Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
1.1. Сравнительная характеристика эстрогеновых рецепторов: строение, функциональная активность 10
1.2. Эстрогеновые рецепторы и их корреляция с клинико-морфологическими параметрами 13
1.3. Эстрогеновые рецепторы и их предиктивная роль в терапии больных раком молочной железы 14
1.4. Роль неоадъювантных клинических исследований в оценке чувствительности опухоли к системной терапии 19
1.5. Предиктивная и прогностическая роль динамического мониторинга биологических маркеров в оценке гормоночувствительности опухоли 21
1.6. Ki67 как маркер первичной и приобретенной резистентности 27
ГЛАВА 2 32
2.1. Материал исследования 32
2.2. Методы исследования
2.2.1. Морфологическое исследование опухолевой ткани молочной железы 45
2.2.2. Иммуногистохимическое исследование рецепторов 47
2.2.3. Определение уровня экспрессии ЭР и ЭР методом проточной цитофлоурометрии 51
2.2.4. Статистическая обработка полученных данных 54
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 56
3.1. Экспрессия ЭР и ЭР в ткани рака молочной железы и взаимосвязь их экспрессии с клиническими параметрами и морфологическими характеристиками опухоли 56
3.2. Оценка предикивной значимости экспрессии рецепторов стероидных гормонов в модели двухнедельного теста на гормоночувствительность 71
3.2.1.Динамика изменения индекса пролиферации Ki67 относительно исходного уровня в предоперационной тестовой модели по определению чувствительности опухоли к гормонотерапии 72
3.2.2. Динамика изменения индекса пролиферации Ki67 в группах различного биологического подтипа 82
3.2.3. Степень лечебного патоморфоза в предоперационной тестовой модели по определению чувствительности опухоли к гормонотерапии 86
3.2.4. Динамика изменения уровня экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона в процессе гормонотерапии
3.2.4.1 Динамика изменения уровней экспрессии ЭР и ЭР, определяемых методом ПЦФ 92
3.2.4.2 Динамика изменения уровней экспрессии ЭР и ПР, определяемых методом ИГХ 95
3.2.5. Прогностическая номограмма PEPI SCORE в группах люминального А и люминального В Her2-негативного подтипов предоперационной тестовой модели 103
3.3. Конкордантность количественных показателей экспрессии ЭР, полученных при количественной иммунофлуоресцентной оценке методом ПЦФ, с данными ИГХ исследования 106
Глава 4 110
Выводы 121
Практические рекомендации 122
Список сокращений 123
- Эстрогеновые рецепторы и их предиктивная роль в терапии больных раком молочной железы
- Предиктивная и прогностическая роль динамического мониторинга биологических маркеров в оценке гормоночувствительности опухоли
- Определение уровня экспрессии ЭР и ЭР методом проточной цитофлоурометрии
- Динамика изменения индекса пролиферации Ki67 в группах различного биологического подтипа
Введение к работе
Актуальность проблемы
Рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место среди всех злокачественных заболеваний у женщин. Прирост стандартизованного показателя заболеваемости РМЖ в России за последние 10 лет составил 19,94% (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2014). В динамике с 2009 по 2012 гг. абсолютное число умерших от РМЖ снизилось на 2,5% с 23517 до 22936. С одной стороны, это связано с ранней диагностикой, с другой - с улучшением качества лечения. Речь в первую очередь идет о системных методах лечения, ведущим среди которых является гормонотерапия.
Эстрогеновые рецепторы (ЭР) являются важнейшей клеточной мишенью, воздействуя на которую, можно подавлять рост опухолевых клеток. Эстрогены реализует свое биологическое действие путем присоединения к рецепторам эстрогенов ( и ). Долгие годы экспрессия опухолевыми клетками ЭР (изолированно, или в сочетании с рецепторами прогестерона (ПР)), определяемая иммуногистохимическим методом (ИГХ), использовалась как критерий для назначения гормонотерапии. В ткани РМЖ ЭРа выявляются у 70-80% больных, однако только у 40-80% пациенток гормонотерапия обеспечивает длительный контроль над заболеванием. В случае же распространенных стадий опухолевого процесса, первичная резистентность диагностируется в 50% случаев уже на первой линии гормонотерапии (Garcia-Becerra и соавт., 2013). Следовательно, требуются дополнительные предиктивные маркеры клинического ответа на гормонотерапию. С другой стороны, около 10% пациенток больных рецептор-негативным РМЖ отвечают на гормонотерапию (Osborne и соавт., 1998). Было высказано предположение, что ответ на гормонотерапию у данных пациенток может быть обусловлен технической ошибкой и ложноотрицательным ответом или возможным ЭР-независимым действием тамоксифена (Clarke и соавт., 2001).
