Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Семейство раково-тестикулярных антигенов 10
1.2. Применение РТА в терапии лейкозов 12
1.3. Ген PRAME. Значение в терапии опухолей 16
1.3.1. Ген PRAME – ингибитор сигналов ретиноевой кислоты 16
1.3.2. Белок PRAME играет роль в регуляции TRAIL в опухолевых клетках 16
1.3.3. Белок PRAME является частью Cul2 Е3 убиквинтинлигазного комплекса 18
1.3.4. Значение гена PRAME в апоптозе 19
1.3.5. Регуляция гена PRAME в клетке 21
1.3.6. Проблема локализации белка PRAME в опухолевой клетке 22
1.4. Ген PRAME – маркер диагностики опухолей человека 23
1.4.1. Ген PRAME– маркер диагностики меланомы 23
1.4.2. Ген PRAMEв дифференциальной диагностике солидных опухолей 25
1.5. Применение белкаPRAME в терапии опухолей человека 26
1.5.1. Вакцина, направленная на два антигена:PRAMEи PSMA 26
1.5.2. Вакцина на основе PRAME при немелкоклеточном раке легкого 28
1.5.3. Вакцина на основе PRAME при меланоме 29
1.6. Дендритные клетки (ДК) и их значение в обеспечении противоопухолевой защиты организма 31
1.6.1. Биология дендритных клеток. 31
1.6.2. Цитотоксическое действие ДК и их значение в обеспечении 37
противоопухолевого иммунитета 37
1.7. Заключение 42
Глава 2. Материалы и методы исследования 44
2.1. Материалы и оборудование 44
2.1.1. Реактивы 44
2.1.2. Клеточные линии 45
2.1.3. Оборудование 45
2.2. Методы исследования 45
2.2.1. Культуральный метод 45
2.2.2. Трансфекция линий культивируемых клеток плазмидой, содержащей ген PRAME 46
2.2.3. Выделение лимфоцитов (ЛФ) на среде Lymphoseparation medium по градиенту плотности из КМ 46
2.2.4. Приготовление препаратов из клеток костного мозгадля иммуногистохимического окрашивания 47
2.2.4.1. Работа с живыми клетками в лунках с полилизином на предметных стеклах 47
2.2.4.2. Приготовление фиксированных препаратов на предметном стекле (без полилизина) 48
2.2.4.3. Приготовление фиксированных препаратов из КМ в лунках с полилизином на предметном стекле 49
2.2.5 МТТ тест 50
2.3. Метод анализа ДНК микрочипов 51
2.4. Получение дендритных клеток 53
2.4.1. "Нагрузка" ДК 53
2.4.2. Терминальная дифференцировка ДК 54
2.4.3. Совместная инкубация ДК с опухолевыми или нормальными клетками 54
2.5. Выделение РНК и ПЦР в реальном времени 54
Глава 3. Результаты исследований 56
3.1. Результаты трансфекции линий B16F10 и WI-38 плазмидой, содержащей ген PRAME 56
3.2. Локализациябелка PRAME 56
3.2.1. Локализация белка PRAME в опухолевых линиях 56
3.2.2. Распределение белка PRAME в клетках костного мозга больных острым лейкозом 63
3.3. Подавление роста PRAME-экспрессирующих опухолевых клеток при инкубации их с моноклональных антителами к белку PRAME 67
3.3.1. Воздействие моноклональных антител на линию B16F10PRAME 67
3.3.2. Цитостатическое действие МКА к PRAME на опухолевые клетки 68
3.4. Исследование влияния экспрессии гена PRAME на транскрипционный профиль WI-38 PRAME 72
3.5. Сохранение цитотоксической активности дендритных клеток после нагрузки рекомбинантным белком PRAME 73
Глава 4. Обсуждение результатов 83
4.1. Оценка особенностей локализации белка PRAME в опухолевых клетках 83
4.2. Изучение цитостатического эффекта моноклональных антител к белку PRAME на рост опухолевых клеток 85
4.3. Изменение уровня экспрессии генов в линии клетокWI-38 после трансфекции онкогена PRAME 87
4.4. Оценка нагрузки рекомбинантным белком PRAMEдендритных клеток на их цитотоксическоедействие 92
Заключение 95
Выводы 97
Список использованных сокращений 98
Список литературы 101
- Значение гена PRAME в апоптозе
- Локализация белка PRAME в опухолевых линиях
- Сохранение цитотоксической активности дендритных клеток после нагрузки рекомбинантным белком PRAME
- Изменение уровня экспрессии генов в линии клетокWI-38 после трансфекции онкогена PRAME
Значение гена PRAME в апоптозе
