Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Современное представление о лимфоме ходжкина (обзор литературы) . 12
1.1 Этиология и патогенез лимфомы Ходжкина 12
1.2 Классификация и морфологическая характеристика лимфомы Ходжкина .14
1.3 Проблема рецидивов и резистентных к терапии форм заболевания 16
1.4 Лечение больных лимфомой Ходжкина с рецидивирующим и рефрактерным течением 19
1.5 Роль иммунотерапии в лечении рецидивов и рефрактерной лимфомы Ходжкина 24
ГЛАВА 2. Характеристика материала и методы исследования .34
2.1 Клиническая характеристика групп больных .34
2.2. Методы обследования и лечения больных 42
2.3. Характеристика методов исследования .45
Глава 3. Определение оптимальных режимов инкубации аутолейкомассы больных лимфомой ходжкина в присутствии интерлейкина-2 и интерферона-2в .47
Глава 4. Результаты лекарственной терапии больных рецидивной и рефрактерной лимфомой ходжкина с экстракорпоральной иммунотерапией .62
4.1. Непосредственные результаты лекарственной терапии у больных с рецидивами и рефрактерной лимфомой Ходжкина .62
4.2. Осложнения лекарственной терапии . 65
4.3. Ближайшие результаты лекарственной терапии .71
4.4. Обсуждение полученных результатов 77
Глава 5. Иммунологические аспекты применения метода экстракорпоральной иммунотерапии у больных с рефрактерной и рецидивной лимфомой ходжкина 81
Глава 6. Изучение интегративных критериев периферической крови в оценке эффективности иммунополихимиотерапии больных лимфомой ходжкина 94
6.1. Изучение структуры адаптационных реакций у больных рецидивной и рефрактерной лимфомой Ходжкина на этапах иммунополихимиотерапи .97
6.2. Изучение морфоструктуры сыворотки крови у больных рецидивной и рефрактерной лимфомой Ходжкина на этапах лечения 104
Заключение .118
Выводы .124
Практические рекомендации 126
Перечень использованных сокращений .127
Указатель литературы .
- Проблема рецидивов и резистентных к терапии форм заболевания
- Характеристика методов исследования
- Осложнения лекарственной терапии .
- Изучение морфоструктуры сыворотки крови у больных рецидивной и рефрактерной лимфомой Ходжкина на этапах лечения
Проблема рецидивов и резистентных к терапии форм заболевания
Лимфома Ходжкина является первичным опухолевым заболеванием лимфатической системы. Болезнь характеризуется клональным ростом многоядерных гигантских клеток Березовского – Рид-Штернберга и их мононуклеарных аналогов (клеток Ходжкина) (Крутилина Н.И., 2008). Окружением клеток служат зрелые лимфоциты с присутствием эозинофилов, плазматических клеток, гистиоцитов. При этом происходит неопластическая трансформация клеток, находящихся преимущественно в лимфоидной ткани. В 98% случаев опухолевый клон исходит из В-клеток зародышевых центров лимфатических узлов, в 2%- из Т-клеток (Клименко А.А., 2007; Вольченко А. А., 2010; Hussien A.E. et al., 2015).
Впервые описания заболевания встречаются в 1666г. в трудах M. Malpigi. В 1832 г. в сообщении Т. Ходжкина доложено о 7 больных, общими чертами болезни которых было увеличение лимфатических узлов и селезенки, кахексия и летальный исход. Основной вклад в морфологическое описание заболевания внесли работы С.Я. Березовского (1890), C.Sternberg (1898) и D.Reed (1902). Ими были описаны имеющиеся в малом количестве (1-2%) в массе пораженного опухолью лимфатического узла гигантские клетки. Эти клетки оказались специфичны для лимфомы Ходжкина (Ковригина А.М., 2005, 2006; Tsukazaki Y. et al., 2014). В зарубежной литературе они получили название клетки Штернберга–Рид, в отечественной - клетки Березовского - Штернберга.
ЛХ является относительно редкой патологией. Она распространена равномерно по всему миру, и показатели заболеваемости колеблются в пределах 2-3 случая на 100 000 населения (Имянитов Е.Н., 2007; Колыгин Б.А. и др., 2008; Давыдов М.И., Ганцев Ш.Х., 2009; Rodriquez D.C. et al., 2014; Vockerodt M. et al., 2014). Ежегодно в мире выставляется диагноз 1 на 25000 человек. Это порядка 1% от всех злокачественных новообразований. Среди всех лимфом доля лимфомы Ходжкина составляет около 30%. У большинства больных (60-90%) на момент постановки диагноза имеет место поражение лимфатических узлов средостения (Тюрин И.E., 2007; Даценко П.В. и др., 2011; Watanabe T. et al., 2014).