Однако с открытием селективных эстрогеновых рецепторов было показано, что более 50% опухолей, ранее классифицируемых как рецептор-
негативные, экспрессируют ЭР (Murphy и соавт., 2003). Было высказано предположение, что именно изолированная экспрессия ЭР может обусловливать гормоночувствительность опухолей с условно отрицательным статусом ЭР.
В настоящее время не вызывает сомнения, что важнейшим моментом при оценке прогностической и предиктивной роли любого опухолевого маркёра является их количественная характеристика, а не констатация наличия в клетке. Это в полной мере относится и к ЭР.
Для определения уровня экспрессии ЭР традиционно применяется
полуколичественный метод ИГХ. Использование селективных моноклональных
антител позволяет с высокой точностью установить наличие ЭР в исследуемой
ткани. Однако, осуществляемая визуально оценка доли клеток, содержащих
рецепторы, а тем более интенсивности их экспрессии в клетке, является
полуколичественной. Безусловным шагом вперёд явился разработанный в
ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» МЗ РФ и запатентованный метод
иммунофлуоресцентного анализа с привлечением проточной
цитофлуориметрии (ПЦФ). Метод позволяет строго количественно оценивать уровень экспрессии разных типов ЭР, минимизируя субъективный фактор оценки.
Используемый в работе двухнедельный предоперационный тест на гормоночувствительность позволяет быстро и достоверно выявлять первичные гормон-резистентные опухоли, а также механизмы, обуславливающие гормоночувствительность.
Таким образом, представляется актуальным изучение уровня экспрессии ЭР и ЭР количественным методом и оценка предиктивной значимости этих рецепторов в предоперационной тестовой модели.
Цель исследования:
Количественно определить уровень экспрессии и коэкспрессии эстрогеновых рецепторов и в ткани рака молочной железы для оптимизации методов их оценки и уточнения предиктивной значимости при гормонотерапии
рака молочной железы в модели двухнедельного теста на
гормоночувствительность.
Задачи исследования:
-
Количественно охарактеризовать частоту и уровень экспрессии и коэкспрессии ЭР и ЭР в опухолевой ткани в популяции больных раком молочной железы.
-
Провести анализ корреляции уровней экспрессии ЭР и ЭР с клиническими параметрами и морфологическими характеристиками опухоли.
-
Оценить конкордантность показателей экспрессии ЭР, полученных при количественной иммунофлуоресцентной оценке с привлечением проточной цитофлуорметрии, с данными иммуногистохимического исследования.
-
Оценить предиктивную значимость экспрессии рецепторов стероидных гормонов и динамики их изменения в модели двухнедельной предоперационной гормонотерапии.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Иммунофлуоресцентный анализ, ассоциированный с проточной цитофлуориметрией, является высокоинформативным методом количественной молекулярной диагностики статуса рака молочной железы по экспрессии и коэкспрессии ЭР и ЭР.
-
Уровень экспрессии ЭР статистически значимо коррелирует с возрастом пациенток, уровнем Ki-67 и с гистологическим вариантом опухоли. Корреляции экспрессии ЭР с клинико-морфологическими параметрами заболевания не выявлено.
-
Методы ПЦФ и ИГХ в целом обладают удовлетворительной конкордатностью в определении статуса ЭР.
-
Показателями, с высокой степенью достоверности предсказывающими гормоночувствительность опухоли являются: высокая экспрессия ЭР по данным ПЦФ и ИГХ; исходно низкий уровень Ki67; низкая степень
злокачественности; повышение уровня экспрессии ЭР (ПЦФ) в процессе гормонотерапии; снижение интенсивности экспрессии ЭР (ИГХ) в процессе гормонотерапии. 5. ЭР, в отличие от ЭР, обладают наибольшей предиктивной значимостью в опухолевом ответе на предоперационную гормонотерапию.
Научная новизна
Впервые на статистически репрезентативном материале (113 биоптатов
опухолевой ткани больных РМЖ), используя новый иммунофлуоресцентный
метод с привлечением проточной цитофлуориметрии, проведена строго
количественная оценка частоты и уровня экспрессии эстрогеновых рецепторов
разных типов - и . Сформулированы рекомендации для проведения, наряду с
иммуногистохимическим исследованием, количественной,
дифференцированной иммуно флуоресцентной оценки статуса ЭР и ЭР методом ПЦФ.
Впервые показана конкордантность количественных показателей экспрессии ЭР, полученных при количественной иммунофлуоресцентной оценке, с данными ИГХ исследования.