Используя подход, основанный на микрочипах, Tajeddine et al. проанализировали [205] профиль экспрессии генов линии KG-1, стабильно трансфецированных с pIRES-hrGFP или pIRES-PRAME. Tajeddine et al. обнаружили, что гиперэкспрессия PRAME вызывает существенное снижение транскрипции циклин-зависимого киназного ингибитора p21, белка теплового шока Hsp27, и EF кальций-связывающего белка S100A4. Белок S100A4 специфически экспрессируется в мышиных и человеческихметастазирующих опухолях. Экспрессия белка S100A4 в опухолях, находящихся на более ранней стадии развития (до образования метастаз) у человека и мыши приводит к увеличению степени злокачественностифенотипа клеток. Кроме того, высокий уровень белка S100A4может соотноситься с плохим прогнозом при некоторых типах рака. Белок S100A4 может влиять на развитие метастазирования, регулируя экспрессию ферментов эндопептидаз– матриксных металлопротеиназ (ММР).
Действительно, деградирующая активность ММР может приводить к прогрессии опухолей, действуя на ангиогенез опухоли, рост опухоли и/или метастазирование. Белок S100A4 также вызывает активацию ММР-2 или ММР-9, двух ферментов, которые участвуют в инвазивном поведении опухолевой клетки (установлено на моделяхклеточных линий ОЛЛ и ОМЛ). Основываясь на этих биологических данных, благоприятный прогностический эффект экспрессии гена PRAME при ОМЛ и ОЛЛ может быть объяснен уменьшением экспрессии S100A4 и последующим снижением активации ММРs. Поочередно сообщалось о том, что S100A4 изолирует и ингибирует действие опухолевого супрессорабелка р53. Уменьшение экспрессииS100A4 может, следовательно, отменять его ингибиторные эффекты на р53, таким образом, улучшая прогноз. Однако этоявляетсяеще предметом противоречий. Hsp27 является небольшим (по молекулярной массе) белком теплового шока в нормальных и опухолевых клетках. Этот белок является молекулярным шапероном и ингибирует ключевые эффекторы апоптотического пути, такие как апоптосома и каспазы. При раке молочной железы, раке яичников, аденокарциноме простаты, остеосаркоме, раке эндометрия и лейкозах в опухолевых клетках экспрессируются повышенные уровни белка Hsp27 по сравнению с не трансформированными клетками.
Увеличивающаяся экспрессия Hsp27 при этих злокачественных новообразованиях, по-видимому, коррелирует с онкогенезом и устойчивостью к химиотерапии, предположительно вследствие способности Hsp27 ингибировать апоптоз. В частности, экспрессия Hsp27при ОМЛ была связана, в том числе, и с резистентностью к химиотерапии. Также гиперэкспрессия PRAME в клеточной линии KG-1 уменьшает транскрипцию опухолевого супрессора белка р21. Это наблюдение было неожиданно, поскольку белок р21 является ингибитором клеточной пролиферации. Однако последние данные показали, что белок р21 принимает участиеи в проапоптотическом и антиапоптотическом ответе клетки на химиотерапию [206]. Таким образом, снижение регуляции этих трех белков, которое следует за сверхэкспрессией белка PRAME, может способствовать улучшению прогноза острых лейкозов экспрессирующих PRAME.
Локализация белка PRAME в опухолевых линиях
Во всех исследуемых в работе культурах клеток, а также клетках крови и костного мозга больных острыми лейкозами производили определение уровня экспрессии гена PRAME методом ПЦР в реальном времени. Локализация белка PRAME в опухолевой клетке (лейкоз, лимфома, меланома) определялась с помощью иммунофлуоресцентного анализа, при этом использовались мышиные МКА к белку PRAME(5D3F2 и 6H8F12) и вторичные флуоресцентные антимышиные антитела. В качестве контроля использовали химерное моноклональное антитело CD20 (ритуксимаб). В линии клеток меланомы человека melKor, которая показала высокий уровень экспрессии PRAME (табл. 2), обнаружили локализацию белка PRAME преимущественно в ядре (66,5%), в цитоплазме (28,5%) и на поверхности клеток (5%).
