Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Экспрессия раково-тестикулярных генов в опухолях 10
1.2. Характеристики иммуногенных РТА 14
1.3. Экспрессия РТА и РТГ при злокачественных новообразованиях 20
1.3.1. Экспрессия РТА и РТГ при колоректальном раке 20
1.3.2. Экспрессия РТА и РТГ при меланоме 22
1.3.3. Экспрессия РТА и РТГ при немелкоклеточном раке легкого 24
1.3.4. Экспрессия РТА и РТГ при раке молочной железы 26
1.3.5. Экспрессия РТА и РТГ при раке предстательной железы 27
1.3.6. Экспрессия РТА и РТГ при раке мочевого пузыря 27
1.3.7. Экспрессия РТА и РТГ при раке пищевода 28
1.3.8. Экспрессия РТА и РТГ при раке яичника 28
1.3.9. Экспрессия РТА и РТГ при синовиальной саркоме 28
1.3.10. Экспрессия РТА и РТГ при глиоме 29
1.3.11. Экспрессия РТА и РТГ при гематологических заболеваниях 29
Глава 2. Материалы и методы исследования 32
2.1. Материалы и методы 32
2.2. Оборудование 33
2.3. Клинические методы 34
2.4. Выделение нуклеиновой кислоты 44
2.5. Олигонуклеотидные праймеры 45
2.6. Реакция обратной транскрипции 47
2.7. Полимеразная цепная реакция 47
2.8. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле 48
2.9. Определение нуклеотидной последовательности 49
2.10. Статистическая обработка результатов 51
Глава 3. Результаты исследований 52
3.1. Экспрессия мРНК раково-тестикулярных генов в периферичес кой крови и опухолевых очагах больных колоректальным раком 52
3.1.1. Частота встречаемости мРНК раково-тестикулярных антигенов. 52
3.1.2. Частота встречаемоти мРНК раково-тестикулярных генов на разных стадиях заболевания 57
3.1.3. Частота обнаружения мРНК раково-тестикулярных генов при опухолях разной степени дифференцировки 66
3.1.4. Частота встречаемости мРНК раково-тестикулярных генов при опухолях разных размеров 76
3.2. Матричная РНК раково-тестикулярных генов при различной локализации опухоли 80
Глава 4. Обсуждение результатов исследований 84
Выводы 90
Список литературы
- Экспрессия РТА и РТГ при колоректальном раке
- Экспрессия РТА и РТГ при раке мочевого пузыря
- Полимеразная цепная реакция
- Частота встречаемоти мРНК раково-тестикулярных генов на разных стадиях заболевания
Экспрессия РТА и РТГ при колоректальном раке
Раково-тестикулярные антигены кодируемые Х-хромосомой образуют подгруппу РТ-Х антигенов [19; 141]. Среди обнаруженных 150 СТА только 4 имеют практическое значение для создания противоопухолевых вакцин – SSX, MAGE-A1, MAGE-A3 и NY-ESO-1. Эти СТА высоко иммуногены и индуцируют сильный гуморальный и клеточный иммунные ответы. В связи с этим их рассматривают как перспективные антигены для создания противоопухолевых вакцин [52; 82; 164]. Конечно, существуют другие типы антигенов, способных вызвать иммунологический ответ. Это тирозиназа, MelanA, Mart-1, gp100, кислая простатическая фосфатаза (РАР). CT45
Ген семейства СТ45 был впервые идентифицирован в 2005 году СТ45 является ядерным белком значительно похожим на СТ-Х антиген СТ14 и D-E-A-box содержащий протеин DDX26 [61]. В нормальной ткани экспрессия СТ45 ограничена сперматогониями и сперматоцитами. Многие человеческие опухоли вообще не экспрессируют СT45. В некоторых опухолях, таких как колоректальный рак, СТ45 экспрессируется на очень низком уровне (10 % случаев). В большом количестве случаев СТ45 экспрессирован в сименоме, лимфоме Ходжкина, раке яичника и множественной миеломе [43; 62; 63;100; 156]. Подобно другим раково-тестикулярные антигены СТ45 эпигенетически контролируется путем метилирования. СТ45 является дискримиционным маркером при разделении лимфомы Ходжкина от лимфопатии. Более высокая экспрессия СТ45 ассоциирована с более агрессивным гистологическим подтипом и плохим прогнозом [43; 67].