Проведен анализ корреляции уровня экспрессии и коэкспрессии ЭР и ЭР с клиническими, морфологическими и биологическими характеристиками опухолевого процесса (возраст пациентов и стадия заболевания, гистологический вариант и степень злокачественности опухоли, уровень экспрессии Her-2 и Ki67 в опухоли).
Впервые в рамках двухнедельной предоперационной гормональной терапии показана высокая предиктивная значимость количественных показателей экспрессии ЭР, превышающая предиктивную значимость полуколичественной оценки ЭРа методом ИГХ.
На основании проведенного исследования обоснована необходимость рутинного проведения теста на гормоночувствительность в группах люминального А и люминального В Нег2-негативного подтипов с целью проведения персонифицированной адъювантной системной терапии.
Практическая и теоретическая значимость работы
Результаты проведенного исследования позволяют оптимизировать персонифицированный подход к гормонотерапии рака молочной железы.
Полученные данные доказывают необходимость дальнейшего
совершенствования методов оценки рецепторного статуса опухоли, сдвигая приоритеты в сторону строгой количественной оценки статуса рецепторов стероидных гормонов.
Использованная автором предоперационная тестовая модель для
определения гормоночувствительности опухоли, c привлечением проточной
цитофлуориметрии для количественной оценки рецепторного статуса больных
РМЖ, может быть рекомендована для определения исходной
гормоночувствительности рецептор-позитивных опухолей больных первично-операбельным РМЖ.
Внедрение результатов исследования
Результаты исследования внедрены в работу ФГБУ «РОНЦ
им. Н.Н.Блохина» Минздрава России, Государственного учреждения
здравоохранения «Областной клинический онкологический диспансер»
г.Ульяновска (ГУЗ ОКОД г. Ульяновск), в учебный процесс кафедры онкологии
и лучевой диагностики Государственного бюджетного образовательного
учреждения высшего профессионального образования «Ульяновский
государственный университет» Министерства образования и науки Российской Федерации.
Апробация работы
Апробация диссертационной работы состоялась 30 июня 2015 г. на
совместной научной конференции отделения опухолей молочных желез,
отделения диагностики опухолей, отделения опухолей женской
репродуктивной системы, отделения реконструктивной и сосудистой онкохирургии, отделения химиотерапии, отделения клинической фармакологии и химиотерапии, отделения химиотерапии и комбинированного лечения злокачественных опухолей НИИ КО ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина»;
отделения радиохирургии НИИ КиЭР ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина», а
также кафедры онкологии Государственного бюджетного образовательного
учреждения высшего профессионального образования «Московский
государственный медико-стоматологический университет
им. А.И.Евдокимова» Минздрава России. Предварительные результаты
исследования были представлены, доложены и обсуждены на конференции IMPACT Breast Cancer Conference (Брюссель, 7-9 мая 2015), 37th Annual SABCS (Сан-Антонио, 9-13 декабря 2014).
Личный вклад автора
Личный вклад автора состоит в непосредственном участии на всех этапах исследования: формулирование цели и задач иcследования, разработка плана и дизайна исследования, набор исследуемого материала (отбор пациентов раком молочной железы согласно критериям включения и невключения, выполнение core-биопсий, забор операционного материала), обработка результатов исследования и подготовка публикаций по материалам работы.
Публикации по теме диссертации
По результатам диссертационного исследования опубликованы 3 статьи в журналах, рекомендованных Перечнем ВАК РФ для опубликования результатов диссертаций на соискание учёной степени доктора и кандидата наук, и публикация в зарубежном издании.
Структура и объем диссертации
Эстрогеновые рецепторы и их предиктивная роль в терапии больных раком молочной железы
Рак молочной железы занимает первое место в структуре онкологической заболеваемости женского населения [14]. Этиология РМЖ до сих пор не известна, но многочисленные исследования показали, что именно эстрогены играют ведущую роль в возникновении этого заболевания, реализуя свое действие через лиганд-зависимые транскрипционные факторы, называемые эстрогеновыми рецепторами.
В 1962 году Jensen E. и Jacobsen H., обнаружив специфическое взаимодействие 17- эстрадиола с белками в ткани матки, пришли к заключению, что биологическое действие эстрогенов реализуется при участии рецепторного белка [67]. В дальнейшем этот белок изучался в различных лабораториях, и в 1986 году две исследовательские группы сделали заявление о том, что ЭР клонирован [54, 55]. До 1995 года считалось, что существует только один тип ЭР, и что именно он ответственен за реализацию всех физиологических и фармакологических эффектов естественных и синтетических эстрогенов и антиэстрогенов. Однако, в 1995 году был клонирован второй эстрогеновый рецептор из библиотеки к-ДНК простаты крысы [72]. Уже известный эстрогеновый рецептор был назван ЭР, а новый рецептор – ЭР. Этот тип рецепторов экспрессируется в опухолях разных локализаций [1], а в ткани первичного и метастатического рака легкого, в отличие от ЭР, является главной клеточной мишенью эстрогенов [2, 3, 19].
