Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Циркулирующие ДНК и РНК: биологическая роль 12
1.1.1. Горизонтальный перенос информации 12
1.1.2. Внеклеточные ДНК и РНК как продукты распада 14
1.2. Циркулирующие ДНК и РНК: маркеры опухоли 16
1.2.1. Концентрация ДНК 18
1.2.2. Размеры фрагментов 19
1.2.3. Генные мутации 21
1.2.4. Аберрантное метилирование 22
1.2.5. Потеря гетерозиготности 23
1.2.6. Вирусные нуклеиновые кислоты 23
1.2.7. Циркулирующие РНК 24
1.3. Жидкостная биопсия: проблемы 25
2. Материалы и методы 26
2.1. Выделение нуклеиновых кислот 26
2.2. Полимеразная цепная реакция 27
2.3. Секвенирование 27
2.4. Электрофорез ДНК 28
3. Результаты исследования 29
3.1. Изотахофорез нуклеиновых кислот 30
3.1.1. Теоретическое обоснование метода 3 0
3.1.2. Практическая реализация метода
3.1.3. Количественная экстракция нуклеиновых кислот 3 4
3.1.4. Выводы 39
3.2. Количественная денситометрия ДНК 40
3.2.1. Материалы и методы 40
3.2.2. Результаты 41
3.2.3. Выводы 44
3.3. Сопоставление методов выявления мутаций 45
3.3.1. Материалы и методы 4 5
3.3.2. Результаты 50
3.3.3. Выводы 54
3.4. Опухоли полости рта: циркулирующие вирусные ДНК 56
3.4.1. Материалы и методы 5 7
3.4.2. Результаты 59
3.4.3. Выводы 65
3.5. Сателлитные РНК как маркеры опухолевого роста 66
3.5.1. Материалы и методы 67
3.5.2. Результаты 70
3.5.3. Выводы 79
4. Обсуждение 80
Выводы 83
Публикации 84
Список литературы
- Циркулирующие ДНК и РНК: маркеры опухоли
- Вирусные нуклеиновые кислоты
- Секвенирование
- Сопоставление методов выявления мутаций
Циркулирующие ДНК и РНК: маркеры опухоли
Упорядоченную утилизацию клеточных «отходов» обеспечивает, кроме того, белок плазмы крови SAP (serum amyloid Р component), который при физиологических условиях связывается с хроматином, солюбилизирует его (замещая гис-тон HI) и защищает от нуклеаз. Физиологическая роль этого белка состоит, видимо, в регуляции распада хроматина и предотвращении аутоиммунных реакций [63,64].
В серии работ последнего времени показано, что циркулирующие ДНК существуют в двух формах: в свободном состоянии (именно к нему, видимо, применимы перечисленные выше наблюдения) и в ассоциации с клеточной поверхностью. Эти альтернативные формы характерны, соответственно, для опухолевых и нормальных клеток, что представляет большой интерес как с фундаментальной, так и практической точек зрения [65-68]. Внеклеточные ДНК, ассоциированные с клеточной поверхностью, характерны именно для раковых, но не нормальных, клеток поджелудочной железы. В экспериментах прижизненного биолюминисцентного видеоизображения ксенографтов человеческих клеток мышам показано, что внеклеточные ДНК играют роль стимулятора воспаления, инвазии и метастазирования (предварительная обработка клеток ДНКазой I устраняла эти эффекты). Установлена положительная обратная связь между присутствием на клеточной поверхности ДНК и секрецией воспалительного хемокина CXCL8 [6 9]. Механизм и физиологический смысл переходов внеклеточной ДНК из свободного в ассоциированное с клеточной поверхностью состояние требуют дальнейших исследований.
В контексте исследований рака особенно важен и интересен факт обнаружения в крови онкологических больных нуклеиновых кислот «опухолевого» происхождения (мутантных онкогенов и генов-супрессоров, измененных микроса-теллитных последовательностей, аберрантно метилированных CpG-островков в промоторах генов-супрессоров, мРНК и микроРНК). Первоначально эта возможность по ряду причин казалась крайнє маловероятной. Вследствие постоянного обновления тканей в организме взрослого человека ежесуточно погибает (претерпевает апоптоз) 10п клеток [7 0]. Это обстоятельство делает превышение нормальных аллелей над мутантными в плазме крови столь значительным, что выявление последних кажется практически недостижимым (следует учесть также относительно небольшую, сравнительно с организмом, массу опухоли; присутствие в ней нормальных клеток стромы и крови; клональную гетерогенность опухоли, в силу которой тот или иной маркер может присутствовать не у всех, а лишь у некоторых опухолевых клеток). Кроме того, цДНК, «разбавленная» большим объемом крови, присутствует в ней в очень низкой концентрации. Ситуацию еще более осложняет факт реутилизации тканями организма основной массы внеклеточной ДНК, что было ранее установлено в экспериментах на животных [71,72]. И, наконец, в крови и моче присутствуют нуклеазы [22, 7 3,74], вызывающие фрагментацию свободных молекул [70,75,76].
