Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 30
1.1. Теории биологии опухолей и лечение рака молочной железы: эволюция по спирали 30
1.2. Понятие о скрининге и скрининговом раке 38
1.3. Биологическая гетерогенность раннего РМЖ 44
1.4. Иммунобиология рака молочной железы: теории и перспективы 53
1.5. Пролиферация и апоптоз: прогностическое значение при раннем РМЖ 68
1.6. Роль экспрессии циклооксигеназы-2 в прогнозе раннего РМЖ 75
Глава 2. Материалы и методы 79
2.1. Дизайн исследования 79
2.2. Характеристика российских пациенток, включенных в популяционный этап исследования (анализ данных российского Регистра РМЖ) 81
2.3. Характеристика голландских пациенток, включенных в популяционный этап исследования
(анализ данных Национального Канцеррегистра Нидерландов) 88
2.4. Характеристика российских пациенток, получивших лечение в РОНЦ им. Н.Н. Блохина и Клинике РМАПО 90
2.5. Характеристика голландских пациенток, получивших лечение в LUMC 93
2.6. Характеристика лабораторного этапа исследования (анализа биологии опухолей) 97
2.7. Оценка результатов исследования и статическая обработка данных 105
Глава 3. Популяционный «портрет» РМЖ I стадии 107
3.1. Возрастные особенности российских и голландских женщин с РМЖ I стадии, включенных в национальные Регистры РМЖ 107
3.2. Анализ програ мм ранней диагностики в России и Нидерландах 109
3.3. Морфологические особенности РМЖ I стадии в популяции российских и голландских женщин 113
3.4. Особенности лечебной стратегии при РМЖ 1-стадии в России и Нидерландах 114
Глава 4. Когортный этап сравнения клинико-морфологических особенностей и вариантов лечения РМЖ I стадии (Анализ данных РОНЦ им. Н.Н.Блохина, Клиники РМАПО и LUMC)... 120
4.1. Клинико-морфологическая характеристика РМЖ I стадии 120
4.2. Клиническая семиотика и предоперационная диагностика РМЖ I стадии (анализ данных РОНЦ и Клиники РМАПО) 122
4.3. Когортный анализ лечебной стратегии при РМЖ I стадии в национальных онкологических учреждениях 128
Глава 5. Эволюция локального и лекарственного лечения РМЖ I стадии и ее отдаленные результаты 133
5.1. Анализ российской когорты пациенток 133
5.2. Анализ голландской когорты больных 140
5.3. Изменение частоты рецидивов и смертей от РМЖ как результат эволюции лечения в когорте российских и голландских женщин 143
5.4. Улучшение отдаленной выживаемости российских женщин как результат эволюции лечения РМЖ I стадии 148
Глава 6. Прогностическое значение различных видов лечения (хирургического, лучевого и лекарственного) у российских больных с РМЖ I стадии 152
6.1. Прогностическая роль локального лечения 152
6.2. Прогностическая роль адъювантного лекарственного лечения при РМЖ I стадии 155
6.3. Прогностическая роль различных режимов адъювантной лекарственной терапии РМЖ I стадии 15
6.4. Подгрупповой анализ прогностического значения адъювантной химиотерапии при РМЖ I стадии 161
6.5. Подгрупповой анализ прогностического значения адъювантной эндокринотерапии при РМЖ I стадии 165
Глава 7. Гетерогенность РМЖ I стадии у российских женщин 171
7.1. Клиническое, биологическое и прогностическое значение размера опухоли Tla, Tib, Tic при раке молочной железы I стадии 171
7.2. Биологические подтипы РМЖ I стадии 177
Глава 8. Оценка риска рецидива и смерти при РМЖ I стадии: одно- и многофакторный регрессионный анализ российской когорты пациенток 185
8.1. Оценка риска рецидива при РМЖ I стадии 185
8.2. Оценка риска смерти при РМЖ I стадии 195
Глава 9. Иммунная гетерогенность РМЖ I стадии: биологическое, популяционное и прогностическое значение 202
9.1. Характеристика российских и голландских больных и опухолей, включенных в лабораторный этап исследования 202
9.2. Иммунный «портрет» РМЖ I стадии у российских и голландских больных 209
9.3. Иммунная характеристика основных биологических подтипов рака молочной железы I стадии 212
9.4. Прогностическое значение экспрессии маркеров генов гистосовместимости HLAI класса 218
9.5. Иммунная гетерогенность РМЖ I стадии 223
Глава 10. Биологическое и прогностическое значение экспрессии маркеров пролиферации, апоптоза и циклооксигеназы 232
10.1. Значение ядерной экспрессии р53 у российских и голландских больных сРМЖІ стадии 232
10.2. Взаимосвязь пролиферации и апоптоза при РМЖ I стадии 239 10.3. Пролиферация и апоптоз при различном иммунном профиле РМЖ 243