При исследовании кинетики связывания мышиного МКА 5D3F2 (1:100) с клетками меланомы mel Kor было обнаружено, что при увеличении времени инкубации с 30 до 120 мин происходит перераспределение сигнала флуоресценции. Это обнаруживается в виде усиления внутриклеточного сигнала по сравнению с поверхностью клетки (рис. 1).
В клетках эритромиелоидного лейкоза линии К562 уровень экспрессии гена PRAME был высоким (табл. 2).На фиксированных препаратах из линии K562 было обнаружено, что полученные нами 2 типа МКА 5D3F2 и 6H8F12 имеют отличные друг от друга сайты связывания в этих клетках. При использовании МКА 5D3F2 сигнал флуоресценции обнаруживался в равных долях как внутриклеточно – в ядре (51%), так и в перинуклеарном пространстве и в цитоплазме (49%). Для МКА 6H8F12 при одинаковых условиях инкубации сигнал флуоресценции был обнаружен на клеточной поверхности линии К562 (рис.2).
Для того чтобы изучить локализацию белка PRAME в клетке были выбраны линии фибробластов человека WI-38 и меланомы мыши B16F10, которые не экспрессируют ген PRAME. В исходной линии клеток WI-38 при инкубации ее с МКА 5D3F2 к PRAME не было обнаружено никакого сигнала флуоресценции (рис.3, а). После проведенной трансфекции уровень экспрессии гена PRAME в клетках линии WI-38-рCEP4-PRAME был сравним с уровнем, который обнаружили в клетках линий melKor и K562 (табл.2). После инкубации трансфецированных клеток WI-38-рCEP4-PRAME с МКА к PRAME уровень обнаруженного флуоресцентного сигнала в этих клетках был также высок, как и в линиях с первоначально высоким уровнем экспрессии гена PRAME. При этом сигнал флуоресценции наблюдали в основном внутриклеточно в ядре клетки и в цитоплазме, что очень похоже на картину для линии клеток К562 (рис.3).
Кроме того, для трансфецированной геном PRAME линии клеток WI-38 PRAME при постановке иммуногистохимической реакции была обнаружена локализация флуоресцентного сигнала в ядре клетки. Ее особенностью было образование отдельных ярко светящихся точек, которые образовывали в ядре клетки скопления – «кластеры» (см. рис. 4). Отметим, что подобные структуры в ядре клетки наблюдали и на линии клеток melKor, которая обладает достаточно высоким уровнем экспрессии гена PRAME.
Анализируя данные, полученныепри инкубировании нативных клеточных линий с различными концентрациями МКА, было сделано предположение о том, что МКА при использовании в высокой концентрации, связавшись с клетками, в основном остаются на поверхности. При использовании же меньшей концентрации антител, они более равномерно связываются с эпитопами на поверхности живой клетки и посредством ряда адаптерных белков-переносчиков, возможно, проникают через цитоплазматическую мембрану внутрь клетки. В дальнейшей работе было подобрано максимальное разведение МКА к белку PRAME, которое давало четкий сигнал флуоресценции. При инкубации клеток меланомы мыши B16F10,которые были трансфецированы контрольной плазмидой pCEP4, с МКА к белку PRAME сигнала флуоресценции обнаружено не было. В клетках мышиной меланомы B16F10-рCEP4-PRAME уровень экспрессии гена PRAME был ниже, сигнал наблюдаемой флуоресценции был слабее, количество клеток с локализацией сигнала в ядре было меньше по сравнению с линиями клеток melKor, К562 и WI-38-рCEP4-PRAME (табл.2). При проведении экспериментов на нативных препаратах клеток B16F10-pCEP4-PRAME, которые имели относительно высокий уровень экспрессии гена PRAME, наблюдаемый сигнал флуоресценции с МКА 5D3F2 и 6H8F12 был слабее (рис.5).