Таким образом, СТ45 является потенциальным прогностическим маркером для определенных типов опухолей [43; 67]. Его экспрессия ассоциирована с прогрессией заболевания и плохим прогнозом. Предполагают, что СТ45 может поддерживать в опухолевых клетках злокачественность и агрессивность [122], также как это было показано для других раково-тестикулярных антигенов. Например, при снижении регуляции членов семейства MAGE наблюдается изменение пролиферативной активности клеток и подвижности. A. Koop и соавторы [122] показали, что после снижения регуляции СТ45 изменяется морфология клеток, адгезивная способность и миграционно-инвазивный потенциал. Это первое наблюдение о функции СТ45. Изменение миграционной и инвазивной способности клеток может каким-то образом объяснить плохой прогноз опухоли при наличии раково-тестикулярных антигенов. MAGE-A1 (Melanoma antigen family A1)
Семейство генов MAGE-A1 состоит из 12 генов, локализованных в хромосоме Х. Белок MEGE-A1 экспресирован в норме на сперматогониях и первичных сперметазоидах, в плаценте и отсутствует в соматических тканях взрослого организма. MAGE-A1 представлен на многих типах опухолей, включая раки и лейкозы.
Гиперметиляция ДНК ассоциирована с регуляцией гена в некоторых типах опухолей. Демитиллирующий агент 5-Aza-2 -deoxycytidine (DAC) способен индуцировать экспрессию MAGE-1 в негативных меланомных клеточных линиях. DAC, однако, не индуцирует экспрессию MAGE-1 в нормальных диплоидных клетках [184; 188; 189; 190; 194]. DAC повышает экспрессию MAGE-1 в клеточных линиях, полученных из колоректального рака [57; 87; 103; 131; 135].
Ген MAGE-A1 чаще экспрессирован в метастазах, чем в первичной опухоли. Например, в метастазах меланомы он встречается в 48% случаев, а в первичной опухоли – в 16 % [53; 54; 69]. Эти гены экспрессированы при гематологических заболеваниях.
Несмотря на интенсивное изучение иммунного ответа на вакцины, основанные на пептидах MAGE, иммунный ответ был определен только у нескольких больных [107; 108; 109; 183; 205]. Убедительно доказано, что вакцинотерапия индуцирует CD4+ и CD8+ Т-клеточный иммунный ответ [116; 144; 154; 181; 186]. MAGE-A3 (Melanoma antigen family A3) MAGEA3 – это ген является членом семейства MAGE генов. Гены этого семейства кодируют белки с 50 – 80 % идентичных последовательностей. Промоторы и первые экзоны генов MAGE показывают вариабельность. Гены кластрированы в хромосомах в позиции Xq28. NEG-A3 является опухоль-специфическим антигеном и экспрессирован на некоторых типах опухолей, включая НМКРЛ.
MAGE- A4 (Melanoma antigen family A4) MAGE-A4 был экспрессирован в большей части эпителиальных кожных опухолей, особенно у больных, подвергшихся трансплантации органов и иммуносупрессивной терапии. Моноклональные антитела 57В могут быть использованы для иммуногистохимической окраски MAGE-A4 с использованием фиксированных в формалине срезов [137].
Ген MAGEB3 является членом субсемейства генов MAGE. СТА этого семейства экспрессированы на различных типах опухолей. MAGEB3 на меланомных клетках распознается цитотоксическими Т-лимфоцитами. Ген локализован в Х-хромосоме. Члены семейства MAGE находятся в зоне Xq28, а BAGEB3 – Xp21.
MAGE-C1 является частью большого семейства антигенов MAGE (Melanoma Antigen Genes), которое состоит из более чем 50 генов (MAGE-A до MAGE-L). Преимущественным признаком этого семейства является гомологичный домен MHD, большой центральный район общий для всех членов этого семейства. MAGE-C1 в три раза больший, чем другие члены этого семейства. Функция белка не известна.
