Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 17
1.1. Опухолеассоциированные макрофаги и их связь с опухолевой прогрессией 17
1.1.1 Опухолевое микроокружение в разных подтипах рака молочной железы и рака толстого кишечника 21
1.2. Макрофаги как источник хитиназо-подобных белков 28
1.2.1 Классификация и источники хитиназо-подобных белков 28
1.2.2 Роль ХПБ в опухолевой прогрессии 32
1.2.3 Влияние ХПБ на ангиогенез и хемотаксис 33
1.3 Взаимодействие ОАМ и противоопухолевой химиотерапии 35
1.4 Иммунотерапевтические подходы, которые могут улучшить противоопухолевый эффект химиотерапии 40
Глава 2. Материалы и методы исследования 45
2.1 Характеристика клинического материала 45
2.2 Характеристика модельной системы ОАМ и клеточных линий 50
2.3 Антитела для иммунохимических методов окрашивания 52
2.4 Морфологическое и иммуногистохимическое исследование 52
2.5 Иммунофлюоресцентный анализ и конфокальная микроскопия 54
2.6 Тест на эндоцитоз и проточная цитометрия 55
2.7 ПЦР в режиме реального времени 55
2.8 Секвенирование нового поколения и биоинформатический анализ данных 59
2.9 Методы статистической обработки данных 60
Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 61
3.1 Ассоциация экспрессии маркеров макрофагов с проявлениями опухолевой прогрессии рака молочной железы и рака толстого кишечника 61
3.2 Взаимосвязь экспрессии ХПБ и эффективности НАХТ 71
3.3 Оценка влияния химиотерапевтического агента цисплатина на выживаемость и воспалительный профиль ОАМ 77
3.4 Анализ влияния цисплатина на транскрипционную программу модельных ОАМ рака молочной железы и рака толстого кишечника 89
3.5 Валидация результатов секвенирования нового поколения при помощи ПЦР в режиме реального времени 104
3.6 Изучение экспрессии маркеров ответа ОАМ на цисплатин в опухолевой ткани молочной железы и рака толстого кишечника in situ 106
3.7 Цисплатин подавляет клиренс компонентов микроокружения опухолеассоциированными макрофагами 111
Заключение 124
Выводы 133
Практические рекомендации 134
Список литературы 136
- Опухолеассоциированные макрофаги и их связь с опухолевой прогрессией
- Иммунотерапевтические подходы, которые могут улучшить противоопухолевый эффект химиотерапии
- Взаимосвязь экспрессии ХПБ и эффективности НАХТ
- Цисплатин подавляет клиренс компонентов микроокружения опухолеассоциированными макрофагами
Опухолеассоциированные макрофаги и их связь с опухолевой прогрессией
Ключевыми клетками иммунной системы, которые определяют внутриопухолевый иммунный статус и взаимодействие опухолевых клеток с иммунным компонентом микроокружения, являются опухолеассоциированные макрофаги (ОАМ) [148]. Существует два основных направления фенотипической и функциональной поляризации макрофагов: классически активированные провоспалительные М1 макрофаги с противоопухолевыми свойствами и альтернативно активированные противовоспалительные М2 макрофаги с проопухолевыми функциями. В большинстве солидных опухолей ОАМ имеют ярко выраженный М2 фенотип, который поддерживает рост первичной опухоли и распространение метастазов [189]. Однако существуют также экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что ОАМ могут сочетать свойства М1 и М2 макрофагов [14]. Влияние ОАМ на прогрессию опухоли может зависеть от типа опухоли, типа опухолевого микроокружения и локализации ОАМ в конкретных внутриопухолевых компартментах [134, 140, 218]. Перепрограммирование М2 фенотипа макрофагов в направлении провоспалительного М1 фенотипа признано в качестве перспективного терапевтического подхода для лечения опухолей [104].
ОАМ происходят из двух основных источников: (а) тканевые резидентные макрофаги, которые являются долгоживущими и образуются из эмбриона (желточный мешок), и (б) макрофаги из циркулирующих моноцитов, которые происходят из костного мозга и рекрутируются в опухолевую ткань под воздействием факторов роста и хемокинов, таких как M-CSF, CCL2 и CCL5 [103]. Микроокружение опухоли влияет на программирование как резидентных, так и инфильтрирующих макрофагов в фенотип ОАМ. Считается, что резидентные макрофаги первыми перепрограммируются в проопухолевый фенотип растущей опухолью [103]. ОАМ, происходящие из резидентных макрофагов, могут опосредовать повреждение ДНК, трансформацию и выживание трансформированных клеток и поддерживать связанное с опухолью воспаление. Моноциты/макрофаги, рекрутируемые в опухолевый сайт, способствуют пролиферации и выживанию опухолевых клеток, а также ангиогенезу и метастазированию.
