Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10
Иммунофенотипирование лейкоцитов в онкологической практике 10
1.1. Проточная цитометрия как современный метод анализа клеточных популяций 10
1.2. Характеристика флуорофоров, используемых в проточной цитометрии для конъюгирования с моноклональными антителами 14
1.3. Иммунологические маркеры 21
1.4. Практическое использование проточной цитометрии в научных и клинических исследованиях в онкологической практике 26
ГЛАВА 2. Материалы и методы 43
2.1. Материалы 43
2.2. Доноры и онкологические больные 45
2.3. Получение асцитической жидкости 45
2.4. Выделение и очистка антител 46
2.5. Определение концентрации белка методом спектрофотометрии 48
2.6. Метод гель-фильтрации 49
2.7. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови 49
2.8. Активация лимфоцитов ФГА 50 2.9. Прямая реакция иммунофлуоресценции (РИФ) 50
2.10. Непрямой метод иммуно флуоресцентного анализа 51
2.11. Метод проточной цитометрии 51
2.12. Статистическая обработка данных 52
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение собственных исследований 53
3.1. Получение флуоресцентных зондов на основе МКА серии ИКО и флуоресцентных красителей 53
3.1.1. Получение конъюгатов МКА с цианиновыми красителями Imd-306, Imd-504/506/507 и СуЗ 53
3.1.2. Получение конъюгатов МКА с синтетическим флуорофором А1еха-488 57
3.1.3. Получение конъюгатов МКА с флуорофором группы фикобилипротеинов R-PE (фикоэритрин) 60
3.2. Исследование биологической активности полученных флуоресцентных зондов в одноцветном анализе субпопуляций лимфоцитов методом проточной цитофлуориметрии. Определение рабочих концентраций конъюгатов моноклональных антител с флуоресцентными зондами 71
3.2.1. Изучение биологической активности конъюгатов МКА с цианиновыми флуорофорами СуЗ, Imd-306, Imd-506 72
3.2.2. Изучение биологической активности конъюгатов МКА с синтетическим флуорофором А1еха-488 91
3.2.3. Изучение биологической активности конъюгатов МКА с РЕ 100
3.2.4. Исследование биологической активности полученных флуоресцентных зондов в многоцветном анализе субпопуляций лимфоцитов методом проточной цитофлуориметрии 111
3.2.4.1. Двухцветный анализ 111
3.2.4.2. Трехцветный анализ 133
4.1 Клиническая апробация набора флуоресцентных зондов 140
Глава 4. Заключение 146
Выводы 157
Сокращения, встречающиеся в тексте 159
Список литературы 161
- Характеристика флуорофоров, используемых в проточной цитометрии для конъюгирования с моноклональными антителами
- Выделение и очистка антител
- Получение конъюгатов МКА с цианиновыми красителями Imd-306, Imd-504/506/507 и СуЗ
- Изучение биологической активности конъюгатов МКА с РЕ
Характеристика флуорофоров, используемых в проточной цитометрии для конъюгирования с моноклональными антителами
Метод проточной цитометрии (ПЦ) широко используется в клинической практике и научно-исследовательской работе в области медицины и биологии для многофакторного анализа состава и свойств клеточных популяций. Эта современная и информативная технология быстрого анализа клеточных субпопуляций пришла на смену традиционным гистохимическим и цитохимическим методам анализа [43, 82, 115].
Ряд существенных преимуществ делают этот метод особенно ценным для исследований в области онкологии. Благодаря огромной производительности этой технологии стало возможным обнаружить и охарактеризовать редкие события, т.е. встречающиеся с частотой 10" -10" . Современные цитометры могут регистрировать несколько параметров для каждой отдельной клетки со скоростью до 100000 клеток в секунду, что гарантирует статистическую достоверность результатов [96].