10.4. Значение экспрессии циклооксигеназы 2 типа при раннем РМЖ 246
10.5. Прогностическая значимость биологических маркеров для риска рецидива и смерти от РМЖ (многофакторный регрессионный анализ)... 253
Заключение 261
Выводы 296
Практические рекомендации 303
Список сокращений 306
Список литературы
- Иммунобиология рака молочной железы: теории и перспективы
- Характеристика российских пациенток, получивших лечение в РОНЦ им. Н.Н. Блохина и Клинике РМАПО
- Анализ програ мм ранней диагностики в России и Нидерландах
- Клиническая семиотика и предоперационная диагностика РМЖ I стадии (анализ данных РОНЦ и Клиники РМАПО)
Иммунобиология рака молочной железы: теории и перспективы
Впервые на большом ретроспективном материале (когортный этап исследования; 1901 пациентка с РМЖ I стадии) проанализирована эволюция лечения РМЖ I стадии в течение последних 30 лет в России и Нидерландах и представлены отдаленные результаты данных изменений. Кроме того, были сопоставлены клинико-морфологические данные у российских и голландских женщин, получивших лечение в отдельных онкологических учреждениях с общепопуляционными данными.
Впервые в России оценено клиническое, биологическое и прогностическое значение размера опухоли ТІ a, Tib и Tic при РМЖ I стадии на большом ретроспективном клиническом материале (1341 больная с РМЖ I стадии), а также дана всесторонняя оценка биологической и прогностической роли основных биологических подтипов РМЖ, выделенных с учетом современных рекомендаций (люминального А, НЕК2-негативного люминального В, HER2+ люминального В, тройного негативного и нелюминального HER2+).
На основании данных много факторного регрессионного анализа впервые доказано прогностическое значение для риска рецидива и смерти при РМЖ I стадии 2 факторов: биологического подтипа РМЖ и применения адъювантной лекарственной терапии.
Впервые на большом клиническом материале (518 российских и голландских пациенток, включенных в лабораторный этап исследования) представлена возможность оценки иммунной гетерогенности РМЖ I стадии на основании имммуногистохимической экспрессии маркеров генов гистосовместимости HLA-I класса и наличия опухолевой инфильтрации Foxp3+ клетками. Были сформулированы научно-обоснованные механизмы реализации противоопухолевого иммунного ответа у российских и голландских больных и показаны важнейшие популяционные различия; оценено биологическое и прогностическое значение различных видов иммунного ответа при РМЖ I стадии. Анализ прогностической роли иммунных маркеров выполнен не только в общей группе, а также в подгруппах женщин с адъювантной лекарственной терапией и без таковой.
Впервые в России оценена роль маркеров пролиферации и апоптоза при РМЖ I стадии (р53 и КІ67); показано значение экспрессии мутированного белка р53 у российских и голландских женщин, а также значение маркеров пролиферации и взаимосвязи экспрессии КІ67 и ядерного белка р53 для риска дальнейшего прогрессирования и смерти при РМЖ I стадии. Дана характеристика маркеров пролиферации и апоптоза при различном иммунном статусе при РМЖ I стадии у российских и голландских больных и описаны вероятные научно-обоснованные причины высоких показателей выживаемости у голландских больных без адъювантной системной терапии.
Впервые оценена экспрессия циклооксигеназы при РМЖ I стадии у российских и голландских больных; показана ассоциация экспрессии энзима с неблагоприятными биологическими характеристиками опухолей (люминальным и тройным негативным подтипом РМЖ), высокой пролиферативной активностью карциномы и ее способностью уклониться от апоптоза. Оценена прогностическая роль экспрессии циклооксигеназы для риска рецидива болезни и смерти от прогрессирования в общей группе российских и голландских женщин и при различном статусе ER в опухоли.
Работа является первым научным трудом, где на большом клиническом международном материале оценено биологическое, популяционное и прогностическое значение гетерогенности (разнородности) РМЖ I стадии. Для проведения работы был разработан собственный оригинальный дизайн исследования, с включением трех этапов: популяционного, когортного этапов и анализа биологии опухолей. В каждом из этапов исследования был проведен анализ представленного клинического материала; однако, все части работы были логически и идейно взаимосвязаны.