Значительное количество данных указывает на проопухолевую функцию макрофагов, что было показано на различных экспериментальных моделях и в клинических исследованиях [164]. В солидных опухолях ОАМ могут стимулировать рост первичной опухоли, индуцировать ангиогенез, лимфангиогенез, ремоделирование стромы, метастазирование и иммуносупрессию [21, 133]. ОАМ экспрессируют молекулы, которые непосредственно влияют на пролиферацию опухолевых клеток, включая эпидермальный фактор роста (EGF), члены семейства факторов роста фибробластов (FGF) и трансформирующий фактор роста бета (TGF) [14, 169].
Способность ОАМ вызывать прогрессию опухоли и ускоренный рост сосудов опосредована повышенной регуляцией и высвобождением нескольких проангиогенных факторов, таких как фактор роста эндотелия сосудов A (VEGF A), фактор некроза опухоли (TNF), FGF, тимидин фосфорилазу (TP), урокиназный активатор плазминогена (uPA), адреномедуллин (ADM) и семафорин 4D (Sema4D) [133, 169]. ОАМ продуцируют несколько факторов, которые ответственны также за индукцию лимфангиогенеза, включая VEGF-C, VEGF-D, VEGF-A, MMP2, MMP9, CXCL8 и многие другие [21, 133, 169]. ОAM обеспечивают ремоделирование стромы, инвазию опухолевых клеток и метастазирование, путем высвобождения ряда ферментов, в том числе плазмина, uPA, матриксных металлопротеиназ (MMP), катепсина B, тромбоцитарного фактора роста (PDGF) и TGF-1 [21, 133]. ОAM также секретируют множество цитокинов и хемокинов, таких как CCL3, CCL4, CCL5, CCL22, TGF и IL10, которые рекрутируют натуральные регуляторные T-клетки (nTreg) в микроокружение опухоли и подавляют эффекторные функции CD4+ и CD8+ T-клеток [148, 164].
Про-опухолевая функция ОАМ была продемонстрирована для многих типов злокачественных новообразований, таких как рак молочной железы, аденокарцинома легкого, рак шейки матки, рак яичников, рак предстательной железы, меланома, почечно-клеточный рак печени и рак пищевода [32, 129, 130, 217, 221, 225]. Однако, имеется множество экспериментальных клинических данных, свидетельствующих о двойственной роли ОАМ в прогрессии опухоли; также была показана и противоопухолевая активность ОАМ. Например, M. Bogels и соавторы показали, что про- или противоопухолевая активность макрофагов зависит от типа опухоли [21]. Так, клетки карциномы молочной железы индуцируют секрецию толерогенных цитокинов в макрофагах, происходящих из моноцитов человека, тогда как клетки карциномы кишечника стимулируют секрецию про-воспалительных цитокинов [21].
CD68 является маркером плохого прогноза и снижения выживаемости при многих типах опухолей, включая немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ), рак яичников, рак желудка, меланому и рак молочной железы. При НМРЛ плотность инфильтрирующих опухоль CD68-экспрессирующих макрофагов отрицательно коррелирует с выживаемостью пациентов и положительно коррелирует с экспрессией про-опухолевого IL-8, который может способствовать усилению ангиогенеза в опухоли [32]. Высокие уровни CD68-позитивных инфильтрующих ОАМ при раке желудка были связаны с метастазированием и плохим прогнозом и коррелировали с особенностями эпителиально-мезенхимального перехода (ЭMП) (потеря E-кадгерина и повышенная активность виментина) [225]. В ткани меланомы большое количество макрофагов CD68+ было связано с ухудшением прогноза и высокой смертностью [130]. Противоречивые данные были найдены для экспрессии CD68 у пациентов с РМЖ. У пациентов с трипл-негативным РМЖ с большим количеством инфильтрирующих CD68+ ОАМ наблюдался высокий риск отдаленных метастазов и низкие показатели безрецидивной выживаемости и общей выживаемости [221]. В другом исследовании опухолей молочной железы, большое количество CD68+ макрофагов было достоверно ассоциировано с низкой выживаемостью и более коротким периодом безрецидивной выживаемости [129]. Исследование 100 образцов РМЖ продемонстрировало значительную связь инфильтрации CD68+ ОАМ со стадией TNM и размером опухоли, а обильная инфильтрацией ОАМ в опухолях молочной железы коррелировала с плохим исходом и снижением общей выживаемости [217]. С другой стороны, средний балл экспрессии CD68 оказался ниже в случаях с метастазированием в лимфатические узлы в группах пациентов с РМЖ как без НАХТ, так и после НАХТ [27, 140].