Заболеваемость в России ЛХ составляет 2,2 случая на 100 тыс. населения в год; 3,2 тыс. новых случаев ЛХ (Каприн А.Д. и др., 2014); 2,2 - в странах Европейского союза (ЕС) и 2,8 – в США. Смертность достигает 0,77 случая на 100 тыс. населения в год в России и 0,7 – в ЕС (Клименко А.А, 2007; Поддубная И.В., 2013). Заболевание возникает и развивается в любом возрасте. Однако отмечено, что пик приходится на подростковый и юношеский возраст (Имянитов Е.Н., 2007; Румянцев А.Г. и др., 2011; Morton L.M., 2006; Thyss A. et al., 2014).
Среди мужчин заболеваемость выше, чем среди женщин.
Заболеваемость мужчин больше в 1,5-2 раза в младшем возрасте и в группе лиц, старше 40 лет (Малихова О.А., 2010; Аршанская Е.Г., 2014). Однако, у лиц женского пола, согласно данным литературы, частота встречаемости вторичных злокачественных образований после лечения лимфомы Ходжкина выше, чем у мужчин (Демина Е.А., 2007, 2008; Armstrong G.T., 2009; Swerdlow A.J., 2011; Norval E.J., 2014; Schellong G. et al., 2014; Treetipsatit J. et al., 2014), что связано с возрастанием риска развития таких заболеваний, как рак молочной и щитовидной желез (Каприн А.Д. и др., 2013; Meadows A.T., 2009; Mohamed G. et al., 2014).
В 1971г. A. Evans, а затем и N. Mueller выявили зависимость между инфицированностью вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ) и частотой возникновения ЛХ. Исследованиями, проведенными в Дании и Швеции, выявлено, что относительный риск ВЭБ-позитивной ЛХ был в 4 раза выше у больных острым инфекционным мононуклеозом с серологически подтвержденной инфекцией. Для возникновения возможности опухолевой трансформации необходима активация нескольких генов ВЭБ. Однако окончательно вопрос о роли ВЭБ-инфекции в этиологии и патогенезе ЛХ не решен и остается дискутабельным (Крутилина Н.И., 2008; Крячок И.А. и др., 2012; Al-Salam S., 2013; Torres Espndola L.M., 2013).
Роль генетической предрасположенности в настоящий момент изучается, выявляется она в 1% случаев лимфомы Ходжкина. Сиблинги больных заболевают в 3-7 раз чаще, чем в популяции (Yri O.E. et al., 2011; Guisado-Vasco P. et al., 2012).
Важную роль в патогенезе заболевания играет клеточное окружение опухолевых клеток. Ткань лимфатического узла состоит из малых лимфоцитов, гистиоцитов, нейтрофилов, эозинофилов, плазматических клеток и фибробластов в различных пропорциях. Эти клетки привлекаются выделяемыми клетками Березовского-Штернберга биологически активными молекулами (провоспалительные цитокины, фактор роста фибробластов, фактор некроза опухолей и др.), и могут влиять на способность неопластических клеток ускользать от иммунного надзора за их ростом. Действием этих молекул также объясняется большинство симптомов интоксикации, наблюдаемых у больных (Демина Е.А., 2007).
Характеристика методов исследования
Все больные до начала и в процессе лечения подвергались обязательному обследованию. Выполнялся полный физикальный осмотр, включающий исследование всех доступных периферических лимфатических узлов, пальпацию брюшной полости. Всем больным выполнялась пункция, а затем биопсия пораженного лимфатического узла, его морфологическое и/или иммуногистохимическое исследование, полный клинический анализ крови с подсчетом числа тромбоцитов, лейкоцитов и лейкоцитарной формулы, определение уровня гемоглобина и СОЭ, биохимический анализ крови с исследованием уровня лактатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы, аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, общего белка, общего билирубина и его фракций, уровня кальция сыворотки. Всем больным перед началом и в динамике лечения выполнялась компьютерная томография органов средостения, ультразвуковое исследование печени, селезенки, забрюшинных и внутрибрюшинных лимфатических узлов, почек, щитовидной железы. Для исключения поражения костной ткани использовали остеосцинтиграфию. Исходные объективные и лабораторные данные были сопоставимы в обеих группах.