На популяционном этапе исследования была использована электронная база данных Российского Регистра РМЖ и Национального Канцеррегистра Нидерландов; для корректности представления данных на популяционном уровне выполнен анализ сопоставимости данных российского и голландского Регистров с данными официальной статистики в странах. Представлен популяционный «портрет» РМЖ I стадии в России и Нидерландах и обозначены причины выявленных клинико-морфологических популяционных различий, для чего проведен тщательный анализ данных Всемирной организации здравоохранения, Росстата и международной онкологической организации GLOBOGAN 2012.
Ретроспективный когортный этап исследования проведен на большом клиническом материале у пациенток, получивших лечение в Национальных онкологических учреждениях России (ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» и Клиники ГБОУ ДПО РМАПО) и Нидерландов (Лейденский университетский медицинский Центр - LUMC). Показаны различия в клинико-морфологических характеристиках, особенностях предоперационной диагностики и лечебной стратегии при раннем РМЖ в России и Нидерландах с учетом существующих Национальных рекомендаций.
Для российских больных была проанализирована клиническая семиотика заболевания и выявлены проблемы в ранней диагностике РМЖ (доля опухолей, выявленных при скрининговых инструментальных методах диагностики ничтожно мала - всего 13%), что требует модернизации программ ранней диагностики РМЖ в нашей стране. При оценке эффективности методов предоперационной верификации диагноза было показано абсолютное преимущество предоперационной core-биопсии под инструментальным контролем в эффективной верификации диагноза в 100% случаев, что позволило оценить биологические особенности опухоли и спланировать наиболее оптимальный лечебный алгоритм. Учитывая отсутствие в России единого алгоритма предоперационного ведения больных с малыми опухолями, данные результаты представляют особую ценность для практического здравоохранения.
Изучение гетерогенности РМЖ I стадии проведено с учетом современной классификации биологических подтипов РМЖ. Убедительно доказано, что биологический подтип опухоли является необходимым важным фактором для прогнозирования риска развития рецидива и смерти от РМЖ и должен учитываться при планировании лечебного алгоритма. Показано, что размер опухоли Tla-b-с также имеет важное клиническое, биологическое и прогностическое значение при РМЖ I стадии и, несомненно, должен учитываться при выборе лечебной стратегии.
Изучение иммунной гетерогенности опухолей, экспрессии маркеров пролиферации и апоптоза у российских и голландских больных проведено с учетом имеющихся теоретических и научных представлений о реализации противоопухолевого иммунного ответа и механизмов апоптоза. Впервые представлена возможность комплексной оценки иммунной гетерогенности РМЖ I стадии на основании имммуногистохимической экспресии маркеров генов гистосовместимости HLA-I класса и наличия супрессорных иммунных механизмов (HLA-E/HLA-G и инфильтрации опухоли Foxp3+ клетками). Дана всесторонняя оценка экспрессии маркеров пролиферации (КІ67) и апоптоза (р53) у российских и голландских больных. Была подтверждена гипотеза, что негативное прогностическое влияние экспрессии р53 при РМЖ I стадии у российских больных может быть компенсировано позитивной ролью адъювантной системной терапии. Кроме того, доказано, что наличие высокой пролиферации опухолей (Ki67 20%) и способность ухода от апоптоза (экспрессии мутантного ядерного белка р53) приводит к фатальным результатам у российских больных. Представлена характеристика маркеров пролиферации и апоптоза при различном иммунном статусе при РМЖ I стадии у российских и голландских больных и описаны вероятные научно-обоснованные причины высоких показателей выживаемости у голландских больных без адъювантной системной терапии.
Характеристика российских пациенток, получивших лечение в РОНЦ им. Н.Н. Блохина и Клинике РМАПО
Кластерная дифференцировка Т-лимфоцитов. В соответствии с международной классификацией все основные антигенные маркеры лимфоцитов и других клеток иммунной системы обозначены как кластеры дифференцировки, или CD (claster of differentiation). Набор различных CD на поверхности отдельной клетки составляет ее фенотип (поверхностную характеристику). Общим для всех Т-лимфоцитов является наличие Т-клеточного рецептора, состоящего из внеклеточной части (а и Р- домены) и нековалентно связанных с ним 5 трансмембранных белков; данный комплекс обозначается как единая функциональная структурная молекула CD3. Биологическое значение CD3 в противоопухолевом иммунном ответе состоит в распознавании опухолевого антигена (эпитопа) с помощью аир- доменов, передачи сигнала внутрь Т-лимфоцита, запуска процесса его активации и последующей пролиферации с образованием клона Т-лимфоцитов определенной специфичности, способной реализовать противоопухолевый иммунный ответ [61, 146, 199].