Экспрессия РТА и РТГ при раке мочевого пузыря
При постановке обратной транскрипции в микропробирку объёмом 0,5 мл вносили 4,5 мкл РНК и 1 мкл 10 nM раствора обратных праймеров следующего состава: MAGE-R1, NY-R1, GP-R1, CT7-R1, SSX4-5R1 и X-R1. Первичную смесь перемешивали, покрывали каплей минерального масла (ICN Biomedicals, США), денатурировали РНК при 70С в течение одной минуты в амплификаторе «Терцик МС-2» («ДНК-Технология», Россия) и охлаждали до комнатной температуре. Затем под масло вносили 5 мкл реакционной смеси, содержащей 2 мкл пятикратного (5) M-MuLV буфера содержащего 100 мМ Трис-HCl (рН 8,3), 30 мМ MgCl2, 750 мМ КCl, 10 мМ DTT (Fermentas, Латвия), 0,5 мкл 8 мМ раствора дезоксинуклеозидтрифосфатов (НПФ «Литех», Россия), 0,2 мкл M-MuLV обратной транскриптазы (Fermentas, Латвия; 200 единиц активности в мкл) и 2,3 мкл деионизованной воды. Смесь перемешивали, выдерживали в амплификаторе «Терцик» или «Терцик МС-2» («ДНК-Технология», Россия) при 42С в течение 30 минут для синтеза кДНК. Проводили инактивацию фермента при 94С в течение 5 минут. В качестве положительного контроля использовался образец, давший позитивный результат в предшествующих реакциях.
ПЦР проводили в два раунда, с использованием разных наборов праймеров, специфичных для мРНК каждого из тестированных генов. В микроцентрифужную пробирку объёмом 0,5 мл вносили 2,5 мкл десятикратного (10) буферного раствора для Taq-полимеразы (50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl (pH 8,3), 2 мМ MgCl2, 1% Triton X-100.), 2,0 мкл 8 мМ раствора дезоксинуклеозидтрифосфатов (НПФ «Литех», Россия), 2,5 мкл смеси прямых и обратных праймеров следующего состава: MMRP1 и MAGE-47 R1; NY-R1 и NY-F1; GP-R1, P-F1 и G-F1; CT7-R1 и CT7-F1; X-R1 и X-F1; SSX4-5R1 и SSX1-2F1, 0,5 мкл раствора Taq-полимеразы (НПФ «Литех», Россия) в буфере для хранения (5 единиц активности в мкл), 15,5 мкл деионизованной воды и 2 мкл кДНК, полученной в результате проведения реакции обратной транскрипции. Реакционную смесь перемешивали, центрифугировали на вортекс-центрифуге “СМ 70 М-07 Sky Line” (ELMI, Латвия) и покрывали 1-2 каплями минерального масла (ICN Biomedicals, США).
Затем проводили 35 циклов амплификации по следующей программе: 94С – 30 , 55С – 30 , 72С – 30 .
Второй раунд гнездовой ПЦР проводили раздельно для каждой из мРНК раково-тестикулярных генов. В реакционную смесь вносили 2,5 мкл десятикратного (10) буферного раствора для Taq-полимеразы, 2,0 мкл 8 мМ раствора дезоксинуклеозидтрифосфатов (НПФ «Литех», Россия), 1 мкл смеси прямых и обратных праймеров, индивидуальных для каждого гена, 0,5 мкл раствора Taq-полимеразы, 17 мкл деионизованной воды и 2 мкл смеси, полученной при проведении первого раунда ПЦР. Перемешивали с помощью вортекса “REAX top” (Heidolph, Германия), центрифугировали и покрывали 1-2 каплями минерального масла. Затем проводили 30 циклов амплификации по следующей программе: 94С – 30 , 60С – 30 , 72С – 30 . Использовали амплификатор Терцик-2 («ДНК-Технология», Россия).
Регистрацию результатов реакции проводили с помощью гель-электрофореза в 2 %-ной агарозе, содержащем бромид этидия. Рабочий раствор трис-ацетатного электродного буфера (ТАЕ) готовили, смешивая 1 объем 50Х концентрата ТАЕ и 49 объемов дистиллированной воды. В состав пятидесятикратного концентрата (50Х) ТАЕ входило 24,2 г трис-48 (гидроксиметил) аминометана, 5,7 мл ледяной уксусной кислоты, 10 мл 0,5М раствора ЭDTA, рН 8,0. Раствор агарозы (2%) готовили с использованием рабочего раствора ТАЕ с добавлением бромида этидия. Буферный раствор для нанесения проб содержал 5-10% глицерина, 7% сахароза или 2,5% фикола, 0,025% бромфенолового синего.