ЭР и ЭР принадлежат к суперсемейству стероидных ядерных рецепторов и имеют сходную структурную архитектуру [46, 50, 56, 68, 81, 117]. Ген ЭР находится в длинном плече хромосомы 6 (локус q24—27), тогда как ген ЭР расположен в локусе q21—22 хромосомы 14. Оба рецептора состоят из трех основных доменов, выполняющих специфические функции: N-концевой (А/B), ДНК-связывающий (C) и лиганд-связывающий домены (E) [89].
На N-концевом участке рецептора находится домен транскрипционной активаторной функции AF1 – участок рецептора, ответственный за белок-белковые взаимодействия и транскрипционную активацию гена-мишени независимо от связывания с лигандом [24, 69, 85]. Сравнительный анализ AF1 доменов эстрогеновых рецепторов в различных клеточных линиях показал, что в ЭР этот домен высоко эффективен в стимуляции репортерных генов различных эстроген-чувствительных элементов (ERE), в то время как подобная активность AF1 ЭР низкая [32]. ДНК связывающий домен (DBD), как следует из названия, отвечает за присоединение к специфическим последовательностям ДНК [107]. Гомологичность DBD ЭР и ЭР высокая и составляет около 96% [60].
Лиганд-связывающий домен (LBD) ответственен за связывание лиганда с рецептором, димеризацию рецептора, ядерную транслокацию и трансактивацию экспрессии генов-мишеней. Этот домен содержит участок с активационной функцией (AF-2), ответственный за конформационные изменения ЭР в присутствии лигандов и последующее связывание димеров ЭР с коактиваторами и корепрессорами [46, 50, 117].
Лиганд-связывающие LBD домены ЭР и ЭР обладают высокой гомологичностью и имеют сходную третичную структуру аминокислотной последовательности [50, 75]. Поэтому не удивительно, что ЭР и ЭР имеют сходную афинность к эстрогенам и антиэстрогенам [73].
Присоединение лиганда к ЭР через цепь последующих событий приводит к изменению уровня транскрипции эстроген-регуляторных генов. Эти события и порядок, в котором они происходят, до конца не понятны, но известно, что они включают в себя димеризацию рецептора, взаимодействие рецептора с ДНК, коактиваторами, корепрессорами или другими транскрипционными факторами, и формирование преинициаторного комплекса [22, 23, 68, 69, 70, 109]. Накапливаются данные о негеномных эффектах эстрогенов, которые происходят слишком быстро, чтобы быть обусловленными активацией синтеза РНК и белка. Негеномные эффекты являются общим свойством стероидных гормонов и часто связаны с активацией различных протеинкиназных каскадов [78]. Описанные негеномные эффекты 17 эстрадиола включают мобилизацию внутриклеточного кальция, стимулирование активности аденилатциклазы, и синтез цАМФ [21, 66, 102]. В культуре клеток РМЖ была отмечена способность 17-эстрадиола активировать МАРК и PI3K сигнальные пути [28, 86]. На сегодняшний день изучено 5 изоформ ЭР [88]. Ген ESR2, с которого происходит трансляция ЭР, имеет 8 экзонов. В процессе альтернативного сплайсинга мРНК последнего экзона образуются белковые продукты с различной функциональной активностью – изоформы ЭР1 – ЭР5. Все изоформы отличаются по длине С-концевых последовательностей, и имеют различную молекулярную массу. При этом ЭР1 является единственным полноразмерным белком, способным связываться с лигандом. Функциональные исследования показали, что гиперэкспрессия ЭР1имеет проапоптотический и антипролиферативные эффекты [76, 96]. Активность изоформ ЭР2 – ЭР5 изучена недостаточно. ЭР3 специфично экспрессируется преимущественно в ткани яичка [88], а ЭР4 в ткани молочной железы найден не был [100]. Несмотря на то, что ЭР2 и ЭР5 не связываются с лигандом, исследования транзиторной трансфекции показали, что ЭР2 и ЭР5 могут выступать как антагонисты ЭР, путем образования гетеродимеров [99, 121].
