Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы
1.1. Развитие концепции генной терапии 18
1.2. Пути реализации генной терапии 21
1.3. Генно-терапевтические подходы к лечению злокачественных новообразований .
1.4. Подходы к генной терапии для коррекции токсических реакций, вызванных консервативными методами лечения
Глава II. Материалы и методы исследований
11.1. Материалы исследования 83
11.2. Объекты исследования 86
11.3. Аналитические и иммунохимические методы анализа 88
11.4. Клинико-лабораторные исследования 94
11.5. Методы экспериментальных исследований в системе in vitro 95
11.6. Методы экспериментальных исследований в системе in vivo 97
Результаты собственных исследований
Глава III. Доклиническое изучение лекарственного средства на основе генно-терапевтической конструкции, содержащей гены тимидинкиназы вируса простого герпеса HSVtk и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора GM-CSF, в невирусной системе доставки
111.1. Оценка продукции целевых белков - HSVtk и h(m)GM-CSF в 107 клетках, трансфицированных HSVtk-h(m)GM-CSF-РРТ
111.2. Оценка биологической активности фермента HSVtk и цитокина GM-CSF в системе in vitro
111.3. Изучение фармакокинетики модельного лекарственного средства на основе HSVtk-mGM-CSF-РРТ в организме животных по продукции фермента HSVtk
111.4. Изучение специфической (противоопухолевой) активности 123 лекарственных средств на основе HSVtk-m(h)GM-CSF-РРТ в системе in vivo
111.4.1. Разработка эффективного режима применения модельного лекарственного средства на основе HSVtk-mGM-CSF-РРТ в сочетании с пролекарством GCV на модели перевиваемой опухоли у животных – саркомы S37
111.4.2. Исследование вклада гена mGM-CSF в составе модельного лекарственного средства на основе HSVtk-mGM-CSF-РРТ в реализацию противоопухолевого действия in vivo
111.4.3. Определение спектра противоопухолевой активности фармакологического и модельного лекарственных средств на моделях перевиваемых опухолей мышей и человека, чувствительных к противоопухолевой генной терапии III.
4.3.1 Оценка противоопухолевой активности модельного лекарственного средства на основе HSVtk-mGM-CSF-PPT при GCV на моделях иммунокомпетентных эффективности средства на основе пролекарства системном введении пролекарства перевиваемых опухолей мышей уживотных
III.4.3.2. Оценка противоопухолевой фармакологического лекарственного средства на основе HSVtk-hGM-CSF-PPT при системном введении GCV на ксенографтах опухолей человека
111.4.1. Оценка противоопухолевой эффективности комбинированной генной и химиотерапии у экспериментальных животных
111.4.2. Оценка противоопухолевой эффективности комбинированной генной и лучевой терапии у экспериментальных животных
III.5. Общетоксическое действие фармакологического лекарственного средства на основе генно-терапевтической конструкции HSVtk-hGM-CSF-РРТ
111.5.1. Определение потенциального токсического действия 166 фармакологического лекарственного средства на основе HSVtk-hGM-CSF-РРТ при его однократном подкожном введении мышам и крысам («острая» токсичность)
111.5.2. Определение потенциального токсического действия фармакологического лекарственного средства на основе HSVtk-hGM-CSF-РРТ в сочетании с пролекарством GCV в составе препарата Цимевен при их однократном введении крысам («острая» токсичность)
111.5.3. Определение потенциального токсического действия фармакологического лекарственного средства а на основе HSVtk-hGM-CSF-РРТ при его многократном подкожном введении крысам («хроническая» токсичность)
111.6.1. Оценка морфологических изменений в культивируемых клетках мыши и человека, трансфицированных HSVtk-m(h)GM-CSF-РРТ, после воздействия GCV
111.6.2. Оценка морфологических изменений в тканях подкожных имплантатов саркомы мыши S37 после лечения HSVtk-mGM-CSF-РРТ в сочетании с GCV
Обсуждение результатов 184
Глава IV. Изучение генно-терапевтического лекарственного средства на основе рекомбинантного аденовируса 5 серотипа, обеспечивающего продукцию рекомбинантного лактоферрина человека
IV.1. Характеристика генно-терапевтического лекарственного средства Ad5-hLf как продуцента целевого белка in vitro
IV.2. Оценка биологической активности рекомбинантного rhLf в системах in vitro и ex vivo
IV.3. Изучение фармакокинетики генно-терапевтического лекарственного средства Ad5-hLf по продукции целевого белка в организме животных
IV.4. Изучение специфической активности (детоксицирующего действия) генно-терапевтического лекарственного средства Ad5-hLf в системе in vivo