Т-лимфоциты по их поверхностным гликопротеинам CD4 и CD8 подразделяются на 2 большие категории: CD4+ (Т-хелперы) и CD8+ (Т-киллеры). Зрелые Т-лимфоциты содержат один из белков (CD4 или CD8); незрелые Т-лимфоциты, находящиеся в тимусе, могут иметь оба белка (CD4 и CD8). CD4+ клетки разделены на 2 субпопуляции: 1 и 2 типа. Т-хелперы CD4+ 1 типа продуцируют у-интерферон, интерлейкин-2 и фактор некроза опухоли; данные цитокины способствуют развитию клеточного противоопухолевого иммунитета за счет активизации созревания Т-киллеров, макрофагов, появления антиген-презентирующей функции у Т-лимфоцитов, эндотелиальных или эпителиальных клеток. Т-хелперы CD4+ 2 типа регулируют гуморальный иммунитет и оказывают супрессорную функцию по отношению к Т-хелперам 1 типа за счет продукции интерлейкинов 4, 5, 6, 10 и 13 типа. В свою очередь, у-интерферон, вырабатываемый Т-хелперами 1 типа, оказывает супрессорное действие на Т-хелперы 2 типа. Дифференцировка Т-хелперов из покоящейся CD4+ клетки происходит под действием интерлейкина 12, вырабатываемого макрофагом, в сторону Т-хелпера 1 типа, а под действием интерлейкина-4, выделяемого тучными клетками, в сторону Т-хелпера 2 типа [47, 53, 189].
Другим классом Т-лимфоцитов является CD8+ клетка (Т-киллер), которая активизируется из покоящейся зрелой Т-клетки при соблюдении 2 условий: при распознавании опухоль-специфического антигена (эпитопа) в составе молекулы HLA-I класса и дополнительного стимулирующего сигнала (интерлейкина-2) от Т-хелперов 1 типа. Данный каскад позволяет пролиферировать и образовать клон Т-киллеров, обладающих единой противоопухолевой специфичностью для реализации клеточного иммунного ответа [53, 189].
Еще одним классом лимфоцитов, играющих важнейшую роль в реализации противоопухолевого иммунного ответа, является NK-клетки (натуральные киллеры - англ. Natural killer cells) - большие гранулярные лимфоциты, оказывающие цитотоксический эффект на опухолевые клетки и обладающие цитокин-продуцирующей функцией. В отличие от Т-лимфоцитов, NK-клетки не имеют Т-клеточного рецептора, CD3 и поверхностных иммуноглобулинов, но обычно экспрессируют CD 16, CD56 и CD 94 [215].
В 1995 г. S. Sakaguchi открыли особую группу Т-лимфоцитов CD4+ CD25+ Foxp3+ , играющую важнейшую роль в регуляции иммунного ответа - Treg (англ. T-regulatory cells, Treg). Развитие и функционирование Treg лимфоцитов определяет ген FOXP3, локализованный в Х-хромосоме. Treg подавляют активацию, пролиферацию и эффекторные функции Т-хелперов CD4+ и Т-киллеров CD8+, NK-клеток, В-лимфоцитов и антиген-презентирующих клеток [131,183].
Роль молекул HLA I и II класса в реализации противоопухолевого иммунного ответа. Субпопуляция Т-лимфоцитов имеют разные механизмы реализации противоопухолевого иммунного ответа. Так, популяция Т-хелперов (CD4+) распознает опухолевые эпитопы, которые презентируются молекулами HLA-II класса ввиду наличия в них участка связывания с молекулой CD4 на Р-2 домене. В противоположность этому, субпопуляция Т-киллеров (CD8+) распознает антигенные эпитопы в составе молекул HLA-I класса ввиду наличия в них а-3 домена - участка связывания с молекулой CD8. Структуры CD4 и CD8 являются дополнительными адгезивными молекулами на поверхности Т-лимфоцита, которые стабилизируют присоединение Т-лимфоцитов (киллеров и хелперов) к антиген-презентирующим клеткам, обеспечивая достаточный контакт клеток в процессе распознавания [23,28].
Клеточный противоопухолевый иммунитет. Главную роль в разрушении опухоли играют Т-киллеры CD8+ и NK-клетки. Т-хелперы CD4+ управляют противоопухолевым иммунным ответом, согласовывая различные этапы его развития за счет продукции цитокинов.