Имеются сообщения, что высокий уровень экспрессии ЭР2 ассоциирован с резистентностью к тамоксифену и более агрессивным течением РМЖ [61, 119]. Рассмотренные в следующих разделах данные касаются предиктивной роли в терапии больных РМЖ только полноразмерной изоформы эстрогеновых рецепторов. Для определения уровня экспрессии ЭР наиболее часто применяется полуколичественный метод иммуногистохимии [10]. Использование селективных моноклональных антител позволяет с высокой точностью установить наличие ЭР в исследуемой ткани. Однако, осуществляемая визуально оценка доли клеток, содержащих рецепторы, а тем более интенсивности их экспрессии в клетке, является субъективной и полуколичественной. В отдельных работах в качестве альтернативы иммуногистохимии для определения ЭР применяют метод полимеразной цепной реакции [17]. Но уровень мРНК, обнаруживаемый таким способом, не всегда соответствует уровню рецептора в клетке, так как на формирование белка из мРНК оказывают влияние различные трансляционные факторы, постсинтетическая модификация и белковая деградация. Недостаточно информативными являются радиолигандный метод и вестерн-блоттинг [5]. Первый сводится к определению уровня ЭР в неочищенном цитозоле гомогената клеток на основании связывания рецепторов и продуктов их деградации с лигандом, а второй – к детекции ЭР по связыванию со специфическими антителами в тотальной белковой фракции, полученной из анализируемых клеток.
Предиктивная и прогностическая роль динамического мониторинга биологических маркеров в оценке гормоночувствительности опухоли
Пересмотр КІ67 с использованием методики " ImmunoRatio" позволил выявить расхождение уровня экспрессии боле, чем на 5% в 31/50 (62%) случаях. Клинически значимое расхождение было зарегистрировано в 3/17 (18%) случаев в I группе и 3/15 (20%) наблюдений II группы. Данные опухоли были переклассифицированы из люминального А в люминальный В подтип, однако с учетом того, что пересмотр был произведен спустя 6 мес. после хирургического лечения, на терапевтическую тактику полученные результаты не повлияли. В анализ результатов исследования принимаются результаты КІ67, полученные с использованием автоматической методики подсчёта с помощью программы “ImmunoRatio”.
После получения одноклеточных суспензий из опухолевых образцов, фиксированных в 4% растворе формальдегида, и пермеабилизации клеток в течение 20 мин. в 0,1% растворе Triton Х-100 (" Sigma-Aldrich", США), клетки инкубировали в течение ночи (около 15 час.) с первичными моноклональными антителами к ЭР (клон SP1, "Abeam", Великобритания) и затем – в течение 1,5 час с вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентным красителем DyLight 650 (Великобритания). В качестве контроля использовали клетки после инкубации в течение 1,5 час. только с вторичными антителами. Для удаления из анализа дебриса и эритроцитов клетки инкубировали в течение 15 мин со специфическим красителем ДНК Hoechst 33258 ("Sigma-Aldrich", США) в концентрации 1,2 мкг/мл. В анализ включали только клетки с окрашенными ядрами, исключая клеточные конгломераты, которые выводились из анализа путём дополнительного гейтирования.
Измерение флуоресценции проводили на проточном цитофлуориметре FACSCanto II ("Becton Dickinson", США) с применением программного обеспечения FACSDiva 6.0. Регистрацию сигнала флуоресценции красителей DyLight 650 и Hoechst 33258 проводили по параметру APC-A и Pacific Blue соответственно. Значение порога по параметру FSC-A составляло 12,5 тыс., показатель "количество событий/сек" – средний, число анализируемых событий – 5000. Интенсивность флуоресценции клеток рассчитывали с помощью программы WinMDI 2.9, количество специфически флуоресцирующих клеток – с помощью теста Колмогорова-Смирнова, включённого в программу FlowJo 7.6 ("TreeStar", США). Для контроля активности антител (рефересный положительный контроль) при исследовании каждого образца опухоли использовали клетки монослойной культуры рака молочной железы человека линии MCF7.
В работе определены следующие показатели экспрессии ЭР. Уровень экспрессии – количество клеток (%), специфическая флуоресценция которых после инкубации с моноклональными антителами к ЭР превышает показатель контроля (вторичные антитела). Интенсивность экспрессии (усл.ед.) – отношение средней интенсивности клеток после инкубации с моноклональными антителами к флуоресценции клеток после инкубации только с вторичными антителами. Схематически алгоритм иммунофлуоресцентного анализа статуса ЭР с привлечением проточной цитофлуориметрии представлен на рис. 10.