Противоположные результаты, свидетельствующие о противоопухолевом действии макрофагов, были продемонстрированы для рака толстого кишечника (РТК), где ОАМ обладают провоспалительными свойствами и экспрессируют ряд цитокинов, таких как IFN-, IL-1 и IL-6, которые активируют цитотоксические Th1-клетки, опосредуя противоопухолевый иммунный ответ [32, 150]. В исследовании 446 пациентов с РТК, Forsell J и коллеги показали, что высокий уровень CD68+ ОAM, локализованных на границе опухоль/строма, коррелировал с более высокой выживаемостью при раке толстой кишки [57]. В другом исследовании 208 пациентов с РТК, большое количество ОАМ было связано с лучшими показателями безрецидивной и общей выживаемости, независимо от лимфогенного метастазирования и сосудистой инвазии [131].
Несколько независимых клинических исследований продемонстрировали, что фенотип M2 макрофагов связан с плохой выживаемостью у пациенток с РМЖ, раком яичников, раком желудка, почечно-клеточным раком, гепатоцеллюлярной карциномой, множественной миеломой и остеосаркомой [35, 113, 136, 188, 215, 216, 224, 226]. CD206 и CD163 являются наиболее часто используемыми биомаркерами для гистологической идентификации M2-фенотипа ОАМ в опухолевой ткани [218]. Zhang et al. показали, что уменьшение количества CD206+ ОAM при раке желудка было связано с более длительным периодом выживаемости без прогрессии, что можно считать значительным прогностическим фактором [215]. Положительная корреляция между инфильтрацией CD206+ ОAM и низкой выживаемостью была обнаружена для рака яичников, почечно-клеточной карциномы и гепатоцеллюлярной карциномы [216]. Аналогично, повышенная плотность CD163+ макрофагов была обнаружена на поздних стадиях рака яичников, множественной миеломы, рака желудка, рака молочной железы, остеосаркомы и положительно коррелировала с худшей безпрогрессивной и общей выживаемостью [35, 113, 136, 216, 226].
Иммунотерапевтические подходы, которые могут улучшить противоопухолевый эффект химиотерапии
В основном, химиотерапия применяется для уничтожения опухолевых клеток или ингибирования их роста. Однако резистентность к химиотерапии часто ограничивает цитотоксический эффект лекарств в опухоли. Иммунная система, особенно ОАМ, значительно способствует химиорезистентности; таким образом, истощение М2-подобных ОАМ или их перепрограммирование в М1-подобный фенотип может повысить эффективность лечения и может стать эффективным инструментом для снижения риска рецидивирования опухоли. Понимание сложного взаимодействия между опухолевыми клетками и иммунной системой обеспечивает возможность создания новых терапевтических подходов для улучшения противоопухолевого эффекта у пациентов, получающих химиотерапию.
В настоящее время все большее число исследований сосредоточено на комплексных терапевтических подходах в лечении рака, включая активацию иммунной системы для повышения эффективности ЦТЛ против опухолевых клеток, блокаду контрольных точек, ингибирование молекул иммуносупрессоров. Например, недавнее открытие анти-PD-1, анти-PD-L1 и анти-CTLA-4 агентов продемонстрировало их значительные преимущества в достижении выживаемости пациентов с метастазами.
Макрофаги экспрессируют лиганды ингибиторных рецепторов – белка запрограммированной клеточной гибели (PD-1) и цитотоксического антигена 4 T-лимфоцитов (CTLA-4), которые обычно активируются в иммунных эффекторных клетках, таких как T-клетки, B-клетки и NKT-клетки. Активация PD-1 и CTLA-4 их лигандами (PD-L1, PD-L2 и B7-1 [СD80], B7-1 [CD86], соответственно) напрямую ингибирует ответную реакцию на Т-клетки и В-клетки путем подавления пролиферации и продукции цитокинов [148].