Т-киллер CD8+ распознает чужеродный антиген в составе HLA-I класса на поверхности опухолевой клетки и активизируется под действием интерлейкина-2, после чего он разрушает чужеродную опухолевую клетку путем продукции перфоринов, гранзимов или индукции апоптоза через Fas-лиганды. Перфорин является белком-полимером, который выбрасывает Т-киллер при контакте с чужеродным антигеном на поверхность оболочки клетки-мишени. Перфорин полимеризуется в присутствии ионов кальция, образуя поры в оболочке клетки-мишени, через которые вода и соли свободно проникает в клетку, а белки задерживается, в результате изменения осмотического давления опухолевая клетка гибнет. Гранзимы (сериновые эстеразы) - ферменты, которые проникают через перфориновые поры в опухолевую клетку и вызывают в ней фрагментацию ДНК и запуск апоптоза [53, 61, 211]. Третий механизм гибели опухолевой клетки (Fas-зависимый апоптоз) запускается через активацию рецептора CD95 (Fas) на поверхности Т-киллера CD8+ [153].
Другим механизмом противоопухолевой защиты обладают NK-клетки. На поверхности NK-киллера экспрессируются рецепторы KIR (англ. killer inhibitory receptor), играющие важную роль в реализации противоопухолевого иммунного ответа: при распознавании на клетке-мишени комплекса HLA-I, аналогичного собственному, рецепторы KIR дают сигнал торможения цитотоксической активности. При отсутствии на клетке-мишени молекул HLA, происходит распознавание и активация NK-клетки через CD2 и CD69 и запускается процесс киллинга, который может идти через выброс перфоринов и гранзимов с образованием перфориновых дыр и гибели клеток (процесс аналогичен у Т-киллеров CD8+), а может протекать через стимуляцию рецепторов CD 16 (антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности) [218, 225]. Кроме того, NK-клетки продуцируют большое количество у-интерферона, который является важным активаторов клеточного противоопухолевого иммунитета [215].
Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (англ. antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity- ADCC) описана Moller в 1965г. Феномен ADCC является уникальным примером кооперированного клеточно-гуморального противоопухолевого иммунитета, для реализации которого необходимо 3 обязательных участника: опухолевая клетка-мишень, антитела с противоопухолевой специфичностью к клеткам-мишеням (иммуноглобулины с Fc-фрагментом), иммунные клетки с цитотоксичностью и наличием Fc-рецептора (CD 16). В случае отсутствия одного из участников ADCC не реализуется: в феномене ADCC не участвуют В-лимфоциты, имеющие Fc-рецептор, но не обладающие цитотоксичностью, и Т-киллеры CD8+, обладающие цитотоксичностью, но не имеющие Fc-рецептора [188, 218]. Уничтожение опухоли происходит в несколько этапов: присоединения антитела к опухолевому антигену с образованием комплекса, имеющего Fc-фрагмент. Данный комплекс «антиген-антитело» становится видимым для иммунных клеток, имеющих CD 16 (Fc-рецептор), после присоединения рецептора CD 16 к Fc-фрагменту комплекса иммунная клетка разрушает опухолевый комплекс «антиген-антитело». В реакциях ADCC участвуют NK-клетки (разрушают опухолевые клетки через выброс перфоринов, гранзимов или запуска Fas-зависимого апоптоза) и макрофаги (разрушают опухоль посредством свободных радикалов, токсических оксидов азота и выработки фактора некроза опухоли - а) [22, 104, 225].
Анализ програ мм ранней диагностики в России и Нидерландах
В лабораторный этап исследования (анализ биологии опухолей) включены парафиновые блоки опухолей 518 российских и голландских больных с РМЖ I стадии; российские пациентки (п=315) получили лечение в РОНЦ и Клинике РМАПО с 1985 по 2010 гг., голландские пациентки (п=203) получили лечение в LUMC с 1985 по 2009 гг.
Были изучены следующие клинические данные: возраст пациенток на момент манифестации болезни, вид локального и системного лечения, время до прогрессирования, рецидивы заболевания (локорегионарные/отдаленные), смерть от рака/от любой причины, выживаемость (безрецидивная, БРВ; общая, ОВ; онкоспецифическая, ОСВ).
Патоморфологическое исследование опухолей российских и голландских женщин выполнено в исследовательской лаборатории LUMC и включало определение гистологического типа и степени злокачественности на цельном опухолевом слайде (hall slide) согласно стандартным морфологическим критериям. Опухолевые маркеры (ER, PR, HER2, КІ67, СОХ2, р53, НС 10, НСА2, HLA-E, HLA-G, Foxp3) были изучены в микрочиповых образцах опухолей (TMA-slide).