Вопреки ожиданиям «опухолевые» нуклеиновые кислоты выявлены у онкологических больных как в крови [25,36,77-79], так и в моче («трансреналь-ные» ДНК) [71,7 5,8 0-8 5]. Более того, выявление феномена потери гетерозигот-ности (Loss Of Heterozygocity, LOH) в цДНК больных опухолями головы, шеи и легких [3,4] показало, что доля «опухолевой» фракции в ДНК крови в ряде случаев может быть значительной (иначе невозможно было бы обнаружить отсутствие одного из двух аллелей в малой субпопуляции мутантных молекул на фоне большого избытка молекул дикого типа - с обоими аллелями). Действительно, при оценке разными способами «опухолевой» фракции цДНК установлено, что она часто вполне ощутима, варьирует в широких пределах и источником ее являются нормальные и опухолевые, апоптотические и некротические клетки [4 6,8 6,8 7].
Доля «опухолевых» молекул может варьировать в широких пределах (от незначительной до преобладающей) в зависимости от стадии онкологического процесса (и, соответственно, от размера опухоли) [4 6,8 7]). Их концентрация в крови определяется балансом двух противоположных процессов: поступления в кровоток (в силу клеточной секреции и клеточному распаду, апоптотическому и/или некротическому [4 6]) и выведения из кровотока (из-за нуклеазного распада, реутилизации, поглощения клетками печени и выведения почками [82]). В результате клиренс цДНК, судя по данным экспериментов на животных и по клиническим наблюдениям, обычно очень эффективен (время ее полу-жизни составляет 15 мин [71]), хотя в некоторых случаях, при снижении функциональных способностей организма, может составлять несколько часов [8 8].
В клинике исследование циркулирующих в крови молекул проводят с целью диагностики и мониторинга опухолевого роста, используя все нуклеиновые кислоты безотносительно к их происхождению и биологической роли. Существующие методы не позволяют подразделить эту чрезвычайно гетерогенную и сложную в функциональном и структурном отношении популяцию на отдельные субфракции. Выделение циркулирующих молекул сводится обычно к осаждению клеток (и иногда митохондрий) низкоскоростным центрифугированиием, депро-теинизации супернатанта и сорбции нуклеиновых кислот на гранулах кремния («glass milk») в среде хаотропных агентов.
Соответственно генетическим нарушениям, которые обусловливают раковую трансформацию клетки, диагностически значимые маркеры, обнаруживаемые в циркулирующей ДНК, подразделяются на несколько типов: а) мутации онкогенов и генов-супрессоров, б) потеря гетерозиготности, в) аберрантное метилирование CpG-островков, г) изменения микросателлитных локусов. Кроме того, важным показателем некротического клеточного распада (присущего опухолям из-за перманентной гипоксии) может служить увеличение размеров (целостности) циркулирующей в крови ДНК.
Вирусные нуклеиновые кислоты
В разделе представлены стандартные молекулярно-биологические методы, использованные на протяжении всей работы. Описание методов и экспериментальных условий, имеющих отношение к конкретному разделу диссертации, а также разработанных нами оригинальных методических подходов представлено в соответствующих главах.
Объект исследования: удаленная хирургическим путем нормальная и опухолевая ткань (10 больных аденокарценомой прямой и толстой кишки) и образцы крови онкологических больных (48 раком носоглотки, 9 раком толстой кишки, 78 больных ДОПР), проходивших лечение в ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина», а также образцы крови 120 здоровых доноров.