Так, с помощью проточной цитометрии можно охарактеризовать гетерогенные клеточные популяции по фенотипу, выявить отклонения, происходящие в процессе онкогенеза [4, 36]. Этот метод дает возможность быстро и объективно определять особенности пролиферации и достоверно выявлять аномальное содержание ДНК в ядрах опухолевых клеток, анализировать параметры клеточного цикла [6]. С помощью метода проточной цитометрии показана связь между показателями клеточного иммунитета больных с солидными опухолями и отдаленными клиническими результатами лечения [81, 27, 28, 29, 30, 129, 124, 161, 102] Изучение линейной структуры иммунокомпетентных клеток у первичных больных необходимо для назначения адекватной специфической терапии. Невозможно и проведение иммунотерапии онкологическим больным без мониторинга иммунологических показателей [10, 9, 7, 8, , 37, 74, 76, 77]. С применением метода ПЦ решено множество задач биологии клетки, иммунологии, клеточной инженерии [46, 47, 32, 71, 72, 70]. К ним можно отнести определение антиген-специфических клеток с использованием технологии тетрамеров, цитометрическое определение цитокинов в биологических жидкостях, определение чувствительности базофилов in vitro в ответ на действие аллергенов, определение по мембранным маркерам хелперов первого типа и Т-регуляторных клеток [71].
На данный момент существует два направления метода: проточная цитометрия и проточная цитометрия-сортировка. Если первое направление представляет собой исключительно аналитический подход, то второе позволяет проводить сортировку клеток по интересующим исследователя характеристикам и проводить работу с отобранными субпопуляциями. После сортировки собранные популяции клеток или выделенные индивидуальные клетки могут быть использованы для последующего культивирования, введения экспериментальным животным, других методов анализа. Целый ряд научных исследований невозможен без использования цитометров-сортеров [153, 171, 173].
В основе метода проточной цитометрии лежит измерение параметров каждой отдельно взятой клетки. Суспензию клеток под давлением прогоняют через капилляр. При этом за счет наличия обволакивающей жидкости по краям потока создается более высокое давление, чем в центре. Вследствие этого клетки, стремясь попасть в область наименьшего давления, образуют поток, состоящий фактически из одного ряда клеток. Когда такую струю пересекает сфокусированный лазерный луч, в точке пересечения потока и луча одновременно оказывается, как правило, только одна клетка, что позволяет избежать артефактов, связанных с разной удаленностью клеток от точки пересечения лазерного луча с потоком. При пересечении клеткой луча лазера молекулы флуоресцентных красителей, связанных с клетками, переходят в возбужденное состояние. Возвращаясь через короткое время в исходное
состояние, молекулы испускают кванты света. Это вторичное излучение, имеющее строго определенную длину волны для каждого флуорохрома, проходя через оптическую систему прибора (линзы, фильтры, двухцветные зеркала), регистрируется высокочувствительными детекторами (фотоэлектронными умножителями), преобразующими его в электрические сигналы, поддающиеся компьютерной обработке [25,36 ,47, 165].
Иммуноцитофлуориметрический анализ клеток производится по трем основным парметрам: по прямому и боковому светоряссеянию, а также по интенсивности флуоресценции специфических зондов, связанных с поверхностью клеток.
Регистрация прямого светорассеяния FSC (forward side scatter), то есть рассеивание света от поверхности клеток под малыми углами от 2 до 19 позволяет определять размеры клеток.
Боковое светорассеяние SSC (side scatter) позволяет регистрировать рассеиваемые клеточными структурами лучи под углом 90. Этот параметр отражает оптическую плотность цитоплазмы клеток, характер клеточных включений и гранулярность клетки. В данном случае гранулярность — это совокупность образований, формирующих клетку, включая любые клеточные органеллы и ядро. Использование этого параметра позволяет судить о соотношении размеров ядра и цитоплазмы, а также неоднородности или гранулярности цитоплазмы [36].
Данные цитометрического анализа по параметрам светорассеяния позволяют разделить и расположить в виде гистограммы лейкоциты периферической крови на три группы клеток — лимфоциты, моноциты и гранулоциты [90].
Третий параметр, получаемый с помощью метода ПЦ — детекция вторичного светового излучения (флуоресценции) в разных спектральных диапазонах. Кроме аутофлуоресценции, которой обладают все биологические объекты, флуоресцентный сигнал исходит от специальных зондов, соединенных с поверхностью клетки или окрашивающих ее внутренние структуры в процессе предварительной подготовки образцов к анализу. Анализ флуоресценции клеток позволяет получить наибольшее количество информации об исследуемом образце, поскольку даже клетки с идентичной морфологией могут отличаться по составу белков и других макромолекул в зависимости от выполняемой функции, стадии клеточного цикла и т.д. Флуоресценция клетки может возникать как за счет собственных химических соединений (автофлуоресценция), так и за счет применения специальных красителей. Применяются красители, специфически связывающиеся с теми или иными структурами и компонентами клеток (например, пропидиум йодид, связывающийся с ДНК) или конъюгаты красителей с моноклональными антителами, специфичными к определенным мембранным и цитоплазматическим антигенам клетки.