Сохранение цитотоксической активности дендритных клеток после нагрузки рекомбинантным белком PRAME
Одним из важных свойств ДК является их цитотоксическое действие на опухолевые и чужеродные клетки. При получении противоопухолевых ДК-вакцин необходимо сохранить полноценную функциональную активность ДК. Целью этой части работы была проверка возможности сохранить цитотоксическое действие ДК при нагрузке полученным нами рекомбинантным белком PRAME. При этом мы проводили сравнение рекомбинантного белка PRAMEс другим источником белка PRAME, а именно лизатом опухолевых клеток линии К562. В этой линии, как показали наши данные ПЦР анализа, имеется высокая спонтанная экспрессия белка PRAME. Для проведения экспериментаДК были получены из мононуклеарных клеток донора. Затем проводили инкубацию ДК с опухолевыми линиями клеток.Клеточные линии, использованные в эксперименте, различались по скорости роста: медленно растущие культуры NOMO-1 и THP-1 (уровень экспрессии PRAME в этих клетках составил 0,713% и 44,3% соответственно) и быстрорастущие К562 и U937 (в этих клетках уровень экспрессии PRAME составил 541% и 3,4% соответственно). Данные по уровню экспрессии гена PRAME в линиях были получены в данном эксперименте с помощью ПЦР анализа. Наблюдались различия и в самом профиле экспрессии РТА. Кроме PRAME, в клетках линии К562 наблюдалась экспрессия генов GAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SEMG1 и SPANXA1. Не было обнаружено мРНК GAGE, NY-ESO-1, MAGEA1, PASD1, SEMG1 и SPANXA1 в линияхNOMO-1,THP-1 и U937. В ДК, выделенных из мононуклеарной фракции крови донора, после инкубации с факторами, вызывающими их полное созревание, присутствовало 39,4% СD83+ ДК и 55,9% СD86+-ДК. Для оценки уровня пролиферации опухолевых клеток при их совместной инкубации с клетками опухоли был использован радиоизотопный метод и подсчет концентрации клеток с помощью камеры Горяева. В лунки с клеточной смесью (ДК плюс опухолевые клетки) за сутки до окончания инкубации вносили тимидиновую метку (меченое радиоактивным изотопом производное тимина 3Н тимидин). Зрелые ДК донора, нагруженные и ненагруженные белком PRAME, подавляли включение [3Н] тимидина в медленно растущие клетки NOMO-1 и THP-1 при их соотношении 1:1 (по 5103 в лунке каждого вида клеток) по сравнению с интактными клетками и клетками, растущими с незрелыми ДК (рис. 10). Предполагалось, что ДК, нагруженные белком PRAME, будут значительно подавлять рост быстрорастущих клеток К562, имеющих высокий уровень экспрессии гена PRAME. Однако ДК, нагруженные белком PRAME, при совместной инкубации с быстрорастущими лейкозными клетками К562 или U937 практически не проявили ожидаемого эффекта. В присутствии незрелых ДК отмечено увеличение скорости роста клеток (рис.10).
Одновременное увеличение в два раза плотности зрелых ДК и клеток-мишеней при их совместной инкубации усиливало цитотоксическое действие ДК на все клетки (рис. 14). При совместной инкубации опухолевых клеток вместе с ДК в лунках планшета для подсчета с трипановым синим их различали по морфологии. С помощью камеры Горяева был определен процент живых клеток перевиваемых линий, культивируемых совместно с ДК, и его сравнили с количеством клеток, которые образуются в линии, культивируемой без ДК (контроль). Зрелые ненагруженныеДК, выделенные из крови донора, при культивировании в соотношении ДК: клетки-мишени 1:1 (по 104 в лунке каждого вида клеток) полностью подавили рост клеток NOMO-1, а рост остальных клеток был подавлен на 40-60%. Нагрузка ДК лизатом клеток К562 вызвала усиление действия ДК против клеток К562. При этом рост клеток других линий подавлялся слабее, чем при культивировании со зрелыми ненагруженными ДК. ДК, нагруженные белком PRAME, подавили рост клеток THP-1 и K562 на 60%, максимальное подавление наблюдали на клетках NOMO-1 и U937 (рис. 14).