Для выделения ДНК из тканей и клеток крови использовали стандартную депротеинизацию фенолом и хлороформом [14 4]. Плазму крови (1-3 мл) инкубировали с 100 мкг/мл протеиназы К, 0,5% саркозила, 10 мМ Tris-HCl, рН 8,0, и 5 мМ ЭДТА (конечные концентрации) ночь при 50С, после чего депротеинизиро-вали фенолом-хлороформом до исчезновения интерфазы. Осаждали ДНК двумя объемами этанола с гликогеном в качестве соосадителя. ДНК промывали 70%-ным этанолом, охлаждённым во льду. После испарения этанола растворяли осадок в буфере ТЕ. Хранили при - 20С.
Концентрацию ДНК определяли двумя методами: спектрофотометричес-ким (Nano-Drop 1000; Thermo Scientific, USA) или спектрофлуориметрическим (Plate Reader Chameleon V multilabel counter, Hidex Oy, Turku, Finland с красителем SYBR Green I).
В работе использовали стандартную ПЦР, ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ), а также ПЦР с последующим плавлением ампликонов в режиме высокого разрешения (HRMA, High Resolution Melting Analysis).
Для ПЦР-РВ использовали интеркалирующие флуоресцентные красители (SYBR Green I, EvaGreen) или гидролизуемые зонды TaqMan. Реакцию (в объеме 25 мкл) проводили в 0,2-мл микропробирках Эппендорф в 96-луночных приборах iQ5 Realime PCR detection system или CFX96 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Состав инкубационной смеси: 67 мМ Tris-HCl, рН 8.8, 16,6 мМ (NH SO , 0,25% Твин 20, 3 мМ MgCl2, 0,2 мМ dNTPs, 0,1 мкМ каждого из праймеров (Син-тол, Москва), 10-100 нг ДНК, 1 ед. Тад-полимеразы с ингибирующими активность фермента антителами (система «горячего старта», Синтол, Москва). Условия ПНР определялись в зависимости от особенностей синтезируемого ампликона (см. соответствующие разделы диссертации).
По завершении амплификации ДНК прогревали при 95С 3 мин, охлаждали (скорость охлаждения 2С/с) и выдерживали при 40С 3 мин, после чего плавили от 50С до 90С (шаг 0,5С, выдержка 25 с, скорость нагрева 3,3С/с). Результаты анализировали с использованием программы iQ5 Optical System software (v. 2.1) или Bio-Rad Precision Melt Analysis 80Й\аге.Полученные данные в ряде случаев экспортировали в Microsoft Excel и нормализовали по отношению к максимальному по величине пику плавления, принимаемому за 100%.
Специфические условия амплификации в реальном времени и плавления ампликонов представлены в соответствующих разделах диссертации.
Секвенирование ампликонов проводили в ЗАО Синтол (Москва) с помощью набора реактивов ABI PRISM BigDye Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3100-Avant. Обработку данных секвенирования проводили с помощью программ Sequence Scanner v. 1.0 и Vector NTI. 2.4. Электрофорез ДНК
ДНК разделяли в геле 1,5-2,5% агарозы на 1х ТАЕ-буфере (2 мМ трис-НС1 рН 7,8, 0,25 мМ ацетат Na, 1 мМ ЭДТА) в присутствии интеркалирующего красителя - бромистого этидия (1 мкг/мл). Разделение вели при напряжении электрического тока 5 В/см.
ДНК разделяли в 8-10% ПЛАТ (45 mM Tris-borate, рН 8, 1 тМ EDTA) 4 ч при 100 В и комнатной температуре. Гели окрашивали разными красителями (SYBR Gold в разведении 1:10000, SYBR Green І в разведении 1:10000, бромистый этидий - 0,5 мкг/мл). В качестве маркеров использовали фрагменты ДНК определенного размера (DNA ladder, Fermentas).
Секвенирование
Для клинической генодиагностики рака необходимы простые, чувствительные и высокопроизводительные методы мутационного сканирования нуклеотид-ных последовательностей, предварительно амплифицированных в ПЦР [15 9-161]. В данной работе ряд тестов выявления мутаций сопоставлен с секвенирова-нием по Сэнгеру («золотой стандарт» клинического генотипирования): RFLP (restriction fragments length polymorphisms) [162], SSCP (Single Strand Conformation Polymorphisms) [163], однонитевой SSCP [164], MRCA (Non-Isotopic RNA Cleavage Assay) [165], HRMA (High Resolution Melting Analysis) [16 6,167]. Объектом сравнения служили 10 образцов ДНК, выделенных из ткани рака толстой кишки, онкоген K-RAS которых предварительно секвенировали методом Сэнгера. Обнаружены следующие мутации: в ко доне 12 (образцы № 1, 5, 6 и 7: GGT - GTT) и в кодоне 13 (№ 8: GGC GAC).