Выделение и очистка антител
В качестве исследуемого биологического материала использовли образцы венозной крови практически здоровых доноров. Кровь забирали из локтевой вены натощак, в качестве антикоагулянта использовали ЭДТА.
Клиническая апробация полученных наборов проводилась на 3 группах больных онкологическими заболеваниями. Первая группа включала 64 больных раком слизистой оболочки полости рта до и после хирургического лечения. Вторая группа — больные раком яичников до и после хирургического лечения в количестве 35 человек. Третья группа сосотояла из 73 больных первично-операбельным раком молочной железы до и после хирургического лечения.
МКА получали методом гибридомной технологии с использованием ранее созданных линий гибридных клеток, продуцирующих эти антитела. МКА выделяют из асцитической жидкости мышей BALB/c, которым внутрибрюшинно инокулируют клетки продуцирующей МКА гибридомы.
За 3-10 дней до инокуляции клеток гибридомы мышам внутрибрюшинно вводили 0,5 мл вазелинового масла или 3% пептона на вазелиновом масле для индукции роста гибридомы в асцитной форме. 10 клеток гибридом инокулировали мышам внутрибрюшинно и через 7-8 дней, в зависимости от накопления асцита, собирали асцитическую жидкость. Асцитическую жидкость, полученную от разных мышей, объединяли и центрифугировалит в течение 20 мин при 300 g и 4С. После приведенных выше процедур в реакции непрямой иммунофлуоресценции оценивали биологические свойства асцитов в титре 1:100, 1:500, 1:1000, 1:10000. В дальнейшие исследования включали МКА с активностью в титре не менее 1:1000. Асцитическую жидкость хранили при -50С до дальнейшей обработки.
(Асцитическая жидкость была получена под руководством старшего научного сотрудника лаборатории медицинской биотехнологии Научно исследовательского института экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина», к.б.н., Голубцовой Н.В.)
МКА выделяли путем высаливания сульфатом аммония: МКА выделяли путем комбинированной очистки с использованием каприловой кислоты и высаливания иммуноглобулиновой фракции сульфатом аммония. Для этого точно измеренный объем асцитной жидкости разводили в 5 раз 0,06 М ацетатным буфером (рН 4,0), центрифугировали при ускорении 350 g, 10 мин. К надосадочной жидкости медленно, по капле, добавляли каприловую кислоту из расчета 25 мкл на каждый 1 мл супернатанта и инкубировали при постоянном встряхивании 30 мин. Смесь центрифугировали 30 мин при ускорении 350 g и температуре +4С. Затем супернатант фильтровали, доводили рН до 7,4 и охлаждали в течение 30 мин в холодильной камере при +6 С.
К охлажденному супернатанту добавляли равный объем насыщенного раствора сульфата аммония, смесь перемешивали и инкубировали в течение 1 ч. Осадок, полученный после центрифугирования смеси (350 g, 10 мин), растворяли и переводили в фосфатно-солевой буфер (рН 7,4) гель-фильтрацией на хроматографической колонке Сефадекс G-25.
Очистка IgG на белке G 5-10 мл асцитической жидкости центрифугировали 60 мин при 350g. Далее супернатант разводили равным объемом 0,1 М фосфатно-солевого буфера с 0Д5М NaCl, рН 7,4 (PBS) и оставляли на ночь при +4С. После повторного центрифугирования, надосадочную жидкость фильтровали через фильтр с размером пор 0,45 мкм и наносили на колонку HiTrap rProtein G, уравновешенную 0,1 М фосфатно-солевым буфером с 0Д5М NaCl, рН 7,4. Хроматографию проводили на хроматографе АКТА purifier 10. Скорость потока составляла 3 мл/мин, выход белковых продуктов оценивали денситометрией при 280 нм. Нанесенный на колонку материал тщательно отмывали PBS, до значений оптической плотности на выходе из колонки менее 0,002. На отмытую от не связавшегося материала колонку наносили 0,1 М глицин-HCl буфер, рН 3,0, и собирали выходящие белковые фракции. рН выходящего элюата доводили до 7,5-8,0 с помощью 1М Трис-HCl буфера рН 9,0. Собранные фракции объединяли, определяли концентрацию белка и консервировали 0,1 % NaN3, либо переводили в фосфатно-солевой буфер с ЭДТА, концентрировали до 8 - 12 мг/мл и стерилизовали через шприц-насадки с порами 0,22 мкм.