Агарозный гель нагревали, до полного растворения, периодически помешивая. Остудив примерно до 50С, заливали в форму камеры для электрофореза, вставляли гребенку для образования лунок и давали агарозе застыть до образования геля. После извлекали гребенку из агарозы, переносили гель в камеру для электрофореза и располагали лунками к отрицательному электроду. В камеру заливали ТАЕ, покрывая гель раствором на 5-10 мм. Из-под слоя масла отбирали 10 мкл раствора амплифицированной НК, смешивали ее с 1 мкл 10Х буфера для нанесения образцов и вносили в лунки геля. Камеру подключали к источнику тока, соблюдая полярность, и проводили электрофорез в течение 30 минут при напряжении 200 V. ДНК визуализировали при длине волны 254 нм и документировали с использованием системы обработки изображений «ViTran» («Биоком», Москва).
Полимеразная цепная реакция
Таким образом, мы определяли мРНА 20 наименований РТА в образцах опухоли и периферической крови 98 пациентов, больных колоректальным раком. Среди них мРНК шесть наименований генов семейства MAGEA – MAGE-A1, MAGE-A2 MAGE-A3 MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6 -определяемых одновременно с помощью метода, позволяющего выявлять общую для всех шести генов нуклеотидную последовательность мРНК; мРНК восьми генов семейства GAGE (GAGE1-8), также одновременно определяемых по общей для всех нуклеотидной последовательности, мРНК трех генов семейства SSX (SSX1, SSX2, SSX4), мРНК генов XAGE1, NY-ESO1 и мРНК гена MAGEC1. SSX1,2,4 гена.
Экспрессия мРНК 20 раково-тестикулярных генов была гетерогенной в образцах опухоли и периферической крови пациентов, больных колоректальным раком. Суммарная частота обнаружения мРНК раково-тестикулярных генов GAGE1-8, NY-ESO1, SSX1, 2, 4, MAGEC1, XAGE1а и b, MAGEA1-6 в образцах опухоли составила 86 %. В периферической крови тех же больных до проведения операции суммарная частота обнаружения исследуемых мРНК составила 80%. После проведения операции количество положительных образцов периферической крови у тех же пациентов возросло до 90%.
До операции в периферической крови пациентов, больных колоректальным раком преимущественно выявлялась мРНК одного из исследуемых генов и ни разу не было выявлено 6-7 мРНК раково-тестикулярных генов одновременно. В периферической крови пациентов после операции преимущественно детектировалось 2-4, а в некоторых образцах 6-7 видов мРНК раково-тестикулярных генов. Начиная со второй стадии заболевания, суммарная частота обнаружения мРНК раково-тестикулярных генов в образцах опухоли была выше, чем в образцах опухоли первой стадии. Таким образом, частота обнаружения мРНК в опухоли возрастает со стадией колоректального рака.
В крови до операции и в образцах опухоли количество положительных проб было минимальным у пациентов, которые имели высокую степень дифференцировки опухоли, а у пациентов с низкодифференцированной аденокарциномой мРНК GAGE1-8, NY-ESO1, SSX1, 2, 4, MAGEC1, XAGE1, MAGEA1-6 генов выявлялась в 100 % образцов.
При высокодифференцированной аденокарциноме в крови пациентов до операции наиболее часто выявлялись мРНК MAGE-C1 и XAGE1. При умерено дифференцированной аденокарциноме мРНК MAGE-C1 и XAGE1 выявлялась реже.
Для мРНК генов MAGE-A1-6, GAGE1-8 и SSX1,2,4 в крови обнаруживалась обратная тенденция. В крови у пациентов с высокодифференцированной аденокарциномой мРНК MAGE-A1-6 и SSX1,2,4 выявлялась реже. Максимально часто мРНК этих генов выявлялись в периферической крови пациентов, больных колоректальным раком при низкодифференцированных опухолях, обладающих всеми характеристиками злокачественной опухоли в максимальной степени.