Экспериментальные исследования и клинические испытания продемонстрировали положительный эффект комбинации химиотерапии и иммунотерапии. Breedveld показал, что при РМЖ общая частота ответа на ХТ была значительно выше в группе пациентов, получавших трастузумаб (моноклональные антитела против HER-2) и химиотерапию [25]. Weir et al. продемонстрировали, что комбинированное лечение с использованием противораковой вакцины на основе пептида класса I, метрономной химиотерапии циклофосфамидом (mCPA) и антител против PD-1, увеличивает клональность и активность опухоль-инфильтрирующих антиген-специфических Т-клеток в мышиной модели опухоли, экспрессирующей HPV16 E7 (C3) [207]. Soares et al. также предположили, что иммуносупрессивные пути, в том числе регуляторные Т-клетки (Treg) и экспрессию иммунной контрольной точки CTLA-4 на Т клетках, можно ингибировать путем добавления вакцины или низкой дозы циклофосфамида к PD-1 блокаде [190].
B7-H4 является членом суперсемейства B7, который экспрессируется на ОАМ и участвует в супрессии Т-клеток. Блокирование B7-H4 или истощение B7-H4+ ОAM может представлять собой новую стратегию в терапии опухолей для повышения Т-клеточного иммунитета [102, 148]. Было обнаружено, что при раке яичника человека ингибирование B7-H4 способствует регрессии опухоли [102].
Несколько исследований продемонстрировали положительный эффект от подавления рекрутирования макрофагов в опухоль. Так, было показано, что блокада CSF-1 ограничивает макрофагальную инфильтрацию и улучшает реакцию ксенотрансплантатов рака молочной железы у мышей на воздействие химиотерапией [8, 153]. Было обнаружено, что паклитаксел улучшает выживаемость у мышей с опухолями молочной железы в сочетании с блокадой рекрутирования макрофагов с помощью CSF1R антагонистов путем подавления прогрессирования опухоли и уменьшения метастазирования в легкие [43, 44]. Обнаружено, что истощение ОАМ повышает эффективность паклитаксела в опухолях молочной железы в модельных MMTV-PyMT мышах и комбинированной химиотерапии (циклофосфамид, метотрексат и 5-фторурацил) в ксенотрансплантатах РМЖ у мышей с иммунодефицитом [44]. Генетический нокаут CSF-1, использование нейтрализующих антител, низкомолекулярных ингибиторов или анти-смысловой РНК для ингибирования передачи сигналов CSF-1R снижают агрессивность опухолевых ксенотрансплантатов, что связано с отсутствием ОАМ в опухоли [7, 164, 212]. В мышиных моделях опухоли поджелудочной железы ограничение инфильтрации опухоли макрофагами путем ингибирования CSF1R или CCR2 повышает эффективность терапии гемцитабином и уменьшает количество метастазов за счет активации противоопухолевых ответов Т-клеток.
Было установлено, что комбинация снижения количества ОАМ в опухоли и химиотерапии снижает плотность сосудов на 50%. Истощение ОАМ в опухоли может нормализовать стенку сосудов путем превращения периваскулярных ОАМ из клеток с проангиогенными свойствами в клетки с ангиостатическими свойствами, что приводит к улучшению кровотока и, таким образом, доставке химиотерапевтических агентов в опухоль, способствуя ее разрушению [43].
Фактор роста эндотелия сосудов A (VEGF-A) привлекает клетки предшественники макрофагов, которые затем под влиянием IL-4 дифференцируются в ОАМ [123]. Удаление таких макрофагов из опухоли ингибирует рост, ангиогенез и инвазию опухоли. Снижение лимфангиогенеза может быть достигнуто путем ингибирования активности макрофагов за счет блокирования VEGF-C/VEGFR3 в опухолях, подвергшихся химиотерапии [10].