Очистка IgG на анионообменном сорбенте Mono Q 5-10 мл асцитической жидкости центрифугировали 60 мин при 350g об/мин и +4С. К супернатанту при постоянном перемешивании на магнитной мешалке по каплям добавляли равный объем насыщенного при +4С раствора (№14)2SO4 и выдерживали 15-20 минут. Реакционную смесь центрифугировали 30 мин при 350g и ресуспендировали в 0,1М трис-буфере с 0Д5М NaCl, рН 8,0 (TBS) в объеме, равном 0,5 объёма исходного асцита. Процедуру высаливания повторяли еще раз. Полученный осадок ресуспендировали в 0,1М трис-буфере с 0Д5М NaCl, рН 8,0. Полученный препарат переводили в 10 мМ Трис-HCl буфер рН 7,8 на колонке PD-10 и наносили на колонку Mono Q 10/100, уравновешенную тем же буфером. Хроматографию проводили на хроматографе АКТА purifier 10. Скорость потока составляла 1 мл/мин, выход белковых продуктов оценивали денситометрией при 280 нм. После отмывки колонки от не связавшейся белковой фракции, на колонку подавали градиент 0 - 40% 1М раствора NaCl в 10 мМ Трис-HCL буфере. Выходящие фракции собирали на коллекторе фракций по 1 мл и в последующем анализировали методом электрофореза в ПААГ с ДСН по Лэммли на наличие IgG и степень чистоты препарата. Фракции, имеющие молекулярную чистоту более 95 - 98 % объединяли, переводили в фосфатно-солевой буфер с ЭДТА (рН 7,4), концентрировали до 8 - 12 мг/мл и стерилизовали через шприц-насадку с порами 0,22 мкм. Очистка IgG от молекулярных конгломератов на колонке Superdex 200
Препараты IgG, полученные вышеописанными методами, в ряде случаев дочищали на гель-фильтрующей колонке среднего давления Superdex 200 10/300. Колонку предварительно калибровали с помощью маркеров молекулярного веса. На колонку наносили 0,6 - 1,0 мл образца IgG, и проводили разделение на хроматографе АКТА purifier 10. Скорость потока составляла 0,5 мл/мин, выход белковых продуктов оценивали денситометрией при 280 нм. Фракции, соответствующие выходу гомогенного IgG объединяли, переводили в PBS-ЭДТА, концентрировали до 8 - 12 мг/мл и стерилизовали через шприц-насадку с порами 0,22 мкм.
После очистки МКА по приведенным выше методикам в реакции непрямой иммунофлуоресценции оценивали биологические свойства очищенных МКА в диапазоне концентраций от 100 мкг/мл до 0,1 мкг/мл. Нами было обнаружено, что МКА антитела a-HLA-DR (ИКО 1) теряли биологические свойства. Возможно, это связано с высокой чувствительностью к изменениям рН. В дальнейшие исследования данные МКА не были включены. (Очистка IgG на белке G, IgG на анионообменном сорбенте Mono Q, на колонке Superdex 200 выполнена ведущим научным сотрудником лаборатории медицинской биотехнологии НИИ ЭДиТО ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина», к.м.н. Гриневичем А.С.)
Получение конъюгатов МКА с цианиновыми красителями Imd-306, Imd-504/506/507 и СуЗ
В результате проведенных исследований получили конъюгаты МКА с флуорофором А1еха-488 с различным соотношением краситель/белок (D/P). Оценку биологической активности полученых конъюгатов проводили на клетках периферичекой крови доноров в диапазоне концентраций МКА 0,5-100 мкг/мл. Для возбуждения флуоресценции А1еха-488 использовали аргоновый лазер с длиной волны 488 нм. Анализ флуоресценции проводили в канале FL1.
Получена серия конъюгатов a-CD4-Alexa-488 с плотностью мечения (D/P) от 1 до 9, для каждого из которых в диапазоне концентраций МКА 0,5-100 мкг/мл было определено соотношение S/N(PHC. 33). Рисунок 33 — Зависимость отношения специфического сигнала к «шуму» (S/N) от концентрации a-CD4-Alexa-488 с различной плотностью мечения (D/P).