После установления первично-резистентной к терапии формы заболевания или раннего рецидива лимфомы Ходжкина больным основной группы проводилось 6 курсов полихимиотерапии II линии по схеме DHAP в сочетании с экстракорпоральной иммунотерапией во 2 и 4 циклах, больные контрольной группы получали 6 курсов традиционной полихимиотерапии по той же схеме. Методика лечения больных основной группы (Патент на изобретение № 24187727 от 20.07.2013 г., заявка № 2012106961, приоритет изобретения от 27.02.2012 г. «Способ лечения больных с рефрактерным и рецидивным течением лимфомы Ходжкина»)
После предварительного введения гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (филграстим), проводимого за 24 часа до процедуры в целях выброса в периферический кровоток функционально-активных клеток, больному проводили процедуру лейкоцитафереза с использованием сепаратора крови MCS «Haemonetics» (США). Полученную лейкомассу делили на 2 порции, собирали в стерильные пластикатные контейнеры «Гемакон» и инкубировали в течение 24 часов при температуре 370С: первую порцию с рекомбинантным интерлейкином-2 (Ронколейкин, БИОТЕХ, Россия) в дозе 5 тыс. МЕ/мл, вторую порции с интерфероном--2b (Лайфферон, Вектор-Медика, Россия) в дозе 10 тыс. МЕ/мл, реинфузию лейкомассы проводили внутривенно капельно за одни сутки до проведения курса полихимиотерапии. По завершении курса химиотерапии процедуру повторяли в той же последовательности. Иммунотерапия проводилась во 2,4 циклы ПХТ II линии первично-резистентной формы и раннего рецидива лимфомы Ходжкина. Схема DHAP – 2 линия полихимиотерапии, используемая в обеих группах: Дексаметазон 40 мг внутрь или внутривенно с 1-го по 4-й дни; Цисплатин 100 мг/м2 внутривенно в 1-й день; Цитарабин 2000 мг/м2 внутривенно в течение 3 часов каждые 12 часов во 2-й день. Интервал между курсами 28-35 дней. Дозы цитостатиков в каждом отдельном случае рассчитывали по номограмме соотношения роста, массы и поверхности тела. Оценка результатов лечения. Объективный лечебный эффект оценивался у больных основной и контрольной групп после 6-ти курсов химиотерапии с помощью физикального обследования, ультрасонографического и рентгенологического исследований согласно критериям, рекомендованным ВОЗ (Женева, 1979): -полная ремиссия (полное исчезновение всех клинических и лабораторных проявлений опухолевого заболевания на срок не менее 4-х недель); -частичная ремиссия (уменьшение всех измеряемых опухолей не менее чем на 50% на срок не менее 4-х недель); -стабилизация (уменьшение опухолевых очагов менее чем на 50% при отсутствии новых поражений или увеличении опухолевых очагов не более чем на 25%); -прогрессирование (увеличение размеров опухолей на 25% и более и/или появление новых очагов поражения).
Исследование и оценку состояния периферической крови у больных ЛХ проводили по данным общего анализа крови общепринятыми методами (Кост Е. А., 1975), включающими определение следующих параметров: концентрация гемоглобина, скорость оседания эритроцитов, количество клеточных элементов (лейкоцитов и эритроцитов) в единице объема крови, количество тромбоцитов, количество ретикулоцитов, лейкоцитарная формула. Исследование клинических анализов крови проводили до начала лечения и в динамике лекарственной терапии. Динамику В-симптомов общей интоксикации оценивали по наличию или отсутствию данных симптомов в процессе проведения химиотерапии.
Анализ вида и степени токсичности и побочных проявлений проводился согласно шкале токсичности, рекомендованной ВОЗ (Переводчикова Н. И, 2015). С целью оценки ближайших результатов лечения нами изучены двухлетняя скорректированная общая overall survival OS (от начала лечения до летального исхода от любой причины) и бессобытийная выживаемость event-free survival EFS (от начала лечения до любого события – рецидив, прогрессия, летальный исход) больных лимфомой Ходжкина с резистентными к терапии формами заболевания и ранними рецидивами, вычисленная динамическим (актуриальным) методом (Kaplan E.L., Maier P., 1958).