Клинические образцы (хирургически удаленные опухоли и окружающая их нормальная ткань) получены от 10 больных аденокарциномами прямой и толстой кишки, проходивших лечение в ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина». ДНК выделяли методом фенольно-хлороформенной депротеинизации. ПЦР. Фрагмент гена K-RAS размером 157 п.о., содержащий кодоны 12 и 13, амплифицировали с использованием праймеров K-RAS (L) и K-RAS (R): (табл. 1). Условия амплификации: начальная денатурация 95С 5 мин, затем 35 циклов -94С 40 с, 56С 40 с, 72С 40 с.
RFLP (restriction fragments length polymorphisms) [162]. Праймеры K-RAS (L) и K-RAS (R) модифицированы таким образом, чтобы создать в обоих искусственные сайты рестрикции BstNl в последовательности дикого типа (мутация ко дона 12 один из этих сайтов уничтожает, тогда как другой позволяет контролировать полноту рестрикции). После ПНР ампликоны обрабатывали рест-риктазой BstNl и разделяли электрофорезом в 10% ПААГ. ДНК окрашивали бромистым этидием (0,5 мкг/мл). Мутантный фрагмент имеет размер 142 п.о., последовательность дикого типа - 113 п.о. SSCP (Single Strand Conformation Polymorphisms) [163]. Ампликоны ДНК размером 157 п.о. денатурировали 0,15 N NaOH, после чего разделяли в 10% ПААГ 5 ч при 10С и 400 В (-20 В/см). Гели окрашивали SYBR Gold.
Однонитевой SSCP [164]. Во избежание частичной ренатурации ДНК, неизбежной в стандартном SSCP, комплементарные нити исследовали раздельно, для чего использовали асимметричный ПЦР. Синтез плюс- или минус-нити на матрице ампликона K-RAS вели на протяжении 30 циклов ПНР в описанных выше условиях в присутствии только одного из двух праймеров: K-RAS (L) или K-RAS (R), соответственно. В ряде случаев использовали праймеры T7-RAS (L) или Т7-RAS (R), имеющие на 5 -конце дополнительную последовательность, что позволяло вести реакцию при повышенной температуре (68С) и тем самым минимизировать синтез неспецифических продуктов. Однонитевые молекулы очищали электрофорезом в 10% ПААГ.
NIRCA (Non-Isotopic RNA Cleavage Assay) [165]. Поскольку в оригинальной работе дано лишь принципиальное описание NIRCA без методических деталей, а коммерческий набор фирмы Ambion уже не производится, мы вынуждены были наладить метод NIRCA, опираясь лишь на разрозненные сведения в патентной документации (патенты США № 5589329 и № 5891629), а также личную переписку с автором (М. Goldrick). Метод включает ряд этапов (схема на рис. 8): А) ПЦР проводили в реакционной среде (25 мкл), содержащей 5 мкл ДНК, 0,2 мкМ праймеров Tl-RAS (L) и Tl-RAS (R), 1,5 ед Pfu полимеразы, 200 мкМ dNTP, 10 мМ (NH4)2S04, 2 мМ MgS04, 20 мМ Tris-HCl (рН 8,8), 10 мМ КС1, 0,1% Triton Х-100, 0,1 мг/мл БСА. Условия амплификации - 94С 1 мин, 57С 1 мин, 72С 1 мин (35 циклов). Праймеры Tl-RAS (L) и T1-RAS содержат на 5 -конце последовательность промотора РНК-полимеразы фага Т7 (выделена курсивом) (табл. 1) Б) Синтез РНК in vitro: к 1 мкл ампликонов, полученных на предыдущей стадии, прибавляли 1,2 мкл 5-кратного транскрипционного буфера (200 мМ Tris-С1, рН 8, 40 мМ MgCl2, 10 mM спермидин, 250 мМ NaCl), 1,2 мкл смеси четырех rNTP (2,5 мМ каждого), 2 мкл РНК-полимеразы фага Т7 (20 ед/мкл), 1,5 мкл ингибитора РНКазы (20 ед/мкл). Реакцию вели 1 ч при 37С. Пробы обрабатывали ДНКазой 1(10 ед/мкл) 5 мин при 37С. В) Гибридизация: к смеси, полученной на предыдущем этапе, прибавляли 0,25 объема 30 мМ ЭДТА (рН 8), инкубировали 5 мин при 95С, после чего охлаждали до комнатной температуры (при отжиге комплементарных нитей РНК только дикого типа образуются гомодуплексы; в присутствии в среде также мутантных молекул образуются гетеродуплексы с неспаренными основаниями). Г) Гидролиз дуплексов РНКазами I и ТІ: к 10 мкл смеси, полученной на предыдущем этапе, прибавляли 24 мкл раствора, содержащего 32 мг/мл Bactoryptone (Difco), 100 мкг/мл бромистого этидия, РНКазу I (0,005 ед/мкл) и РНКазу ТІ (90 ед/мкл), и инкубировали 30 мин при 37С. Д) Электрофорез: дуплексы РНК разделяли в 10% ПААГ, приготовленном на 0,5х Трис-фосфатном буфере, 10 ч при 5 В/см и комнатной температуре (обнаружение в опыте фрагментов, отсутствующих в контроле, указывает на мутацию).