Наибольшие значения отношения S/N характерны для конъюгатов с плотностью мечения в диапазоне 4:7 (моль:моль).
Далее, используя конъюгат с плотностью метки 9, определили диапазон рабочих концентраций этого зонда и адекватность получаемых результатов результатам цитометрического анализа того же образца крови с использованием эталонного реагента - коммерческого продукта МКА CD4PE производства компании BD Bioscience, США. На рис 34. представлены гистограммы распределения популяции лимфоцитов периферической крови донора с использованием в диапазоне концентраций 0,5-100 мкг/мл. В диапазоне концентраций 0,5-100 мкг/мл гистограммы имеют вид, соответствующий антигену CD4, экспрессированного на Т-лимфоцитах.
Увеличение концентрации зонда выше 25 мкг/мл приводит к смещению пика аутофлуоресценции (на гистограммах он слева) вправо, следовательно концентрация мкг/мл является макисмально допустимой для выполнения цитометрического анализа клеточных популяций. При концентрациях зонда в диапазоне 2,5-10 мкг/мл (рис. 35) в составе лимфоцитов периферической крови донора выявляется около 38 % CD4+ клеток.
Цитометрический анализ лимфоцитов того же донора, выполненный с использованием эталонного реагента (МКА производства BD Biosciences, США), выявил такое же содержание антигенпозитивных клеток в образце (рис.35), что говорит об адекватности применения для цитометрического анализа полученных нами иммунофлуоресцентных конъюгатов CD4-Alexa 488.
Таким образом, конъюгаты CD4-Alexa-488 в диапазоне концентраций 0,5-25 мкг/мл являются рабочими, однако, максимальные значение S/N для конъюгатов соответствует концентрациям 2,5-10 мкг/мл, следовательно, они являются оптимальными и рекомендуются нами для анализа клеточных популяций периферической крови методом проточной цитометрии.
Получена серия конъюгатов a-CD8-Alexa-488 с плотностью мечения (D/P) от 1 до 10, для каждого из которых в диапазоне концентраций МКА 0,5-100 мкг/мл было определено соотношение S/N(PHC. 36).
Наибольшие значения отношения S/N характерны для конъюгатов с плотностью мечения в диапазоне 4:10 (моль:моль). Далее, используя конъюгат с плотностью метки 10, определили диапазон рабочих концентраций этого зонда и адекватность получаемых результатов результатам цитометрического анализа того же образца крови с использованием эталонного реагента - коммерческого продукта МКА CD8PE производства компании BD Bioscience, США. На рис 37. представлены гистограммы распределения популяции лимфоцитов периферической крови донора с использованием в диапазоне концентраций 0,5-100 мкг/мл.
Повышение концентрации зонда выше 10 мкг/мл приводит к смещению пика ауто флуоресценции (на гистограммах он слева) вправо, следовательно концентрация 10 мкг/мл является максимально допустимой для выполнения цитометрического анализа клеточных популяций.
При концентрациях зонда в диапазоне 5-10 мкг/мл (рис.38) в составе лимфоцитов периферической крови донора выявляется около 33 % CD8+ клеток, однако при концентрации зонда 25 мкг/мл величина соотношения S/N снижается, за счет сдвига пика авто флуоресценции вправо. Цитометрический анализ лимфоцитов того же донора, выполненный с использованием эталонного реагента (МКА CD8PE производства BD Biosciences, США), выявил такое же содержание антигенпозитивных клеток в образце (рис.38), что говорит об адекватности применения для цитометрического анализа полученных нами иммунофлуоресцентных конъюгатов CD8-Alexa-488.
Таким образом, конъюгаты CD8-Alexa-488 в диапазоне концентраций 5-10 мкг/мл являются оптимальными и рекомендуются нами для анализа клеточных популяций периферической крови методом проточной цитометрии. CD20Alexa488 Получена серия конъюгатов a-CD20-Alexa-488 с плотностью мечения (D/P) от 3 до 13,5, для каждого из которых в диапазоне концентраций МКА 0,5-100 мкг/мл было определено соотношение S/N (Рис. 39).