Характеристика методов исследования Оценка иммунного статуса больных. В периферической крови больных методом проточной цитофлюорометрии на аппарате BD FACSCanto определяли следующие показатели: общее и относительное количество лимфоцитов и их субпопуляций (CD3, CD 19/20, CD4, CD8, CD 16/56, HLA-DR) и ДНК - цитометрические показатели крови. Для оценки апоптоза/некроза применялся аннексиновый тест. Все показатели клеточного иммунитета рассчитывали в относительном (процентном) и абсолютном исчислении.
Оценку иммунного статуса проводили всем больным до начала терапии и на этапах лечения – после 2 и 4 курсов ПХТ. Обследовали больных основной группы (получавших полихимиотерапию II линии в сочетании с экстракорпоральной иммунотерапией) и больных группы контроля (получавших только полихимиотерапию II линии). Изучение морфологической картины твердотельных фаций сыворотки крови. Оценка структуры сыворотки крови выполнена методами клиновидной и краевой дегидратации (Шабалин В.Н., Шатохина С.Н., 2001). Микроскопирование производилось в световом и поляризационном режимах на микроскопе leicaDMLS2.
Изучение структуры интегральных реакций организма. Идентификация адаптационных реакций проводилась по методу Л.Х. Гаркави с соавт. (1975, 2002) с расчетом коэффициента соотношения антистрессорных реакций и стресса (Шихлярова А.И., Максимов Г.К., 2006 г.). Методики статистического исследования. Статистическая обработка клинических и лабораторных данных проводилась согласно общепринятым методикам с помощью параметрических (по критерию Стьюдента) и непараметрических (по точному критерию Фишера; по парному критерию Вилкоксона-Пето, критерию Кокса, критерию Гехана-Вилкоксона) методов (Гублер Е.В., Генкин А.А., 1973; Федорова Э.Г., 1985) с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0 (Statsoft, USA). Различие считалось статистически значимым при вероятности безошибочного прогноза 95% (р0,05).
Осложнения лекарственной терапии .
Интенсивность клеточной пролиферации является важным параметром, характеризующим биологический потенциал клетки, а физиологическое состояние клеток и способность к осуществлению присущих им функций характеризуется, также и показателями кинетики клеточного цикла. Во время G1 стадии клеточного цикла в клетках происходит синтез РНК и белков, что обеспечивает поддержание диплоидности (содержание ДНК, соответствующее полному двойному набору хромосом, 2N). Далее происходит синтез ДНК. В этой фазе клеточного цикла клетка содержит ДНК в количестве, промежуточном между G1 и G2. S - фаза заканчивается удвоением содержания ДНК с образованием так называемого G2 -тетраплоида (содержание ДНК 4N). Во время стадии G2 происходит синтез белков и РНК. G2 - фаза заканчивается митозом (М). М-стадия по содержанию ДНК практически не отличается от G2-стадии. После завершения митоза, получившиеся две дочерние клетки вступают в новый клеточный цикл или переходят в стадию покоя G0. По содержанию ДНК эта стадия не отличается от G1. В целом, цикл репликации включает стадии G0/G1, S и G2+M. Для определения скорости и индекса пролиферации было изучено распределение лимфоцитов по фазам клеточного цикла. Индекс пролиферации (ИП) вычисляли как суммарное число клеток, находящихся в S- и (G2 + М) - фазах клеточного цикла.
При изучении кинетики клеточного цикла было установлено, что основная масса клеток при инкубации лейкомассы в различных режимах в присутствии ИФН - 2b и РИЛ-2 находилась в G0/1-фазе клеточного цикла, т.е. на стадии реализации присущих клетке функций и характеризовалась диплоидным типом распределения. Нами отмечено, что доля клеток в G0/1-фазе клеточного цикла в присутствии РИЛ-2 через 30 и 180 минут находилась на одинаковом уровне и увеличивалась в сравнении с исходными значениями. Через 24 часа данный показатель возвращался к исходным. Распределение клеток лейкомассы в G0/1-фазе клеточного цикла в присутствии ИФН - 2b при различных режимах инкубации продемонстрировало аналогичную закономерность (табл. 3.4).
Как видно из данных, приведенных в табл. 3.4, доля клеток в G2+M-фазе клеточного цикла при инкубации в присутствии и РИЛ-2 и ИФН -2b снижалась в сравнении с исходным фоном через 30 и 180 минут, а к 24 часам значения приближались к исходным, максимально при инкубации в присутствии РИЛ-2.