Duhamel M и коллеги продемонстрировали новую терапевтическую стратегию, сочетающую действие паклитаксела и ингибирование пропротеин конвертазы 1/3 (PC1/3), для переключения макрофагов в направлении противоопухолевого фенотипа [50]. Подход, основанный на комбинированном лечении MMTV-PyMT мышей паклитакселом и ингибитором c-kit рецептора тирозинкиназы (PLX3397), продемонстрировал значительное уменьшение первичной опухоли, снижение плотности CD31+ сосудов в опухолях молочной железы и активацию цитотоксических эффекторных Т-лимфоцитов, по сравнению с лечением одним паклитакселом [50].
Понимание механизмов взаимодействия ОАМ с химиотерапевтическими агентами в специфическом для опухоли контексте может привести к предполагаемому использованию макрофагов и других компонентов микроокружения опухоли в качестве мишеней для терапевтической эффективности за счет ингибирования роста опухоли и снижения риска метастазирования [71].
Функциональная «переориентация» макрофагов на противоопухолевый фенотип запускает каскад событий, приводящий к нарушению экосистемы, способствующей росту опухоли, что приводит к блокированию пролиферации опухолевых клеток, их метастатического потенциала и созданию условий для достижения определенного соотношения между опухолью и организмом хозяина, приводящего к ингибированию прогрессирования заболевания. Таким образом, понимание фундаментально важной роли ОАМ в определении эффективности противоопухолевой цитостатической терапии открывает перспективы разработки новых терапевтических подходов к лечению злокачественных новообразований на основе сбалансированного синергетического действия цитостатических агентов и инновационных иммуномодулирующих подходов [148, 191].
Взаимосвязь экспрессии ХПБ и эффективности НАХТ
Далее была проанализирована связь субпопуляций макрофагов, ассоциированных с ХПБ, в опухоли с эффективностью предоперационной химиотерапии. Так, у больных РМЖ с предоперационной химиотерапией балл экспрессии YKL-39 и SI-CLP оказался выше у пациенток с отсутствием объективного ответа на НАХТ (стабилизация или прогрессирование заболевания) (1,83±0,91, N=24, и 2,16±0,93, N=31, соответственно) по сравнению с группой с объективным ответом (полная или частичная регрессия) (1,38±0,8, N=21, p=0,044, и 1,67±0,94, N=28, р=0,034, соответственно). Изучение экспрессии ХПБ в разных компартментах опухоли в зависимости от ответа на НАХТ показало, что экспрессия YKL-39 в нежно-волокнистой строме увеличивалась при отсутствии объективного ответа у пациенток с РМЖ (2,64±1,15, N=11) по сравнению с группой с объективным ответом на НАХТ (1,42±1,13, N=7, р=0,02). Эти данные указывают на то, что локализация YKL-39-позитивных макрофагов именно в нежно-волокнистой строме вносит вклад в эффективность химиотерапии.
Полученные для YKL-39 результаты коррелируют с опубликованными ранее результатами, которые продемонстрировали, что генная экспрессия YKL-39 в опухоли после НАХТ была статистически значимо выше у пациенток с отсутствием объективного ответа на НАХТ по сравнению с группой с частичной регрессией (2,26±1,1 против 0,34±0,14, р=0,043) [126]. Кроме того, было показано, что YKL-39 является сильным хемоаттрактантом для моноцитов и про ангиогенным фактором [126]. Видимо, данные функции белка активируются в условиях химиотерапии, что способствует отсутвию объективного ответа на химиотерапию у пациентов. Различные исследования показывают, что противоопухолевая терапия вызывает рекрутирование моноцитов в опухолевый сайт, в котором располагаются поврежденные химиотерапией клетки, и который макрофаги рассматривают как незаживающую рану, подлежащую восстановлению [152]. В этом случае инфильтрирующие опухоль макрофаги запускают регенеративную программу, которая поддерживает пролиферацию опухолевых клеток [211].
Кроме того, при помощи конфокальной микроскопии для YKL-39 было показано, что белок экспрессируется в М2 макрофагах в опухоли молочной железы, но не в опухолевых клетках. YKL-40, близкий гомолог YKL-39, может продуцироваться как опухолевыми клетками, так и макрофагами [98, 175]. Для идентификации типов клеток, которые экспрессируют YKL-39 при РМЖ человека, был проведен иммунофлуоресцентный/конфокально-микроскопический анализ образцов опухоли, полученных от 10 пациентов. ОАМ были идентифицированы CD68 и стабилином-1 (маркером М2 макрофагов) (Рисунок 8A и 8Б).