Высокая - Высокая Параметры экспрессии ЭР оцениваются с помощью статистического кр итерия Колмогорова-Смирнова, встроенного в программу FlowJo
Определение экспрессии ЭР проводилось по аналогичной методике, с использованием следующих антител: мышиные моноклональные антитела IgG клона 14C8 (ab288, Abcam, Великобритания), вторичные – антитела, конъюгированные с флуоресцентным красителем DyLight 650 (ab98729, "Abcam", Великобритания).
Для признаков с распределением, значимо отличающимся от нормального, рассчитывали медиану, квартили и применяли непараметрические методы сравнения несвязанных признаков (Kruskal-Wallis Anova & Median test при количестве сравниваемых групп более двух и Mann-Whitney при сопоставлении двух групп). Для связанных значений применяли критерий Wilcoxon matched pairs test.
При сравнении частот строили таблицы сопряженности признаков. Для расчета р использовали точный критерий Фишера (при небольших объемах групп) и непараметрический критерий у\-2. Для частот, характеризующих чувствительность и специфичность, рассчитывали 95% доверительные интервалы. Различия считали статистически значимыми при р 0,05. Проводили корреляционный анализ Pearson (Spearman для непараметрических данных) с расчетом коэффициента корреляции и уровня его значимости.
Рассчитывали коэффициент конкордации для параметров, оцененных различными методами. При выборе статистических процедур учитывались методологические требования Международного конгресса по гармонизации GGP “Статистические принципы для клинических исследований” [65]. Все вычисления проводили на персональном компьютере с помощью математических пакетов «STATISTICA» и SPSS в отделе информационных технологий ФГБНУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина». ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Экспрессия ЭР и ЭР в ткани рака молочной железы и взаимосвязь их экспрессии с клиническими параметрами и морфологическими характеристиками опухоли Для оценки взаимосвязи экспрессии и ко-экспрессии ЭР и ЭР с клинико-морфологическими характеристиками использовались: 3. данные анализа биоптатов операционного материала и клинические данные пациенток I группы (без предоперационного курса гормонотерапии) (n=67); 4. данные анализа нативного материала core-биопсий и клинические данные пациенток II группы (с предоперационным курсом гормонотерапии) (n=46). Экспрессия ЭР и ЭР была изучена у 102 имеющихся из 113 опухолевых образцов данных групп. Экспрессия ЭР была выявлена в 78 (76,5%) опухолевых образцах. Практически у каждой четвертой пациентки (23,5%) экспрессия ЭР отсутствовала (табл. 9).
Определение уровня экспрессии ЭР и ЭР методом проточной цитофлоурометрии
В обоих случаях увеличения КІ67 в группах люминального А и люминального В Нег2-негативного подтипов (отмечены на рис. 37 и 38 красным), экспрессия ЭР, определяемая методом ПЦФ, отсутствовала.
В группах трижды-негативного подтипа, Нег2-позитивного подтипа и в группе люминального В Нег2-позитивного подтипа, несмотря на высокие уровни экспрессии ЭР и ПР, клинически значимого снижения КІ67 через 2 недели гормонотерапии не наблюдалось (рис. 39, 40).Динамика изменения КІ67 в группе трижды-негативного подтипа (— - снижение КІ67 50%; — - стабилизация или увеличение КІ67).
На рисунке 41 приведены фотографии опухолевого узла люминального В Нег2-негативного подтипа пациентки С, 76 лет, отражающие снижение КІ67 на фоне двухнедельного приема тамоксифена. КІ67 снизился с 35% до 4-5%. А.
Пациентка И., 67 лет. А. Экспрессия индекса пролиферативной активности в опухолевой ткани core-биопсии РМЖ. Ki-67= 16-18%. Б. Экспрессия индекса пролиферативной активности в опухолевой ткани в центральных отделах узла РМЖ после радикальной мастэктомии. Ki-67= 4-5%.
Степень лечебного патоморфоза в предоперационной тестовой модели по определению чувствительности опухоли к гормонотерапии
Лечебный патоморфоз был описан в 43 опухолевых образцах из 46 (93%). Согласно результатам планового гистологического исследования, лечебный патоморфоз отсутствовал в 12 случаях (28%), I степень лечебного патоморфоза была описана в 18 случаях (42%), II – 8 (19%), III – 2 (5%), IV – 3 (7%) (рис. 43).
Был выполнен пересмотр 9 гистологических препаратов1: из них были пересмотрены два из трех случаев полного лечебного патоморфоза и случаи трижды-негативного рака с наличием признаков лечебного патоморфоза.