При сопоставлении темпа пролиферации лимфоцитов, определяемом по доле клеток в S-фазе клеточного цикла исходно и в различные периоды инкубации в присутствии РИЛ-2 и ИФН - 2b, не выявлено статистически достоверных различий, хотя получены однонаправленные изменения данного показателя. А именно, с увеличением времени инкубации от исходных значений до 24 часов отмечена тенденция к повышению доли клеток в S-фазе клеточного цикла в присутствии и РИЛ-2 и ИФН - 2b. При этом полученные значения при сравнении РИЛ-2 и ИФН - 2b не демонстрировали статистически значимых отличий. ИП лимфоцитов под влиянием инкубации лейкомассы в присутствии РИЛ-2 и ИФН - 2b менялся однонаправленно, хотя и не имел практически по всем значениям достоверных различий. Так, через 30 минут отмечено снижение индекса пролиферации в сравнении с исходными значениями и для инкубации в присутствии РИЛ-2 и ИФН - 2b. Через 180 минут отмечена тенденция к увеличению данного показателя. Максимальные значения индекса в сравнении с исходным фоном и другими периодами, хотя и достигшие статистически достоверных различий только по одному параметру, выявлены при инкубации в присутствии обоих препаратов в течение 24 часов.
Гистограмма распределения клеток по фазам клеточного цикла при инкубации лейкомассы в течение 180 минут в присутствии РИЛ-2 Гистограмма распределения клеток по фазам клеточного цикла при инкубации лейкомассы в течение 24 часов в присутствии РИЛ-2 Таким образом, проведенное нами экспериментальное исследование, направленное на определение оптимальных режимов инкубации лейкомассы в присутствии РИЛ-2 и ИФН - 2b, показало, что наиболее значимые изменения исследованных показателей выявлены при времени инкубации в течение 24 часов в присутствии РИЛ-2, что проявлялось в достоверно значимом увеличении в сравнении с исходным фоном относительного содержания в 1,1 раза CD3+ Т-лимфоцитов, в 1,2 раза CD3+CD4+ Т лимфоцитов, в 1,3 раза доли активированных цитотоксических CD3+CD8+HLA-DR лимфоцитов (p0,05). При инкубации в течение 24 часов в присутствии ИФН - 2b также выявлены наиболее значимые изменения, проявляющиеся тенденцией к повышению значений относительного содержания CD3+CD4+ Т-лимфоцитов, CD19+ В-лимфоцитов и активированных CD3+HLA-DR Т-лимфоцитов и достоверно более высокими значениями активированных цитотоксических CD3+CD8+HLA-DR лимфоцитов (p0,05).
Также отмечено снижение доли лимфоцитов в ранней стадии апоптоза, который определяет баланс субпопуляций нормального функционирования иммунокомпетентных клеток на фоне тенденции к повышению темпа и индекса пролиферативной активности лимфоцитов при наиболее длительном из исследованных периодов инкубации в присутствии РИЛ-2 и ИФН - 2b
Изучение морфоструктуры сыворотки крови у больных рецидивной и рефрактерной лимфомой Ходжкина на этапах лечения
Неудовлетворительные результаты терапии больных с рецидивами и резистентными формами лимфопролиферативных заболеваний, в частности, лимфомы Ходжкина, определяют необходимость поиска путей оптимизации и повышения эффективности лечения (Имянитов Е.Н., 2007, Птушкин В.В. и соавт., 2007, Демина Е.А., 2014). Модуляции сниженной активности клеток иммунной системы с помощью иммунотропных препаратов позволяет достичь не только прямого лимфоцитотропного эффекта (Златник Е.Ю., Голотина Л.Ю., 2005), но и оказывают опосредованное воздействие за счет модуляции продукции каскада цитокинов, что расширяет спектр противоопухолевого воздействия, приобретающего интегральный системный характер.
Оценка неспецифической составляющей иммунотерапии играет весьма значимую роль, так как раскрывает реакцию организма как целого, включающую помимо иммунных и нейроэндокринные механизмы поддержки и регуляции неспецифической резистентности организма. Открытие закономерности развития различных типов ответных общих неспецифических адаптационных реакций (ОНАР) при действии слабых, промежуточных (средних) и сильных раздражителей легло в основу теории адаптационной деятельности организма (Гаркави Л.Х., Уколова М.А., Квакина Е.Б., 1975; Гаркави Л.Х., Квакина Е.Б., Кузьменко Т.С., Шихлярова А.И., 2002).