В исследовательской лаборатории LUMC опухолевая ткань из представленных блоков российских и голландских женщин была трансплантирована в донорские блоки (tissue micro array, ТМА) с помощью автоматизированной системы ТМА-master (рис. 4).
Парафиновые блоки опухолей были выдержаны при комнатной температуре; затем выполнены срезы опухоли для микроскопической оценки наличия репрезентативной опухолевой ткани (окраска гематоксилин- эозином). Зоны наличия достаточного количества опухолевых клеток были маркированы на стекле с опухолью и, соответственно, обозначены маркером на парафиновом блоке с опухолью (рис. 4а). С помощью автоматизированной системы ТМА-master подготовлены блок-реципиент с множественными отверстиями диаметром 1x7 мм для трансплантации опухолевой ткани. Трансплантация опухолевой ткани из донорского блока в ТМА-блок осуществлялась автоматически с помощью автоматизированной системы ТМА-мастер (рисунок 46). Из каждой опухоли забор опухолевой ткани размером 1x7 мм осуществлен трижды из разных зон с целью повышения результативности и точности анализа и трансплантирован в донорский блок (рис. 4в). Выполнена резка ТМА-блока, толщина среза 4-щп и фиксация ТМА-слайдов (рис. 4г-е). а - маркировка на стекле и парафиновом блоке зоны с достаточным содержанием опухолевой ткани; б - забор опухолевой ткани из донорского блока для трансплантации; в - трансплантация опухолевой ткани в ТМА-блок; г-е - этапы производства ТМА-слайда
Иммуногистохимический анализ. ТМА-слайды, приготовленные из микрочиповых блоков, толщиной 4-щп были подвергнуты депарафинизации раствором ксилола и серийной спиртовой регидратации. Далее слайды были погружены в раствор 0,3% перекиси водорода в течение 10 минут, чтобы блокировать активность эндогенной пероксидазы. Для восстановления антигенности слайды были погружены на 10 минут в буферный раствор Ргеreatment machine (PT-LINK, DAKO, Denmark, pH 6.0) и промыты водой и трижды в буферном растворе PBS. Иммунное окрашивание проводилось с антителами с помощью заданных оптимальных концентраций в течение ночи в инкубационной камере; после инкубации с вторичным антителом antl mouse (Dako Cytomation K4001), далее визуализировались раствором 3,3 -diaminobenzidine. Срезы были окрашены гематоксилином и обезвожены с помощью градуированных спиртов и ксилола. Все препараты окрашивали одновременно во избежание межпробной вариации.
В качестве контроля служила ткань нормального эпителия молочной железы, клетки стромы и лимфоидная ткань (миндалины и селезенка), для контроля экспрессии HLA-E и HLA-G использовалась ткань плаценты.
Для иммуногистохимического анализа использовались следующие антитела: антитела рецепторов эстрогенов (Novocastra NCL-L-ER-6F11, Leica Biosystems, Newcastle Upon Тупе, United Kingdom), рецепторов прогестерона (Clone PgR 636, M3569, DAKO, Glostrup, Denmark), HER2 (HercepTestTM for DAKO autostainer, K5207,DAKO, Glostrup, Denmark), антитела ki67 (Clone MIB-1 M7240,DAKO, Glostrup, Denmark), антитела AntIFOXP3 (236A/E7 ab20034, Abeam, Cambridge, United Kingdom). p53 (антитела p53 Do-7, m7001,DAKO, Glostrup, Denmark), антитела HCA2 и НС 10 любезно предоставлены отделом клинической онкологии LUMC, антитела HLA-E mem-E/02 Clone (sc-51621,Santa Cruz biotechnology, Dallas, Texas), антитела HLA-G 4H84 Clone (sc-21799, Santa Cruz biotechnology, Dallas, Texas), антитела к циклооксигеназы 2 типа (160112; Cayman Chemical Co, Ann Arbor, MI).
Оценка данных иммуногистохимического исследования. Оценка данных иммуногистохимического анализа выполнялась слепым методом двумя независимыми экспертами. Статус ER и PR оценивался полуколичественным методом и определялся су ммой прокрашенных ядер клеток умноженных на интенсивность окрашивания от 0 до 300 по формуле: (0 х процент ядерного не окрашивания) + (1 х % слабо окрашенных) + (2 х % умеренно окрашенных) + (Зх % сильно окрашенных). В соответствии с международными рекомендациями гормонопозитивный статус (ER+ и PR+) трактовался при наличии положительной ядерной экспрессии 1% клеток инвазивного рака.