IV.4.1 Оценка детоксицирующего действия конструкции на основе 213
Ad5-hLf на модели токсикоза у животных, индуцированного четыреххлористым углеродом (CCL4)
IV.4.2. Оценка детоксицирующего действия Ad5-hLf на модели токсикоза у животных, индуцированного цитостатиком
IV.4.3. Изучение влияния Ad5-hLf на животных с эндотоксикозом, вызванным ростом экспериментальных опухолей
IV.5. Общетоксическое действие препарата АдеЛакт на основе генно-терапевтического лекарственного средства Ad5-hLf
IV.5.1. Определение потенциального токсического действия препарата АдеЛакт при его однократном внутривенном введении мышам и крысам («острая» токсичность)
IV.5.2. Определение потенциального токсического действия препарата АдеЛакт при его многократном внутривенном введении крысам и кроликам («хроническая» токсичность) Обсуждение результатов 232
Глава V. Методология изучения препаратов для генной терапии 240
V.1. Характеристика препаратов для генной терапии как продуцентов биологически активных рекомбинантных белков
V.2. Изучение фармакокинетики препаратов для генной терапии 244
V.3. Изучение фармакологической активности (фармакодинамики) препаратов для генной терапии
V.4. Токсикологические исследования препаратов для генной 254
терапии
Выводы 258
Практические рекомендации 261
Список использованной литературы
- Генно-терапевтические подходы к лечению злокачественных новообразований
- Методы экспериментальных исследований в системе in vitro
- Изучение фармакокинетики модельного лекарственного средства на основе HSVtk-mGM-CSF-РРТ в организме животных по продукции фермента HSVtk
- Определение потенциального токсического действия препарата АдеЛакт при его многократном внутривенном введении крысам и кроликам («хроническая» токсичность) Обсуждение результатов
Генно-терапевтические подходы к лечению злокачественных новообразований
В современной биотехнологии для эффективной работы терапевтический ген снабжают сигнальными (регулирующими) элементами, которые необходимы для синтеза полноценной мРНК и целевого белка, а также позволяют управлять специфичностью экспрессии в определенном типе клеток, длительностью функционирования и нужной регуляцией гена в клетке [Wang D., 2013].
Специфичность экспрессии генов в заданной клетке достигается конструированием векторов, несущих терапевтические гены под контролем промоторов, работающих только в данном типе клеток. К настоящему моменту выявлен ряд тканеспецифичных промоторов, обеспечивающих селективную экспрессию терапевтических трансгенов в клетках определенных органов. В экспериментальной генной терапии сердечно-сосудистых заболеваний в настоящее время используют промоторы, которые обеспечивают преимущественную экспрессию трансгена в миокарде (SM22- промотор и др.) [Akyurek L.M., 2000]. Для экспрессии трансгенов в нейрональной ткани используют промотор бета-цепи тромбоцитарного фактора роста PDGF в сочетании с энхансером ранних генов CMV в составе вектора на основе плазмиды или вируса [Wang S., Pat. US US 7341847B2]. Ряд промоторов, специфичных для эндотелия сосудов, таких как, промоторы генов FLT-1, молекулы клеточной адгезии-2, ангиопоэтина-2, тромбоцитарной молекулы адгезии клеток эндотелия-1, эндоглина используют для экспрессии трансгена в сосудах [White S.J., 2008]. При конструировании векторов, применение которых направлено на терапию заболеваний респираторного тракта (муковисцидоз, астма, эмфизема, отек легких, рак легкого) используют промоторы убиквитина - гена, активно экспрессирующегося в легких [Charles H.S., Pat WO 2001091800 A1; Johansen Т.Е., Pat WO 1998032869 A1, Yew N.S., 1997; Gazdhar A., 2006].
Разработан целый ряд тканеспецифичных промоторных систем, в которых использованы гены, высоко экспрессированные, главным образом, в опухолевых клетках (табл.2): простат-специфический и проcтат-специфический мембранный антигены при раке предстательной железы [Lee S.J., 2002], гены, кодирующие сурфактантные белки А и В, при раке легкого [Smith M.J., 1994; Strayer M.S., 1998], ген мембрано-связанного муцина MUC1/DF3 при раке молочный железы, трахеи, легкого, тонкого или толстого кишечника [Moehle C., 2006], ген -фетопротеина - белка, синтезируемого в печени, при раке печени [Kuriyama S., 1991], промоторы гена сурвивина человека (hSurv) и гена обратной транскриптазы теломеразы человека (hTERT), обеспечивающих экспрессию трансгена в клетках широкого спектра опухолей [Van Houdt W.J, 2006; Gu J., 2003].