Каждая из этих интегральных реакций представляет собой симптомокомплекс изменений, охватывающих все иерархические уровни организма, начиная с управляющих систем головного мозга, эндокринной, иммунной, вплоть до эффекторных механизмов на уровне молекулярно-клеточных структур. Характер таких изменений при развитии стресса определяется как патологический, ведущий к снижению неспецифической резистентности организма. Развитие антистрессорных реакций тренировки, спокойной и повышенной активации сопровождается физиологическим усилением функциональных систем в отношении энергетического, перекисного, иммунного гомеостаза, повышением адаптивного потенциала и, в целом, неспецифической и противоопухолевой резистентности (Гаркави Л.Х. и др., 2002,). На практике тестирование ОНАР не требует определения всего объема системных мультипараметрических изменений и основано на изучении динамики сигнальных критериев, а именно соотношения клеточных элементов формулы крови: эозинофилов, нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов. Основным «параметром порядка» определения ОНАР являются лимфоциты, а эозинофилы и моноциты указывают на степень напряжения, неполноценности, дисгармоничности в отношениях иммунной, эндокринной систем, тканевого гомеостаза и так далее. Таким образом, состав клеточных элементов крови служит источником важной информации о характере ОНАР в каждом индивидуальном случае.
Не менее информативным представляется изучение морфологии неклеточной жидкости крови, т.к. сыворотка достоверно отражает патофизиологический статус организма (Шабалин В.Н., Шатохина С.Н., 2001). Созданное авторами новое научное направление функциональной морфологии биологических жидкостей определило дифференциальный подход в отношении диагностики состояния организма по структурным признакам самоорганизации жидкости при переходе в твердотельное состояние. Эта диагностическая информация дополняет сведения об интегральной реакции организма.
Такой подход представляет фундаментальную основу, технологии и инструменты для продвижения эффективных способов терапии онкозаболеваний, персонализации и объективизации клинического анализа с учетом использования новых факторов в традиционной химиотерапии опухолевой болезни.
Целью исследования явилось изучение структуры ОНАР и морфологии сыворотки крови у больных с рецидивами и рефрактерным течением лимфомы Ходжкина на этапах полихимиотерапии в сочетании с рекомбинантным интерлейкином-2 и интерфероном-2b.
Исследование структуры ОНАР на этапах лечения (после 2 и 4 курсов ПХТ) осуществлялось методом Гаркави по интегральному составу клеточных элементов формулы крови и сигнальному критерию лимфоцитов, подсчитанных на 200 клеток в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимзе.
У каждого пациента проводили идентификацию типов ОНАР, включающих патологические – стресс в острой и хронической форме (Со, Сх) и физиологические типы – тренировку (Т), спонтанную и повышенную активацию (СА, ПА), а также переактивацию (ПеА). В полученном массиве данных определяли общегрупповые кластеры одноименных ОНАР и их относительный объем, формируя общегрупповую структуру ОНАР на каждом этапе исследования. Для определения доминирующих ОНАР, как неспецифической основы эффективности лечения, использовали расчетный коэффициент соотношения сумм антистрессорных и стрессорных реакций – К АС/С (Максимов Г.К., Шихлярова А.И., 2006), позволяющий объективно оценить влияние иммуномодулирующего фактора полихимиотерапии.
Для анализа системной организации фаций сыворотки кровь забирали путем венепункции в центрифужную пробирку в объеме 1,0-1,5 см3, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 минут. После отделения сыворотки от форменных элементов ее раскапывали 15-20 мкл микропипеткой-дозатором на предметное стекло с лецитиновой подложкой. Препараты высушивали при температуре 20-25 градусов по Цельсию и относительной влажности не более 70% в условиях отсутствия потоков воздуха в течение 20-24 часов. Микроскопирование осуществляли в проходящем свете, а также используя темновой и поляризационный оптические режимы микроскопа «Leica DM LS2» с компьютерным программным обеспечением «Морфотест». Для характеристики системной организации сыворотки крови изучали частоту встречаемости разных типов фаций, к которым относят радиальный (Р), частично-радиальный (чР), иррадиальный (И), циркулярный (Ц) и двойную фацию (Д).