HER2-CTaryc определено в соответствии с международными морфологическими критериями HercepTest и оценивался как HER2- позитивный статус при HER2-3+ и НЕК2-негативным при HER2- 0 или 1+. При наличии HER2- 2+ в трех исследуемых зонах опухоли (у 12 больных) результат оценивался в соответствии с заключением FISH- анализа.
Экспрессия КІ67 оценивалась по % позитивного окрашивания от общего количества клеток; в соответствии с международными патоморфологическими стандартами КІ67 трактовался как «низкий» при значении 0-19% и высокий при значении 20%.
Экспрессия НС10 и НСА2 оценивалась % соотношением положительных клеток от общего количества клеток; экспрессия считалась негативной при наличии 5% позитивно окрашенных клеток и позитивной при наличии 5-100% окрашенных клеток (рекомендации International HLA and Immunogenetics Workshop). Экспрессия HLA-E и HLA-G определялась полуколичественным методом как су мма мембранного окрашивания клеток умноженных на интенсивность окрашивания от 0 до 300 по формуле: (0 х процент мембранного не окрашивания) + (1 х % слабо окрашенных) + (2 х % умеренно окрашенных) + (Зх % сильно окрашенных). Результат экспрессии HLA-E и HLA-G трактовался как «отрицательный» при отсутствии окрашивания и «положительный» при наличии 1% позитивно окрашенных опухолевых клеток. Экспрессия Foxp3 определялась наличием позитивных клеток (положительная экспрессия) или отсутствием таковых (отрицательная экспрессия). Экспрессия циклооксигеназы 2 типа (СОХ-2) определялась полуколичественным методом; экспрессия трактовалась как «низкая» при значениях медианы и «высокая» при значениях медианы.
Клиническая семиотика и предоперационная диагностика РМЖ I стадии (анализ данных РОНЦ и Клиники РМАПО)
Объем радикальной операции является фактором, значимо влияющим на показатели БРВ, но не отражающимся на показателях ОВ и ОСВ при РМЖ I стадии. Так, у пациенток, перенесших РМЭ, показатели выживаемости составили: 5- и 10-летней БРВ - 87 и 80,3%; 5- и 10-летней ОВ- 93 и 79,3%; 5- и 10-летней ОСВ - 94,1 и 84,6%, соответственно. У женщин после органосохраняющего лечения показатели 5- и 10-летней БРВ были несколько ниже (83,6% и 75,4%, р=0,031), а ОВ и ОСВ аналогичны (5- и 10-летней ОВ - 94 и 82,4%; 5- и 10-летней ОСВ- 95,2 и 85,2%, соответственно, р=0,775 (рис. 21а-в).
Лучевая терапия должна быть неотъемлемой частью органосохраняющего лечения; выполнение радикальной резекции без лучевой терапии приводит к крайне низким показателям 5- и 10-летней БРВ (65,2% и 47,7%). У пациенток после органосохраняющего лечения с ЛТ и у женщин после РМЭ без ЛТ отмечены высокие и идентичные показатели контроля болезни: в группе РР с ЛТ показатели 5- и 10-летней БРВ составили 86,8 и 80,2%, а у пациенток после РМЭ-87,6 и 82,2%, соответственно, р 0,0001. Лучевая терапия после РМЭ не приводит к улучшению показателей 5- и 10-летней БРВ при РМЖ I стадии (85 и 73,5%, соответственно). Выполнение органосохраняющего лечения без ЛТ приводит к значимому ухудшению 5- и 10-летней ОВ (87,1 и 65,1%, соответственно). При
153 других видах локального лечения показатели 5- и 10-летней ОВ были существенно выше: при органосохраняющем лечении с ЛТ - 94,9 и 84,8%, при РМЭ без ЛТ - 93 и 78,9%, при РМЭ с ЛТ - 92,9 и 80,7%, соответственно, р=0,04. Однако, показатели онкоспецифической выживаемости значимо не различались в подгруппах больных с различным локальным лечением, р=0,151, рисунок 21г-е
Проведение «буста» - дополнительного облучения «ложа» удаленной опухоли в дозе 10-16Гр. у 180 больных РМЖ I стадии позволило существенно улучшить контроль болезни. Показатели 5-й 10-летней БРВ у 477 пациенток, которым было выполнено органосохраняющее лечение со стандартной ЛТ в дозе 50Гр на молочную железу, были значимо ниже (84,5 и 75,6%) по сравнению с аналогичными показателями у женщин, перенесших органосохраняющее лечение с облучением всей железы и проведением «буста» - 97 и 89,6%, соответственно, р=0,007. Показатели 5- и 10-летней ОВ при проведении «буста» были максимально высокими (99,3 и 94,6%), а при проведении стандартной лучевой терапии составили 93,5 и 82,2%, соответственно, р=0,018. Однако, проведение «буста» не отразилось на показателях онкоспецифической выживаемости, которые были высоки и идентичны при стандартной лучевой терапии и при применении «буста», р=0,102 (рис. 21ж-и). Таким образом, системное прогрессирование заболевания и риск смерти от РМЖ не зависят от локального контроля болезни, а определяются адъювантным лекарственным лечением, основанным на биологических характеристиках опухоли.