Таким образом, при увеличении плотности линий, использованных в работе,нагрузка ДК специфическим опухолевым антигеном белком PRAME, приводила к более сильному подавлению роста всех клеток по сравнению с ДК, не нагруженными PRAME, или нагруженных лизатом клеток линии K562. ДК, нагруженные лизатом клеток К562, подавляли рост клеток К562, но слабее по сравнению с ДК, нагруженными рекомбинантнымPRAME. Нагрузка ДК лизатом клеток К562 вызывала более слабое подавление роста других линий клеток по сравнению с ДК без нагрузки или нагруженных белком PRAME. На микрофотографиях клеток, сделанных в конце инкубации (рис. 15), видно, что там, где воздействие ДК оценивалось как сильное, меняется плотность линий, заметно изменяется морфология клеток.
При увеличении соотношения ДК: К562=5:1 (2,5104: 5103) цитотоксическоедействие ДК было значительным. Незрелые ДК, нагруженные белком PRAME, слабее подавляли рост клеток по сравнению с ненагруженными ДК (рис. 16, а). Напротив, зрелые ДК, нагруженные белком PRAME, и затем инкубированные с ФНО-альфа и ПГЕ2, оказывали более сильное цитотоксическое действие (рис. 16, б). Если после нагрузки белком PRAME ДК не подвергались терминальной дифференцировке, то их действие на клетки К562 было слабым. Вероятно, после того, как ДК вступают в контакт с опухолевыми клетками, перерабатывая опухолевые антигены, опухолевые клетки, оставшиеся живыми, подавляют их дальнейшее созревание и тем самым ослабляют их цитотоксическое действие. Ещё большее цитотоксическое действие ДК на клетки опухолей проявлялось после добавления лимфоцитов донора к смеси клеток ДК+К562. При этом действие лимфоцитов, предварительно активированных ИЛ-2, в данном случае не отличалось от неактивированных лимфоцитов.
Клетки костного мозга больного ОММЛ получили через 2 месяца после установления диагноза и проведения 3 курсов химиотерапии. У пациента уровень экспрессии гена PRAME в дебюте заболевания составлял 3,3%, а в день взятия КМ для выделения ДК экспрессия гена PRAME была существенно ниже около 4,32x10-3PRAME/Abl%. Созревание ДК индуцировали согласно протоколу получения ДК из мононуклеаров периферической крови здорового донора [10]. Сравнивали влияние плотности и соотношения ДК к клеткам К562 на рост клеток К562 (рис. 17).
Для оценки цитотоксического эффекта ДК подсчитывали число клеток К562 в лунке с помощью камеры Горяева и использовали тимидиновую метку. При совместной инкубации в соотношении 1:1 число клеток К562 уменьшалось в 2,5 раза по сравнению с контролем. Увеличение концентрации зрелых ДК до соотношения 3:1 относительно исходной концентрации клеток К562 (5103 в лунке) приводило к снижению числа клеток К562 к 7 суткам инкубации почти в 7 раз (рис.17 а). При повышении исходной концентрации ДК и клеток К562 до 104 или 1,5104 влияние ДК было слабее. Нагрузка ДК белком PRAME при инкубации с К562 не дала значительного преимущества по сравнению со зрелыми ДК, ненагруженных антигеном (рис. 17 б).
Изменение уровня экспрессии генов в линии клетокWI-38 после трансфекции онкогена PRAME
Была поставлена задача изучить, как изменится уровень экспрессии генов в нормальной клетке после трансфекции гена PRAME. Для проведения этого эксперимента выбрали линию клеток фибробластов легкого человека WI-38.