HRMA (High Resolution Melting Analysis) [16 6,167]. Фрагмент K-RAS размером 55 п.о. амплифицировали посредством ІГЦР-РВ на приборе Bio-Rad iQ5 с красителем SYBR Green I (разведение 1:75000). Инкубационная среда (25 мкл) ПНР включала 67 мМ Tris-HCl, рН 8,8, 16,6 мМ (NH4)2S04, 0.25% Tween-20, 3 мМ MgCl2, 0,2 мМ dNTPs, 0,1 мкМ каждого из праймеров KRAS-55-(L) и KRAS-55-(R) (табл. 1), 100 нг ДНК, 1 ед. Taq полимеразы. Условия ПЦР: денатурация при 95С 5 мин, 10 циклов при 95С 10 с и 50С 20 с, затем 30 циклов при 95С 10 с и 58С 20 с. Ампликоны прогревали 3 мин при 95С, выдерживали 3 мин при 40С и плавили от 50С до 90С (шаг 0.5С, выдержка 25 с). Данные, полученные посредством iQ5 Optical System software, экспортировали в Microsoft Excel и пики плавления (отрицательную первую производную кривой плавления) нормализовали по отношению к максимальному значению, принятому за 100%.
Сопоставление методов выявления мутаций
Полученные результаты свидетельствуют, во-первых, о присутствии в плазме крови здоровых и больных людей некодирующих гетерогенных РНК, транскрибируемых на перицентромерных сателлитных повторах HSATII и GSATII, и, во-вторых, о существовании между этими популяциями реципрокных отношений (у здоровых доноров превалирует одна популяция, у больных - другая). Интересно отметить, что эти отношения диаметрально противоположны тем, что существуют внутри клеток (см. [193] и рис. 17 данной работы). Этот факт может указывать на появление в плазме крови транскриптов GSATII и HSATII не только вследствие клеточного распада, при котором соотношения GSATII/HSATII внутри и вне клетки должны быть близки, но и как результат активной клеточной секреции (возможно, в составе экзосом). Кроме того, следует учесть, что хотя вклад опухолевых клеток в общую популяцию циркулирующих молекул зачастую непропорционально велик, нормальные клетки также могут принимать участие в ее формировании. Таким образом, снижение уровня транскриптов HSATII в плазме онкологических больных может быть следствием измененного метаболизма как самих опухолевых клеток, так и нормальных клеток, находящихся под воздействием опухоли.
Циркулирующие сателлитные РНК, существование которых впервые показано в этой работе, могут представлять интерес и как возможные участники горизонтального переноса генетической информации, и как потенциальные маркеры опухолевого роста. Детальное изучение их свойств является предметом дальнейших исследований.
Клональная гетерогенность опухолей, с одной стороны, и необходимость мониторинга опухолевых клонов и после удаления первичного очага, с другой, ставят в качестве первоочередных задач совершенствование методов «жидкостной биопсии», позволяющей идентифицировать опухолевые маркеры среди циркулирующих в крови нуклеиновых кислот.