Следует отметить, что среди 50 пациенток, перенесшим органосохраняющее лечение с клипированием «ложа» удаленной опухоли для подведения более точного «буста» не отмечено ни одного рецидива болезни и смерти от РМЖ (время наблюдения 36-60 месяцев). Однако, все эти больные получали лечение после 2010 г. с применением современных адъювантных режимов лекарственной терапии, что могло отразиться на таких абсолютных показателях выживаемости. Истинная прогностическая ценность данной методики станет понятна при накоплении достаточного количества клинических наблюдений и длительной прослеженности за больными.
Проведение адъювантной химиотерапии при РМЖ I стадии позволило существенно улучшить результаты долгосрочного прогноза (р 0,0001). Так, показатели 5- и 10-летней БРВ при проведении адъювантной химиотерапии составили 91,5 и 86,3%; 5- и 10-летней ОВ - 95,6 и 91%; 5- и 10-летней ОСВ- 97,1 и 92,8%, соответственно. Аналогичные показатели при отсутствии адъювантной химиотерапии были достоверно ниже: 5- и 10-летняя БРВ составили 82,6 и 74,2%, 5- и 10-летняя ОВ - 92,8 и 77,8%, 5- и 10-летняя ОСВ - 93,8 и 82,1%, соответственно, р=0,0001 (рис. 22а-в).
Аналогичные преимущества в показателях БРВ, ОВ и ОСВ были отмечены при проведении адъювантной эндокринотерапии у пациенток с гормонопозитивными опухолями. Показатели 5-й 10-летней БРВ при включении адъювантной эндокринотерапии в лечебную тактику были равны 92,1 и 86,2%; 5-и 10-летней ОВ - 96 и 86,8%; 5- и 10-летней ОСВ - 97,3 и 91,8%, соответственно. При отсутствии адъювантной эндокринотерапии показатели отдаленной выживаемости значительно ухудшались: 5- и 10-летняя БРВ снизилась до 77,9 и 69,3%, р=0,0001; 5- и 10-летняя ОВ составила 91,1 и 76,2%, р=0,0001; 5-й 10-летняя ОСВ - 92 и 79,5%, соответственно, р=0,0001 (рис. 22г-е).
Наиболее существенное снижение показателей выживаемости было отмечено у пациенток без адъювантного системного лечения, р 0,0001: 5- и 10-летняя БРВ составила всего 75,9 и 66,6%, 5- и 10-летняя ОВ - 90,2 и 73,3%, р 0,0001; 5- и 10-летняя ОСВ - 91,2 и 77,7%, соответственно, р 0,0001 (рис. 22ж-и).
Прогностическое значение различных режимов химиотерапии. Преимущество антрациклин-содержащих комбинаций (AC, FAC, FEC и др) перед безантрациклиновыми (режим CMF) было отмечено при анализе БРВ, ОВ и ОСВ у больных с РМЖ I стадии. Различия в выживаемости отмечены уже в первые 3 года и достигают максимума к 7-летнему периоду наблюдения (7-летняя БРВ составила 91,5% при режимах с антрациклинами и 69,5% при безантрациклиновых режимах, р=0,002. Аналогичная разница получена при анализе 7-летней ОВ (95 vs 78,3%, р=0,011) и ОСВ (7-летняя ОСВ при адъювантнои терапии антрациклинами составила 98,6%; при режиме CMF -78,3%, р=0,008) (табл. 11).
Анализ прогностического влияния режимов с таксанами при РМЖ I стадии не проводился ввиду небольшого числа наблюдений и недостаточного времени прослеженности за пациентками (всего 11 женщин в подгруппе с таксанами и 7 пациенток, получивших лечение антрациклинами и таксанами, прослежены более 158 36 месяцев; этих данных недостаточно для корректного статистического анализа). Окончательное прогностическое значение этих режимов химиотерапии при РМЖ I стадии станет понятно в будущем при достаточном количестве пациенток и сроках наблюдения за ними.