Полученные нами данные показали, что трансфекция гена PRAME в клетку вызывает активизацию транскрипции большого количества генов. В результате экспрессии гена PRAME произошло увеличение концентрации трансфецированных клеток WI-38 в два раза. Кроме того,были обнаружены более чем двукратные изменения в уровне экспрессииу 10 генов. Среди этих генов были обнаружены как протоонкогены, так и гены – супрессоры опухолевого роста. Причиной увеличения концентрации трансфицированных WI-38 может быть PRAME-опосредованная активация генов RAB2, G1P3 и ACTB и повышение уровня экспрессии генов EMP2 и MAD2L1. Функции этих генов хорошо изучены. Ген RAB2 (относится к семейству RAB2-RAS) кодирует адаптерный белок, который участвует в передаче сигнала по RAS-RAF-MAPK киназному пути. Сигнальный каскад инициируется путем стимуляции фактором роста связанного с мембраной рецептора тирозинкиназы. При активации RAS, комплекс образуется между RAS и одной из изоформ серин/треониновых протеинкиназ RAF: ARAF, BRAF, иRAF1 (также известный как CRAF). Образование комплекса между RAS и RAFприводит к активации RAF. Как только RAF активируется, сигнал передается посредством фосфорилирования МЕК (MAPK/ERK киназа, также известная, как MAP2K), которая является серин/треониновой киназой, представленной в двух изоформах (МЕК1 и МЕК2). Фосфорилирование активирует киназную активность МЕК, которая фосфорилирует MAPK (также известную как ERK) изоформу, MAPK3 (также известную как ERK1) и MAPK1 (также известную как ERK2). В результате активации митоген активированных протеинкиназ (MAPK3) и (MAPK1) через их взаимодействие с множеством субстратов в цитозоле и последующего фосфорилирования транскрипционных факторов индуцируется ряд процессоввыживания, включая пролиферацию и защиту от смерти клетки путем апоптоза [118, 182]. БелокG1P3 ингибирует TRAIL-индуцируемыйапоптоз [46]. В нашем эксперименте уровень экспрессии гена TRAIL под влиянием гена PRAME не изменился, хотя, ориентируясь на результаты DeCarvalho et al., можно было ожидать его снижения[57]. При трансфекции гена PRAME наблюдали активацию экспрессии гена актина (ActinB). Белок актин, кодируемый этим геном, участвует в формировании актиновых микрофиламентов, которые, наряду с другими элементами, входят в состав цитоскелета клетки. На этапе промоции опухоли в клетках происходит так называемый эпителиально-мезенхимальный переход. В результате опухолевая клетка становиться подвижной, уменьшается степень ее контактов с матриксом и соседними клетками, она приобретает фибробластоподобную форму. Таким образом, можно предположить, что активация белка актина будет связана с усилением их двигательной активности и скорости развития инвазии и метастазирования. Кроме того, экспрессия гена PRAME вызывает повышение уровня экспрессии ряда факторов, в том числе митогенных EMP2, активаторов клеточного цикла (MAD2L1). Функции этих генов связаны с увеличением количества митозов в клетке. Следовательно, экспрессия гена PRAME в клетке приводит к активации ряда генов, в основном, способствующих прогрессии опухоли, чем можно объяснить неблагоприятный прогноз у PRAME положительных больных. Одновременно с этим после трансфекции PRAME клеток происходит активация транскрипционного фактора SP110. Экспрессия транскрипционного фактора SP110 запускается ретиноидами, а сам фактор стимулирует экспрессию генов, ответственных за ATRA-зависимую дифференцировку клеток.Однако функции SP110 в тканях солидных опухолей неизвестны, и по этой причине значение гена SP110 может быть либо нейтральным, либо антиканцерогенным [31]. В тоже время при трансфекции гена PRAME происходит активизация транскрипционного фактора STAT1, который может играть роль как опухолевого супрессора, или наоборот способствовать развитию опухоли. STAТ1 обычно способствует апоптозу, индуцируя экспрессию членов семейства рецепторов клеточной смерти на поверхности клетки и их лигандов, в дополнение к каспазам и iNOS. STAT1может также подавлять экспрессию гена MDM2, который, является ингибитором р53 [15, 47, 152]. Кроме того, STAT1 блокирует продвижение по клеточному циклу, индуцируя экспрессию IFITM1, CDK ингибитора р21waf/cipиp27Kip1,G1/S фаза блокируется KLF4 [25]. STAT1 может также ингибировать ангиогенез опухоли, и следовательно, рост опухоли и метастазирование, подавляя активность VEGF и экспрессию проангиогенного FGF-, в то же время включая антиангиогенный хемокин IP-10 (CXCL10) [152]. Однако, уровень экспрессии генов MDM2 и TP53, а также генов группы VEGF в эксперименте значимо не изменился.Кроме этого, уровень активности гена, кодирующего белок STAT3, белка-партнёра STAT1, после трансфекции PRAME остался неизменен. Согласно последним данным ген STAT3 рассматривается как ген, способствующий дальнейшей прогрессии опухолей. Таким образом, полученные данные, наводят на мысль о том, что ген STAT1 не принимает участия в PRAME опосредованной трансформации клетки.