При тщательном пересмотре одного из случаев полного лечебного патоморфоза были выявлены единичные атипичные клетки и комплексы рака in situ, поэтому данные опухоли были переклассифицированы в группу лечебного патоморфоза III степени. В препаратах опухоли с IV степенью лечебного патоморфоза третьей пациентки элементов опухоли и признаков патоморфоза найдено не было. Однако в анализ включены результаты, зарегистрированные документально в плановых гистологических заключениях. Высокая степень патоморфоза (III и IV) была зарегистрирована только в группе люминального А подтипа – в 26,2% случаев. При экспрессии ЭР 8 баллов по Allred лечебный патоморфоз отсутствовал только в 15% случаев (3/20).
Наибольшее количество случаев без лечебного патоморфоза приходится на группу Her2+ опухолей (66,7%), несмотря на наличие экспрессии ЭР и ПР в группе люминального В Her2-позитивного подтипа (табл. 17). Патоморфоз I и II степени в группе трижды-негативных опухолей встречался в 62,5% случаев (5/8). ЭР был определен только в 3 из 8 образцов трижды-негативного рака. Во всех трех случаях экспрессия ЭР в материале core-биопсии была низкой (32-36%), повышалась в процессе гормонотерапии до 46-65%, снижения Ki67 зарегистрировано не было, в 1 опухолевом образце описаны признаки лечебного патоморфоза I степени.
Выявлена прямая взаимосвязь степени лечебного патоморфоза в опухолевом узле и лимфатических узлах с динамикой изменений Ki67, однако полученные различия не достигли статистической значимости (р=0,11) (табл. 18). При высокой степени лечебного патоморфоза (III, IV) снижение Ki67 было зарегистрировано в 80% случаев (4/5).
На рисунках 44 и 45 представлены иллюстрации I степени лечебного патоморфоза люминального В рака молочной железы. Рис. 44. Пациентка С., 76 лет. Фотография среза ткани опухолевого узла, окрашенного гематоксилин-эозином, после радикальной мастэктомии. Синяя стрелка – паренхима опухолевой ткани окрашена в фиолетовый цвет, сохранено около 50% опухолевой паренхимы. Красная стрелка – очаг склероза опухолевой ткани, как лечебный патоморфоз 1 степени.
Инвазивный РМЖ после радикальной мастэктомии пациентки Б., 63 лет. Лечебный патоморфоз III степени (выраженный склероз стромы, сохранено менее 10% опухолевой паренхимы), х50. Рис. 48. Пациентка Б., 63 лет. Инвазивный РМЖ, лечебный патоморфоз III степени (выраженный дистрофический полиморфизм опухолевых клеток в склерозированной строме), х200.
На рисунках 49 и 50 представлены фотографии материала core-биопсии и операционного материала случая лечебного патоморфоза 4 степени пациентки инвазивным РМЖ на фоне двухнедельного приема тамоксифена. после радикальной мастэктомии. Очаги атипичного протокового фиброаденоматоза на фоне выраженного склероза (синяя стрелка) ткани молочной железы (лечебный патоморфоз 4 степени).
Динамика изменения индекса пролиферации Ki67 в группах различного биологического подтипа
В процессе гормонотерапии может изменяться как рецепторный статус, так и уровень экспрессии рецепторов. Анализ показал, что все позитивные случаи ЭР остались позитивными после лечения, а из 9 первоначально негативных 5 (56%) поменяли свой статус на позитивный. Снижение уровня экспрессии ЭР в группе исходно ЭР+ опухолей было зарегистрировано в 34% случаев, отсутствие динамики – в 14%, повышение – в 52% случаев. Повышение уровня экспрессии ЭР является дополнительным предиктором гормоночувствительности опухоли, так как напрямую коррелируетсо снижением уровня Ki67 в процессе предоперационной гормонотерапии (р=0,0012).
При ИГХ-исследовании отмечена тенденция к снижению суммарного балла экспрессии ЭР по Allred в 53,3% случаев. Однако данное снижение не коррелировало со снижением Ki67. Детальный анализ показал, что снижение суммарного балла по Allred достигается в основном за счет уменьшения интенсивности окрашивания ядер опухолевых клеток, которое было зарегистрировано в 53,5% случаев. Именно снижение интенсивности, а не уменьшение процента окрашенных клеток показало предиктивную значимость в опухолевом ответе на гормонотерапию. В группе опухолей со снижением Ki67 в 3,6 раза чаще выявлялось снижение интенсивности окрашивания ядер (р 0,05).
