации у рассматриваемых больных был на 62,5% ниже, чем в контроле (р 0,01). Средняя величина ИТМЛ уменьшилась по сравнению с показателем в ходе комбинированного лечения незначимо, и имела превышение над контролем на 67,3% (р 0,01) (рисунок 3). Таким образом, полученные в результате анализа показателей клеточного иммунитета данные позволяют сделать заключение, что проведение СИТ, как после оперативного лечения, так и на фоне полихимиотерапии, хотя и способствует развитию тенденции к нормализации исследованных показателей, однако, вовсе не обеспечивает достоверной их динамики при наличии достоверных же различий с контролем, связанных с наличием злокачественного новообразования и применением методов противоопухолевого лечения. Активация лимфоцитов посредством инкубации их с опухолевым антигеном и цитокинами и последующая реинфузия, как мы полагаем, не может служить адекватным методом стимуляции различных иммунных механизмов, кроме улучшения распознавания данного антигена.
В то же время подавление функциональных механизмов иммунной системы и снижение абсолютного числа иммунокомпетентных клеток не позволяет обеспечить эффективную реализацию сформировавшихся механизмов противоопухолевого иммунитета. У больных раком яичников II ст. при проведении СИТ на фоне комбинированного лечения наблюдалась только тенденция к нормализации содержания IL-2 (таблица 13), при том, что статистически значимые различия с контрольной группой имели место в обеих подгруппах основной (р 0,01).
Клинические результаты лечения в сравниваемых группах
эффектом анализировалось содержание ИЛ-6, обладающего, как полагают возможностью Рак яичников – весьма распространенное онкологическое заболевание. Его относительная частота в различных популяциях составляет 4-6%, а роль в структуре новообразований у женщин – 10-13%. Имеются лишь ограниченные данные, характеризующие эффективность иммунотерапии рака яичников. В своем исследовании мы выбрали в качестве подходов для анализа определение содержания клеточных элементов иммунной системы, а также анализ взаимосвязей данных элементов и иммунорегуляторных факторов – цитокинов. Клеточное звено иммунной системы не только обеспечивает основной вклад в противоопухолевые механизмы иммунитета, но и является наиболее уязвимым для побочных эффектов противоопухолевой терапии. Именно эти два момента послужили основой нашего выбора. Для анализа были избраны показатели содержания в крови клеток с различными маркерами дифференцировки, соответствующими иммуноцитам, обладающим противоопухолевыми эффектами, т.е. компонентами клеточного звена иммунитета. Общее содержание Т лимфоцитов, учитывая проведение специфической противоопухолевой терапии, в большой степени характеризовало возможность негативного влияния последней на иммунный статус. Показатели содержания цитотоксических клеток давали четкую картину состояния противоопухолевого иммунитета. В качестве дополнительного подхода к исследованию было избрано определение содержания цитокинов различных классов, в том числе обладающих противоопухолевыми свойствами (ФНО-альфа, ИЛ-12). В качестве альтернативы цитокином с противоопухолевым стимуляции опухолевого роста. При анализе полученных данных учитывалось, что регуляция содержания цитокинов определяется механизмами прямой и обратной связи, задействованными на уровне выработки иммуноцитами регуляторных цитокинов. Поэтому повышение содержания проопухолевых факторов в крови в ходе проведения лечения не могло быть однозначно охарактеризованным негативной реакцией, поскольку этот эффект мог быть компенсаторным при реализации лечебного воздействия.
Результаты анализа содержания клеток с противоопухолевой активностью в крови у обследованных больных до начала лечения было выявлено статистически значимое снижение такового, наиболее четко прослеживающееся в отношении лимфоцитов, имеющих непосредственную киллерную активность, т.е. Т-киллеров и натуральных киллеров. Следует указать на преимущественное снижение числа натуральных киллеров.
Были выявлен также очень существенные изменения со стороны цитокинового баланса. В исходном периоде исследования отмечалось статистически значимое повышение содержания проопухолевого цитокина ИЛ-6 и снижение противоопухолевых (ИЛ-12). Относительное снижение последнего было ассоциировано с клинической стадией заболевания.
В процессе противоопухолевого лечения была выявлена динамика к изменению функционального состояния регуляторных и эффекторных механизмов иммунной системы у обследованных больных. В частности, весьма значительно снизилось содержание клеток, обладающих противоопухолевой активностью, отмечалась тенденция к росту проканцерогенных факторов. Как мы указывали ранее, данные тенденции могут быть вызваны действием механизмов обратной связи, реализуемых на уровне регуляторного звена иммунной системы.
Мы полагаем, что использование иммунотерапии у больных раком яичников может повысить эффективность лечения в том случае, если она будет направлена, в частности, на активацию клеточного звена иммунитета. В противном случае реализация эффектов сочетанной терапии может дать негативный иммунологический результат со снижением общей клинической эффективности лечения. Полученные данные могут быть использованы для разработки эффективных подходов к терапии больных раком яичников посредством учета и коррекции иммунологических составляющих патогенеза.