Опухолеспецифичные промоторы Локализация опухоли Промотор Обозначение ЖКТ, легкое, молочная железа Раково-эмбриональный антиген СЕА Печень Альбумин -фетопротеин AFP Ряд опухолей Мидкин-гепарин-связывающий фактор как продукт ретиноподобного распознавания опухоли МК Рак предстательной железы Простат-специфический антигенПробастинПростат-специфический мембранныйантиген PSAPBPSMA Рак легкого Андрогенный элемент Белки сурфактантов гРВSP-A, SP-B Раки эпителиальногопроисхожденияМиелома Мембрано-связанный муцин MUC1/DF3 Молочная железа, легкое,кишечник, яичники, голова ишеяНеходжкинские лимфомы Сурвивин- член семейства IAP белок, ингибирующий апоптоз hSurv ОстеосаркомаРяд эпителиальных опухолей Теломераза-РНК-зависимая ДНК-полимераза: промотором выступает каталитическая субъединица hTERT hTERT
Промотор цитомегаловируса (CMV) - один из широко используемых промоторов вирусного происхождения. В частности для создания рекомбинантного аденовирусного вектора, лишенного генов Е1/Е3 и обеспечивающего экспрессию терапевтического гена CD40L человека, используют CMV промотор. Эффективность работы этого промотора демонстрируется в ряде работ, проведенных в экспериментальных исследованиях на моделях рака мочевого пузыря [Loskog A., 2005], рака простаты [Dzojic H., 2006], меланомы [Euler H., 2008; Westberg S., 2013], мастоцитомы и колоректального рака [Loskog A., 2007].
Среди других промоторов вирусного происхождения можно выделить промоторы гена gD и gH вируса простого герпеса (HSV-1), которые усиливают экспрессию генов гранулоцито-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и интерлейкина-2 (IL-2), соответственно, в составе вектора на основе вируса HSV-1 [Boursnell M.E.G., Pat. US 6287557 B1).
Поскольку тканеспецифичные промоторы обладают общим недостатком -низким уровнем экспрессии гетерологичных генов [Yew N.S., 1997], а также ограниченной областью применения, обусловленной их тканеспецифичностью, а промоторы вирусной природы быстро инактивируются в тканях человека в результате метилирования [Brooks A.R., 2004], и являются иммуногенными [Cordier L., 2001], то в настоящее время идет активный поиск промоторов генов человека, не обладающих тканевой специфичностью - универсальных или гибридных промоторов, направленных исключительно на пролиферирующие клетки и не затрагивающих нормальные дифференцированные клетки.
Одной из сложнейших проблем в генной терапии является доставка требуемого гена в нужные ткани при минимизации его контакта с биологическими средами организма до достижения клетки-мишени, а также обеспечение доставки гена в нужную клетку с целью его эффективной и безопасной работы в ней.
Методы экспериментальных исследований в системе in vitro
Исследователи не наблюдали выраженных побочных эффектов, вызванных аденовирусной доставкой трансгенов. Кроме того у пациентов, получавших лечение, отмечали ремиссию в течение двух лет без назначения паллиативной гормонотерапии [Freytag S.O., 2003, 2007].
Известно, что 5-FC, обладая высоким тропизмом к бактериальной цитозиндезаминазе (bCD), которая присутствует, в том числе, в клетках нормального эпителия кишечника, может преобразовываться в них в 5-FU, что приводит к повреждающему действию здорового эпителия. Для преодоления токсического действия известен опыт замены bCD на дрожжевую уCD, однако этот фермент термолабилен и при 370С теряет свои свойства [Johnson A.J., 2011]. Для преодоления этого препятствия предпринимаются попытки получения термостабильных мутантных форм фермента [Stolworthy T.S., 2005].
В настоящее время инициировано несколько протоколов клинических испытаний у пациентов с рецидивирующей или прогрессирующей глиомой после ее резекции (https://clinicaltrials.gov/; NCT01156584, NCT01470794, NCT01985256). Эти исследования направлены на оценку безопасности и переносимости возрастающих доз Toca 511, реплицирующегося ретровирусного вектора, со встроенном геном уCD, кодирующим дрожжевой термостабильный фермент уCD, который вводят в ложе опухоли после хирургического удаления опухоли. Результаты клинических испытаний пока не опубликованы, а данные доклинических исследований демонстрируют эффективность и безопасность терапии Toca 511 на фоне перорального приема пролонгированного 5-FC [Perez O.D., 2012; Stedt H., 2013].