Полученное нами повышение уровня экспрессии ЭР методом ПЦФ не согласуется с результатами многочисленных работ Mitchel Dowsett, в которых было описано снижение уровня экспрессии ЭР, определяемых ИГХ-методом. Повышение уровня экспрессии ЭР может быть объяснено механизмом действия тамоксифена. Тамоксифен конкурентно связывается с ЭР, подобно эстрогенам транслоцируется вместе с рецептором в ядро опухолевой клетки, тем самым действие эстрогенов не реализуется и клетка остается в G0 и G1 фазах цикла. При этом прогностически благоприятное повышение уровня экспрессии ЭР может быть объяснено механизмом обратной связи: чем эффективнее тамоксифен связывается с ЭР, тем менее интенсивно эстрогены связываются с ЭР и происходит компенсаторный синтез ЭР. Одновременно уменьшение интенсивности окрашивания опухолевых клеток при ИГХ исследовании может быть обусловлено сниженной функциональной активностью вновь образованных рецепторов, а также образованием тамоксифен-ЭР комплексов. Процент окрашенных клеток может также субъективно занижаться из-за низкой интенсивности окрашивания опухолевых клеток.
В нашем исследовании было отмечено достоверное увеличение уровня экспрессии ЭР: 1 случай нулевой экспрессии остался нулевым, 72% случаев низкой экспрессии (ЭР 40%) перешли в диапазон экспрессии ЭР40%, а 80% случаев высокой экспрессии остались в прежнем диапазоне (р=0,00001). Описанное повышение экспрессии ЭР в исследовании MillerW. и соавт., 2006, было зарегистрировано в 51% случаев [71]. Однако результаты нашей работы показали, что повышение уровня экспрессии ЭР не является предиктивным в отношении снижения уровня Ki67 (р 0,05).
При ИГХ-исследовании повышение суммарного балла по Allred после лечения было зарегистрировано в 34,9% наблюдений, снижение - в 20,9% и в 44,1% случаев выявлено отсутствие изменение суммарного балла РП относительно данных биопсии. Установлена выраженная тенденция к увеличению процента окрашенных клеток: медиана составила 50% в материале core-биопсии и 60% - в операционном материале (р=0,09), при этом не выявлено значимого изменения интенсивности окрашивания ядер в процессе гормонотерапии (р=0,47 Wilcoxon Matched Pairs Test). Проведенный анализ показал, что повышение уровня экспрессии ПР регистрировалось на 10% чаще в группе больных со снижением Ki67, почти в 2 раза реже - при статусе Her2 2+/3+. Значимо различалась частота повышения уровня экспрессии ПР после проведенного лечения в группе с ЭР+ статусом опухоли, независимо от уровня экспрессии рецепторов (р=0,009). В исследовании IMPACT также было показано повышение уровня экспрессии ПР в 48% случаев в группе тамоксифена через две недели терапии [36].
Косвенными признаками являются: исходно высокий уровень экспрессии ПР (7-8 баллов по Allred), дольковый гистологический вариант, отсутствие гиперэкспрессии Her2, повышение уровня экспрессии ПР в процессе гормонотерапии относительно исходного при ИГХ исследовании (преимущественно за счет увеличения процента окрашенных клеток). Проведенный анализ всей группы исследовании показал удовлетворительную конкордантность методов ИГХ и ПЦФ (W=0,49). 119 Однако при детальном исследовании 60 случаев было показано, что среди опухолей, отнесённых при ИГХ исследовании в группу ЭР-отрицательных, методом ПЦФ в 33% выявлены ЭРос с уровнем экспрессии от 23 до 60% (средний показатель - 43,4±18,3%). Напротив, среди опухолей, отнесённых по результатам ИГХ оценки к ЭР-положительным, при исследовании методом ПЦФ в 12,5% случаев экспрессия ЭРос не выявлена.
В соответствии с рекомендациями Американского общества патологов по определению рецепторного статуса РМЖ 2010 года, ложноположительные/отрицательные случаи могут выявляются в 20% ИГХ-исследований [58].Метод ПЦФ лишен субъективизма, позволяет одномоментно, строго количественно анализировать 5-10 тыс. клеток из клеточных суспензий, которые получают из хирургических образцов опухолей большого размера (до 2 см и более в диаметре). Показатель экспрессии маркёра при этом становится интегральным по большому объёму опухоли, а не по локальному участку как при иммуногистохимическом анализе, что в значительной степени нивелирует внутриопухолевую гетерогенность. С учетом высокого процента ложных результатов ИГХ исследований (20%) и установленной дискордантности методов ИГХ и ПЦФ в определении ЭР-негативных опухолей (33,3%), рекомендуется дублирование двух методов или проведение повторного ИГХ анализа при первом отрицательном результате ИГХ до 3-х отрицательных или первого положительного результата.