Любое исследование нуклеиновых кислот начинается с их выделения -этапа весьма ответственного, поскольку возможные здесь потери, особенно избирательные, чреваты искажением конечных результатов. Поскольку существующие подходы, основанные в основном на адсорбции нуклеиновых кислот на поверхности кварцевых частиц в среде хаотропных агентов, в этом отношении несовершенны [210] и сопряжены с потерей значительной части материала (в особенности низкомолекулярных фрагментов), в настоящей работе была предпринята попытка разработать метод, гарантирующий полное выделение и очистку нуклеиновых кислот из биологических жидкостей организма (в том числе из плазмы крови), причем в количествах, достаточных для последующего анализа. Использованный нами принцип капиллярного изотахофореза в геле полужидкой агарозы позволяет, как оказалось, добиться этой цели: все разновидности нуклеиновых кислот (однонитевые и двунитевые ДНК, РНК, фрагменты ДНК большого и малого размера) концентрируются без каких-либо избирательных потерь в объеме 10-15 мкл (выход приближается к 100%). На этом этапе, кроме того, достигается очистка нуклеиновых кислот от компонентов плазмы крови, обладающих иной, чем у нуклеиновых кислот, электрофоретической подвижностью, что позволяет использовать их без дополнительных манипуляций в различных ферментативных реакциях (в частности, в ПНР).
Применение ИТФ в сочетании с разработанным нами методом количественной денситометрии позволило подтвердить существующие в литературе данные о повышении содержания ДНК в плазме крови онкологических больных (на контингенте больных раком полости рта, в том числе раком носоглотки). В последующем этот результат был подтвержден нами с использованием спектрофлуорометрического метода.
Описанный метод выделения был применен в данной работе для жидкостной биопсии опухолей полости рта, в частности рака носоглотки (РНГ), этиологическим фактором которого является вирус Эпштейна-Барр. Наряду с определением в плазме крови этой группы онкологических больных последовательностей вирусной ДНК методом ПНР в реальном времени определяли также серологические показатели - титры антител к капсидному антигену вируса. Выявленные сдвиги соответствуют тем, что отмечены в эндемичных районах Китая и Гонконга (имеются в виду характерное для РНГ повышение титров IgA-антител и присутствие в плазме крови последовательностей вирусной ДНК). Последний показатель является, как показано нашими исследованиями, чувствительным и специфическим средством мониторинга заболевания (а именно, маркером эффективности терапии и рецидива опухоли). Обнаруженное явление гетероморфных профилей плавления вирусных ампликонов у некоторых (не у всех) больных РНГ заслуживает отдельного специального исследования.
Жидкостная биопсия онкологических больных предполагает поиск многих разновидностей маркеров, в том числе и наиболее распространенный их тип -генные мутации. Нами был предпринят сравнительный анализ нескольких наиболее употребительных методов сканирования мутаций (RFLP, SSCP, NIRCA, Surveyor, HRMA) с точки зрения их применимости в клинической практике. Общий вывод из этой части работы состоит в том, что ферментативные методы, основанные на расщеплении неспаренных оснований в гетеродуплексах неполностью комплементарных РНК (в методе NIRCA) или ДНК (в методах RFLP и Surveyor), малопроизводительны и недостаточно специфичны, а физический метод SSCP -слишком трудоемок и требует длительных предварительных исследований. Все они значительно уступают физическому методу HRMA, основанному на плавлении ампликонов, в производительности, удобстве, затрате времени и труда. Использование HRMA при анализе ампликонов, полученных посредством ПЦР фрагментов ДНК из плазмы крови больных РНГ, позволило обнаружить неизвестное ранее явление - их полиморфизм у некоторых из исследованных больных. Природа этого полиморфизма будет исследована в нашей дальнейшей работе.
Особый интерес с точки зрения жидкостной биопсии различных форм рака представляет обнаруженный недавно феномен аберрантной гиперэкспрессии пе-рицентромерных сателлитных последовательностей ДНК. В нашей работе была предпринята первая попытка оценить диагностическую значимость этого широко распространенного свойства трансформированных клеток. Разработанный нами протокол количественной ОТ-ПЦР сателлитных РНК HSATII и GSATII был апробирован вначале на культивируемых клетках и показал свою адекватность поставленной задаче. При его посредстве в плазме крови человека были впервые обнаружены оба типа сателлитных РНК, соотношения которых, как оказалось, значительно различаются у здоровых людей и онкологических больных (рак толстой кишки). Эти обнадеживающие с диагностической точки зрения результаты будут верифицированы в наших дальнейших исследованиях больных с другими формами онкологических заболеваний.