Несмотря на то, что спектр клинических испытаний достаточно ограничен, исследователи продолжают работу, направленную на увеличение эффективности этого метода лечения злокачественных новообразований с применением системы CD/5-FC.
Для повышения специфичности к пролекарству в настоящее время разрабатываются мутантные варианты бактериальной bCD, которые были успешно протестированы в системе in vivo [Kaliberova L.N., 2008; Deng L.Y., 2011; Fuchita M., 2009]. L.N. Kaliberova с соавторами показали на экспериментальной модели рака толстой кишки человека превосходство мутантной формы D314A над CD, что выражалось в значительном повышении противоопухолевой активности.
Для увеличения эффективности конверсии пролекарства 5-FC в токсичные метаболиты используют гибридный ген FCU1, состоящий из гена FCY1 и гена урацилфосфорибозилтрансферазы дрожжей (FUR1). Белок FUR1 – фермент, катализирующий превращение 5-FU в наиболее токсичные для клетки метаболиты, что приводит к значительно более эффективной продукции цитотоксических веществ в клетках-мишенях. Показано, что использование гибридного гена FCY1-FUR1 (FCU1) обеспечивает более выраженный цитотоксический эффект [Shi D.Z., 2007; Erbs P.,2000].
Другой подход заключается в сочетании генов CD с геном GM-CSF. В работе Finocchiaro [Finocchiaro, 2008] in vivo продемонстрировано, что эффективность генной терапии возрастает, если в опухолевые клетки вводить ген фермента совместно с геном GM-CSF, который способен стимулировать рост, развитие и дифференцировку гранулоцитов, макрофагов и антиген-представляющих клеток, обеспечивая индукцию иммунного ответа.
В настоящее время накоплен значительный материал о роли фермента нитроредуктазы E.coli (NTR) в активации противоопухолевого препарата 5-(азиридин-1-ил)-24-динитробензамид (CB1954). В результате метаболизма CB1954 образуется мощный ДНК хелатирующий агент, свободно диффундирующий в окружающие клетки, который способен вызывать серьезные повреждения ДНК в делящихся и неделящихся клетках [Greco O., 2001]. Это побудило многих исследователей к созданию генно-терапевтических конструкций с геном бактериальной NTR. На культурах опухолевых клеток и на модели рака поджелудочной железы было продемонстрировано, что опухолевые клетки, трансдуцированные вирусным вектором со встроенным геном NTR, продуцируют фермент, под действием которого из пролекарства CB1954 образуются токсические агенты, обладающие высоким цитотоксическим потенциалом [McNeish I.A., 1998; Djeha A.H., 2000].
Изучение фармакокинетики модельного лекарственного средства на основе HSVtk-mGM-CSF-РРТ в организме животных по продукции фермента HSVtk
К настоящему моменту на фармацевтическом рынке уже присутствуют препараты на основе rhLf, однако ни один из них не одобрен для системного введения в организме человека из-за их структурной несовместимости [Conesa, C., 2009]. Известно, что первичная и вторичная структура рекомбинантных белков, полученных в биотехнологических системах, идентичны с нативным белком, но процесс гликозилирования, который во многом определяет его свойства и биологическую активность, в этих системах делает конечный продукт не полностью совместимый из-за значительных изменений в углеводной структуре белка [Marth J.D., 2008; Shental-Bechor D., 2009]. В частности, рекомбинантный rhLf, где в качестве продуцентов белков используют растительные клетки или клетки дрожжей, характеризуется содержанием в структуре белка остатков N-связанных гликанов маннозы, которые обладают свойствами иммуногенов, что приводит к ограничению его использования при системном введении человеку.
Известен препарат Talactoferrin alfa (Agennix,США) на основе рекомбинантного rhLf, полученного в клетках гриба Aspergillus awamori, предназначенный для перорального применения. Это препарат прошел II фазу клинических испытаний у больных с тяжелым сепсисом. Результаты этого исследования показали, что в группе больных тяжелым сепсисом (n=190), получавших перорально Talactoferrin alfa летальность составила 15 %, в то время как у получавших плацебо – 29 %. Этот эффект достигался независимо от тяжести течения заболевания; у наиболее тяжелой категории больных летальность в группе Talactoferrin alfa была на 71 % меньше, чем в группе плацебо [http://www. Agennix.com]. Также завершена II фаза клинических исследований у больных немелкоклеточным раком легкого IIIB/IV стадии, которые получали Talactoferrin alfa на фоне химиотерапии. В настоящее время эти исследования приостановлены ввиду того, что характер и частота побочных эффектов, вызванных химиотерапией, не отличались в группах больных, получавших Talactoferrin alfa/плацебо в комбинации с химиотерапией.