Следовательно, выявление мРНК раково-тестикулярных генов можно использовать в качестве мониторинговых тестов. Так наличие в крови пациента, больного колоректальным раком мРНК генов MAGE-C1 и XAGE1 может быть потенциальным маркером более благоприятного течения заболевания. В то же время мРНК MAGE-A1-6 и SSX1,2,4 генов могут свидетельствовать о неблагоприятном прогнозе.
При сравнении наборов мРНК раково-тестикулярных генов, встречающихся в образцах периферической крови и в опухолевых узлах пациентов, было обнаружено, что в периферической крови до операции выявляется меньшее количество определяемых мРНК раково-тестикулярных генов, чем в опухолевых узлах. В большинстве случаев в образцах опухоли выявлялось одновременно 7 и более видов мРНК раково-тестикулярных генов. В то же время, в периферической крови чаще всего обнаруживалось не более 3 мРНК раково-тестикулярных генов. Однако, после операции в периферической крови повышается количество одновременно детектируемых мРНК до 7 и более. Вероятно, повышение частоты выявления мРНК раково-тестикулярных генов является результатом проведения резекции опухолевого материала, в ходе которой и после которой в кровоток попадает дополнительное количество мРНК раково-тестикулярных генов.
Ранее Д.В.Новиковым с соавторами (2012) было показано, что наличие мРНК раково-тестикулярных генов в крови связано с циркуляцией в кровотоке опухолевых клеток, а также с присутствием в крови клеток, несущих на своей поверхности сорбированные молекулы РНК раково-тестикулярных генов. На последних этапах опухолевого процесса свой вклад в это явление вносят свободно циркулирующие в крови молекулы мРНК раково-тестикулярных генов. Выполнение резекции опухоли может приводить к тому, что часть опухолевых клеток, попадая в кровоток, вносят дополнительный вклад в присутствие в крови мРНК раково-тестикулярных генов. Кроме того, механическое повреждение ткани в ходе хирургической операции, видимо, является причиной увеличения и числа свободно циркулярующих молекул РНК, выходящих из поврежденных клеток.
Еще одной важной особенностью, обнаруженной в работе, явилось то, что наборы мРНК раково-тестикулярных генов, выявляемых в периферической крови и опухолевом очаге одного и того же пациента, могут различаться. Более того, некоторые наименования мРНК раково-тестикулярных генов преимущественно выявлялись в крови, другие в опухоли. Так, мРНК MAGE-C1 чаще выявлялась в периферической крови пациентов, чем в опухоли. Основываясь на этом наблюдении, можно заключить, что экспрессия гена MAGE-С1 более характерна для мигрирующих в кровь опухолевых клеток в сравнении с клетками, локализованными в опухолевых очагах. Ранее в целом ряде исследований была продемонстрирована присущая опухолям генетическая гетерогенность, при которой разными клетками одной и той же опухоли могут экспрессироваться разные гены и соответственно, транскриптом таких клеток может существенно различаться. Так, на примере рака молочной железы было показано, что 40-60 % первичных опухолей проявляют многовариантность мРНК в популяции опухолевых клеток [39; 53; 54]. Гетерогенность экспрессии показана также и для раково-тестикулярных генов. При этом активация раково-тестикулярных генов при злокачественном перерождении опухолевых клеток носит случайный характер и не всегда является необходимым условием для малигнизации опухоли. Очень часто исследованные опухоли экспрессировали несколько наименований мРНК раково-тестикулярных генов и набор экспрессирующихся генов значительно различался [88].
Частота встречаемоти мРНК раково-тестикулярных генов на разных стадиях заболевания
В связи с этим, чтобы обнаружить максимально количество опухолевых клеток, экспрессирующих раково-тестикулярные гены, необходимо определять в одном и том же образце большое количество разных наименований генов. Как показано в нашем исследовании, наибольшая частота выявления мРНК раково-тестикулярных генов регистрировалась при определении с помощью ОТ-ПЦР нескольких различных мРНК раково тестикулярных генов одновременно. За счет этого возростала вероятность обнаружения опухолей, клетки которых экспрессируют раково тестикулярные гены. Так, если индивидуальная частота выявления мРНК раково-тестикулярных генов в периферической крови до операции варьировала от 18% (GAGE1-8) до 33% (MAGEA1-6), то суммарная частота обнаружения всех 20 мРНК раково-тестикулярных генов составила 80%. Таким образом, за счет расширения спектра выявляемых мРНК удалось повысить частоту обнаружения опухолей с экспрессией раково тестикулярных генов, а значит чувствительность реакции по обнаружению мРНК раково-тестикулярных генов в биологических пробах.