Однако самым неожиданным наблюдением оказалось увеличение уровня экспрессии генов семейства MAGE. Раково-тестикулярные антигены MAGE семейства локализованы в кластерах на хромосоме Х [50, 118].Гены семейства MAGEA располагаются на Хq28, MAGEВ гены находятся на Хр21, и MAGEС гены на Хр26-27; они классифицируются как тип IMAGEгенов. Тип IIMAGEгенов (MAGED, MAGEE, MAGEF, MAGEH и некдин) экспрессируются во многих нормальных тканях на различном уровне [48, 50]. Действительно, растущий объем доказательств подтверждает мнение о том, что MAGE функционируют как онкогенные драйверы, а не простые биомаркеры или «пассажиры» глобальной дисрегуляции генома [236]. После трансфекции PRAME была обнаружена активация следующих генов семейства MAGE: MAGEA3, MAGEA6, MAGEA12.
Это приводит к подавлению активности опухолевого супрессора, p53, а также AMPK (АМР-зависимой протеинкиназы, которая приводит к активации аутофагии в клетке). Проопухолевое действие генов семейства MAGE связано с их влиянием на работу Е3 убиквинтинлигаз. Одним из первых признаков того, что MAGE формируют комплексы с Е3 RING убиквинтин лигазой появились на основе открытия, что MAGE-A2, -A3, -A6, и-C2 непосредственно связывают и регулируют TRIM28 (называемый также как KAP1) E3 убиквинтинлигазу. E3 убиквинтинлигаза является мультифункциональный белком, который участвует в регуляции транскрипции, дифференцировке клетки и восстановлении повреждений ДНК [62, 134]. Биохимический анализ активности убиквинтинлигазы TRIM28 показал, что эти MAGE стимулируют автоубиквинтинирование и убиквинтинирование его субстратов, опухолевого супрессора р53 и ZNF382in vitro [232, 233]. Было показано, что белок MAGE-A3 и высоко гомологичный белок MAGE-A6 (называемый также MAGE-A3/6) также связываютTRIM28 [62, 118]. Было обнаружено, что экспрессия MAGE-A3/6 стимулирует убиквинтинирование AMP-активированной протеинкиназы (AMPK) 1. Важно отметить, что MAGE-A3/6 не только способствует убиквинтинированию и последующей протеосомной деградации АМРК1, но также непосредственно взаимодействует c АМРК1 и определяет ее как субстрат для TRIM28 [155]. Следовательно, экспрессия MAGE-A3/6 в опухолевых клетках перепрограммирует часто встречающуюся убиквинтинлигазу TRIM28 к разрушению ключевых метаболических регуляторов и опухолевых супрессоров для усиления роста опухоли. Вдополнение, Pineda et al.обнаружили [155], что MAGE-A3/6RIM28 является решающей для поддержания активности mTOR[152]. Pineda et al. показали, что MAGE-A3/6RIM28 MRL ингибирует аутофагию, поскольку согласно полученным данным MAGE-A3/6 подавляет АМРК и активирует сигналыmTOR [155, 156].
Интересно отметить, что значительная доля генов, которые изменили свой уровень экспрессии при активации PRAME в клетке, имели в своих промоторахсайты связывания с транскрипционным фактором NFY. Согласно данным, полученным Costessi et al., белок PRAME предпочтительно связывается с данными сайтами связывания, особенно с группой генов, ответственных за развитие реакции воспаления [54]. В то же время, уровень экспрессии некоторых другихзначимых NFY-регулируемых генов существенно не изменился. В целом, изменения в уровне экспрессии генов, наблюдаемое после трансфекции гена PRAME, объясняет увеличение скорости роста клеток и дестабилизации генома. Подводя итоги, в опухолевых клетках постоянно происходят новые мутации, и их фенотип становится более злокачественным.