Слабую эффективность препарата связывают с изменением биологической активности рекомбинатного белка, полученного в бактериальной системе, так как известно, что вследствие отличий в механизмах пост-трансляционной модификации в клетках низших и высших эукариотических организмов, полученный белок структурно и функционально отличается от природного аналога. Более того, испoльзование грибoв Aspergillus для прoдукции рекомбинантных белков связано с высоким риском загрязнения афлатоксинами, являющимися потенциальными канцерогенами [Choi S.M., 2003].
Кроме того, существенным препятствием к практическому использованию белковых или ферментативных препаратов, независимо от способа их получения, является нестабильность во внеклеточных жидкостях и быстрая элиминация при внутривенном введении, а соответственно, для поддержания терапевтически эффективной концентрации требуется их систематическое введение пациентам каждые 12-24 часа.
В настоящее время препараты на основе hLf пролонгированного действия отсутствуют во всем мире. В 2007г появилось сообщение о начале разработки препарата на основе микрочастиц хитозана, нагруженных hLf, для постепенного высвобождения белка в ротовой полости или кишечнике после перорального приема, однако препарат не был зарегистрирован [Onishi H., 2007]. В 2010г нами были проведены исследования по получению высокомолекулярных комплексов hLf с полисахаридами [Mestechkina N.M., 2011]. Однако оценка антиоксидантной активности hLf в составе этих комплексов не выявила преимущества по сравнению с неиммобилизованным гликопротеином, поэтому разработка препарата на их основе была сочтена нецелесообразной.
Новым подходом к решению данной проблемы может стать доставка и длительная экспрессия гена целевого белка непосредственно в организме, осуществляемая вектором, в состав генома которого включен ген hLf, обеспечивающий длительную, но транзиторную продукцию рекомбинантного белка в организме.
Таким образом, обзор мировой литературы показывает, что в онкологии к настоящему моменту сформировалось ряд стратегий генной терапии, направленных как на различные звенья патогенеза злокачественных новообразований, так и на купирование осложнений, возникающих при лечении традиционными методами.
Несмотря на достигнутые успехи в области генной терапии большинство ген-направленных лекарственных средств находится на стадии научных, экспериментальных и клинических исследований. К настоящему моменту только три противоопухолевых генных препарата Gendicine, Oncorine и IMLYGICTM получили статус официнальных, а большинство лекарственных средств для детоксицирующей генной терапии находятся на фазе разработки или испытаний, что свидетельствует о существовании ряда трудностей как в создании препаратов, так и доказательстве их эффективности и безопасности в доклинических исследованиях, которые являются важным шагом на пути продвижения в клиническую практику.
Традиционные подходы, используемые для исследования фармакологической активности и безопасности лекарственных средств, не могут в полной мере подходить для генных препаратов. Причиной этого являются уникальность, конструктивные особенности, разнообразие биологических свойств, в частности, видоспецифичность, иммуногенность и особый механизм действия. Вышесказанное свидетельствует, что проблема разработки подходов к оценке эффективности и безопасности крайне актуальна. Решение этой проблемы позволит оптимизировать доклиническое изучение их специфической активности и безопасности, и дать адекватные рекомендации для дальнейших клинических испытаний.
Определение потенциального токсического действия препарата АдеЛакт при его многократном внутривенном введении крысам и кроликам («хроническая» токсичность) Обсуждение результатов
Анализ литературы, приведенный в Главе I «Обзор литературы» настоящей работы, показал, что одной из наиболее перспективных стратегий противоопухолевой генной терапии является суицидная генная терапия, которая основана на введении в опухолевые клетки гена, продуцирующего фермент, способный трансформировать мало токсичное для клеток соединение в высоко токсичное, приводя к их гибели.
С момента первого эксперимента по генной терапии достигнуты определенные успехи: получены генные конструкции для доставки суицидных генов, продемонстрирована эффективность in vivo ряда препаратов, оценена их безопасность и начаты клинические испытания. Однако III фазы достигли только 45 клинических испытаний и к настоящему моменту ни один из исследуемых препаратов не получил одобрения для клинического использования [Karjoo Z., 2016].