В рамках настоящего исследования определяли частоты выявления мРНК раково-тестикулярных генов на разных стадиях колоректального рака, при разной его локализации, размере опухоли, степени дифференцировки. Показано, что более тяжелые формы заболевания, как правило, характеризовались наличием в крови и опухолевой ткани большего количества одновременно выявляемых мРНК раково-тестикулярных генов.
При локализации опухоли в ободочной кишке мРНК раково-тестикулярных генов чаще выявлялись в крови как до, так и после проведения резекции. У пациентов с ректосигмоидной локализацией опухоли до операции в образцах периферической крови суммарная частота выявления мРНК раково-тестикулярных генов была ниже, чем в образцах опухоли. При локализации опухоли в прямой кишке суммарная частота выявления мРНК раково-тестикулярных генов в образцах периферической крови как до, так и после проведения операции была ниже, чем в образцах опухолевых очагов.
Все исследуемые мРНК выявлялись, начиная с первой стадии заболевания и, как правило, чаще обнаруживались в опухолевых образцах. Чаще всего в клетках опухолевых очагов детектировались мРНК SSX1,2,4 и MAGE-A1-6 генов. Однако мРНК MAGE-C1 чаще выявилась в образцах крови, что вероятно связано с функциональной нагрузкой белкового продукта этого гена, характерной для выходящих в кровоток опухолевых клеток.
Опухоли с разной степенью дифференцировки также различались по частоте выявления мРНК раково-тестикулярных генов. При высокодифференцированной аденокарциноме в крови больных до операции мРНК MAGE-C1 и XAGE1 выявлялись вдвое чаще, чем при умеренно дифференцированной и низкодифференцированной аденокарциноме. Матричные РНК генов MAGE-A1-6 и SSX1,2,4, наоборот, в два-три раза чаще выявлялись в периферической крови при низкой степени дифференцировки в сравнении с пациентами с высокодифференцированной аденокарциномой. Таким образом, тест на наличие в крови пациентов мРНК генов MAGE-A1-6, MAGE-C1, XAGE1 и SSX1,2,4 может быть использован в качестве прогностического теста в мониторинге пациентов, больных колоректальным раком. Ранее другими авторами было показано, что наличие в опухолевых клетках мРНК MAGE-A3 и 6 ассоциировано с прогрессом развития меланомы [49]. Обнаружено, что мРНК генов NY-ESO и MAGE-A3 являются факторами неблагоприятного процесса при меланоме и ассоциированы с метастазами и запущенными формами заболевания. Присутствие мРНК MAGE-A3 также ассоциировано с неблагоприятным прогнозом при немелкоклеточном раке легкого [91; 195]. Показана связь экспрессии генов SSX с тяжестью опухолевого процесса. Наличие мРНК SSX в опухолях коррелирует с более поздними стадиями заболевания и худшим прогнозом для пациента. Чаще мРНК SSX выявляется при инвазивном фенотипе опухоли [176]. ВЫВОДЫ 1. Обнаружена гетерогенная экспрессия мРНК 20 раково-тестикулярных генов (РТГ) в образцах опухоли больных колоректальным раком. 2. мРНК раково-тестикулярных генов также определяется в периферической крови больных колоректальным раком. Частота экспрессии мРНК раково-тестикулярных генов в периферической крови увеличивается после оперативного удаления опухоли. 3. Частота обнаружения мРНК раково-тестикулярных генов в опухоли и периферической крови возрастает со стадией заболевания. 4. Частота экспрессии мРНК раково-тестикулярных генов в опухоли и периферической крови зависит от дифференцировки опухоли: при высокодифференцированной опухоли экспрессия минимальная, а при низкодифференцированной – максимальное. 5. мРНК генов MAGE-C1 и XAGE1 в периферической крови более часто определяется при высокодифференцированной аденокарциноме, а мРНК MAGE-A1-6 и SSX1,2,4 генов более чаще выявляются при низкодифференцированных аденокарциномах. 6. Частота обнаружения мРНК раково-тестикулярных генов в опухоли и периферической крови возрастает с размером опухоли.