Изучение биологической активности конъюгатов МКА с РЕ
Для оценки возможности применения различных зондов в трехцветной РИФ в 4 различные пробирки вносили аликвоты одного образца исследуемой крови, в первую пробирку добавляли раствор первого зонда (в оптимальной конечной концентрации), во вторую пробирку - раствор второго зонда, а в третью - раствор третьего зонда, в четвертую — смесь трех зондов в той же конечной концентрации каждого. После выполнения прямой РИФ все три образца анализировали на проточном цитометре так, как описано выше для двухцветного анализа. Возможность использования полученных флуоресцентных зондов в трехцветном анализе продемонстрирована ниже: на рисунке 70 а представлена 3D диаграмма распределения лимфоцитов крови здорового донора при трехцветном анализе с использованием зондов CD3 FITC (FL1) с конечной концентрацией 10 мкг/мл, CD4 РЕ (FL2) с концентрацией 20 мкг/мл, CD8-Imd 506 (FL4) с концентрацией 10 мкг/мл. На рисунке 70 б представлена 3D диаграмма распределения лимфоцитов крови этого же донора при трехцветном анализе с использованием зондов CD3 FITC (FL1) с конечной концентрацией 10 мкг/мл, CD4 Imd-306 (FL2) с концентрацией 10 мкг/мл, CD8-Imd 506 (FL4) с концентрацией 10 мкг/мл.
В этих двух комбинациях используется пара зондов CD3FITC и CD8Imd-506. На рисунке 71 а представлены «наложенные» гистограммы по каналу FL1 для монохромного (голубое заполнение) и двухцветного (черный контур) анализа, на рисунке 71 б представлены «наложенные» гистограммы по каналу FL4 для монохромного (голубое заполнение) и двухцветного (черный контур) анализа.
а) Одно и трехцветный анализ субпопуляций лимфоцитов периферической крови донора с использованием конъюгата CD3FITC с конечной концентрацией 10 мкг/мл. б) Одно и трехцветный анализ субпопуляций лимфоцитов периферической крови донора с использованием конъюгата CD8 Imd-506 с конечной концентрацией 10 мкг/мл. Голубым цветом выделены гистограммы для монохромного анализа, черным контуром-гистограмма для трехцветного анализа
Гистограммы идентичны, следовательно, конъюгаты CD8 Imd-506 и CD3 FITC с конечной концентрацией зонда 10 мкг/мл могут использоваться как в двухцветной реакции, так и в трехцветной. На рисунке 72 а представлены «наложенные» гистограммы по каналу FL2 для монохромного (голубое заполнение) и трехцветного (черный контур) анализа, гистограммы практически идентичны, следовательно, конъюгат CD4 Imd-306 с конечной концентрацией зонда 10 мкг/мл может использоваться как в двухцветной реакции, так и в трехцветной. На рисунке 72 б представлены «наложенные» гистограммы по каналу FL2 для монохромного (голубое заполнение) и трехцветного (черный контур) анализа, гистограммы практически идентичны, следовательно, конъюгат CD4 РЕ с конечной концентрацией зонда 20 мкг/мл может использоваться как в двухцветной реакции, так и в трехцветной.
а) Одно и трехцветный анализ субпопуляций лимфоцитов периферической крови донора с использованием конъюгата CD4 Imd-306 с конечной концентрацией 10 мкг/мл. б) Одно и трехцветный анализ субпопуляций лимфоцитов периферической крови донора с использованием конъюгата CD4 РЕ с конечной концентрацией 20 мкг/мл. Голубым цветом выделены гистограммы для монохромного анализа, черным контуром-гистограмма для трехцветного анализа
На рисунке 73 представлены двумерные дот-плот диаграммы распределения лимфоцитов крови донора при их трехцветном анализе с использованием зонда CD3FITC (FL1) и CD4PE (FL2), CD8 Imd-506. (FL4) На диаграмме 73 а четко выделяется субпопуляции Т-клеток с фенотипом CD3+CD4+ (48,4 %%) и прочих Т-лимфоцитов CD3+CD4" (29,9%); суммарное содержание Т-лимфоцитов в популяции, таким образом, составляет 72,69%. На диаграмме 73 б четко выделяется субпопуляция цитотоксических Т-лимфоцитов CD3+CD8+ - 23,47%, популяция лимфоцитов CD3"CD8+ составляет 6,27%, прочих Т-лимфоцитов 49,3%, суммарное содержание Т-клеток составляет 72,28%. Контрольные значения, полученные для того же образца крови донора с применением коммерческих препаратов сравнения, составили: CD3+ - 77,4%; CD3+ CD4+ - 47,7%; CD3+ CD8+ -24,6%, CD3"CD8+- 5,9%, что соответствует результату анализа с использованием нового зонда.