Ряд исследователей признает, что воздействуя на конкретный механизм с помощью генных лекарственное средств, удается блокировать то или иное звено регуляции злокачественного роста [Патутина О.А., 2009; Hanahan D., 2011]. Однако важной особенностью опухолевого процесса является развертывание каскадов регуляции выживаемости клетки, которые позволяют ей ускользать от моногенного воздействия. Поэтому эффективность генной терапии онкологических заболеваний может быть повышена путем комбинированного подхода к лечению с применением генного лекарственного средства, включающего два или более терапевтических гена, действующих на разные мишени опухолевого роста.
Коллективом сотрудников под руководством академика РАН Е.Д.Свердлова была создана бицистронная конструкция HSVtk-GM-CSF-PPT, объединившая два терапевтических гена в одной экспрессирующей плазмиде: ген HSVtk, который обусловливает возникающее внутри опухоли химиотерапевтическое воздействие за счет образования в клетках токсичных соединений с последующей их диффузией в соседние клетки, и ген GM-CSF, продукт экспрессии которого способен стимулировать рост, развитие и дифференцировку гранулоцитов, макрофагов и антиген-презентирующих клеток, обеспечивая индукцию специфичного противоопухолевого иммунного ответа. Плазмида для доставки в опухолевые клетки была упакована в невирусную систему - блок-сополимер, представляющую собой конъюгат полиэтиленгликоля (PEG) и полиэтиленимина (PEI) c ТАТ-пептидом GRKKKRRQRC, фрагментом ТАТ-белка [Патент № 2013148606].
Поскольку разработанное лекарственное средство HSVtk-GM-CSF-PPT в своем составе содержит терапевтический ген GM-CSF, кодирующий целевой продукт, который обладает видовой специфичностью, то для доклинических исследований была разработана конструкция, в состав которой входит ген, кодирующий гомологичный белок, специфичный для соответствующего вида животного, что позволило провести эксперименты на релевантных животных (мыши). Так как известно, что использование нерелевантных моделей может привести к снижению фармакологической активности в связи с иммуноопосредованным механизмом элиминации продукта экспрессии гена. Поэтому доклинические исследования проводили с использованием модельного лекарственного средства - HSVtk-mGM-CSF-РРТ, содержащего ген mGM-CSF мыши на моделях перевиваемых опухолей мышей, и с применением фармакологического лекарственного средства с геном hGM-CSF человека -HSVtk-hGM-CSF-РРТ на ксенографтах опухолей человека.
Настоящий раздел исследований посвящен изучению медико-биологических свойств лекарственных средств на основе HSVtk-m(h)GM-CSF-PPT, оценке их специфической (противоопухолевой) активности и безопасности. плоскоклеточного рака кожи человека А431, карциномы слизистой оболочки полости рта человека КВ с использованием специфических антител к HSVtk. Уровень продукции цитокина m(h)GM-CSF мыши и человека определяли методом ИФА в кондиционной среде, полученной при культивировании клеток НЕК293, трансфицированных конструкциями в комплексе с Lipofectamine 2000 (Invitrogen, США) в лаборатории структуры и функций генов человека и функций генов человека и в отделе иммунологии ФГБУ ИБХ им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН к.б.н. И.В.Алексеенко и д.б.н. Е. В. Свирщевской.
Для иммуноцитохимического выявления HSVtk клетки саркомы мыши S37, плоскоклеточного рака кожи человека А431, карциномы ротовой полости человека КВ трансфицировали модельным и фармакологическим лекарственным средством HSVtk-m(h)GM-CSF-PPT в течение 24-х, 48-ми и 72-х часов.
Специфическое окрашивание с ПКА к HSVtk наблюдали примерно в 25% клеток. В большинстве клеток в большей или меньшей степени окрашивался примембранный компонент, в отдельных клетках - слабо или с умеренной интенсивностью окрашивалась цитоплазма. При этом четко прослеживался мелкодисперсный или гранулярный характер внутриклеточного распределения окрашивания. Единичные клетки отличались особенно высокой интенсивностью иммунопероксидазного окрашивания. Относительное количество клеточных элементов, окрашенных специфической иммунопероксидазной реакцией, существенно выше при инкубации клеток с лекарственного средствами в концентрации 1 мгк/мл, чем при концентрации - 0,5 мкг/мл. Примеры иммунохимического окрашивания цитологических образцов с антителами к HSVtk представлены на рис.10 и 11.