Иммунофлюоресцентный анализ/конфокальная микроскопия экспрессии YKL-39 в образцах РМЖ в различных клетках опухолевого микроокружения: А - стабилин-1-позитивные макрофаги, В - CD68-позитивные макрофаги, С - опухолевые клетки, позитивные по цитокератину AE1/AE3, D CD31+ кровеносные сосуды, E - опухолеассоциированные FAP+ фибробласты.
Шкала баров соответствует 10 М
Экспрессия YKL-39 не была обнаружена на опухолевых клетках, позитивных по цитокератину AE1/AE3, на опухолеассоциированных FAP+ фибробластах или на сосудистых CD31+ клетках (Рисунок 8С-8E). Данные указывают на то, что YKL-39 экспрессируется на ОАМ при раке молочной железы человека, с преобладающей экспрессией стабилин-1+ ОАМ.
Полученные данные вместе с результатами уже опубликованных ранее работ позволяют рассматривать YKL-39 в качестве потенциальной мишени для терапии опухоли, а таргетную терапию на основе YKL-39 можно использовать в сочетании с НАХТ у пациентов с раком молочной железы, для повышения эффекта терапии и снижения риска метастазирования.
При раке толстого кишечника наблюдалась тенденция к повышению экспрессии YKL-39 при наличии объективного положительного эффекта НАХТ по сравнению с плохим ответом (2,42±0,58, N=24 против 1,93±0,86, N=13, p=0,075). Также, у пациентов с РТК с наличием объективного ответа на НАХТ в воспалительном инфильтрате опухоли, расположенном в нежно-волнистой строме, была обнаружена более высокая экспрессия стабилина-1 (2,3±0,73, N=20) по сравнению с опухолями пациентов, не отвечающих на НАХТ (1,5±0,72, N=9, р=0,02).
Для YKL-39 в раке толстого кишечника был проведен аналогичный анализ локализации экспрессии в опухолевой ткани при помощи конфокальной микроскопии и было обнаружено, что YKL-39 экспрессируется в CD68-позитивных ОАМ и в CD3+ Т-лимфоцитах (Рисунок 9).
В группе пациентов с раком толстого кишечника, получавших НАХТ, низкий балл экспрессии CD68 был ассоциирован с более продолжительным периодом выживаемости до прогрессии (медиана 66 месяцев) по сравнению с высокой экспрессией CD68 (3-4 балла) (медиана 51,5 месяцев) (Рисунок 10).
По-видимому, полученные противоречивые результаты при РМЖ и РТК связаны с двойственной ролью макрофагов при этих двух видах рака. Так, ряд исследований продемонстрировал связь большого количества инфильтрирующих CD68+ ОАМ с высоким риском отдаленных метастазов и низкими показателями безрецидивной выживаемости и общей выживаемости при раке молочной железы [32, 129, 130, 217, 211, 225]. Результаты, свидетельствующие о противоопухолевом действии макрофагов, были продемонстрированы для рака толстого кишечника, где ОАМ коррелируют с более продолжительной выживаемостью [32, 57, 131, 150].
Эти исследования демонстрируют важную роль как количества, так и фенотипа ОАМ в прогрессировании и метастазировании опухоли и указывают на необходимость понимания механизма взаимодействия ОАМ и химиотерапевтических агентов для прогнозирования эффективности химиотерапии и разработки терапевтических схем, усиливающих противоопухолевую активность ОАМ. Полученные на клиническом материале данные могут свидетельствовать о том, что под действием ХТ агентов макрофаги могут изменять свой фенотип и проявлять другие функции в опухоли. Поэтому далее было интересно изучить, как химиотерапия влияет на макрофаги в опухоли, какие программы активирует или подавляет в макрофагах и каков механизм действия ХТ на ОАМ.
Цисплатин подавляет клиренс компонентов микроокружения опухолеассоциированными макрофагами
Известно, что ОАМ могут регулировать микроокружение опухоли не только за счет высвобождения факторов роста, ферментов, цитокинов и компонентов внеклеточного матрикса, но также за счет поглощения этих факторов скавенджер-рецепторами, которые они экспрессируют у себя на поверхности [99].
Было проанализировано влияние химиотерапевтического препарата цисплатина на скавенджинг функцию макрофагов как механизм регуляции опухолевого микроокружения. Была использована система ex vivo модельных ОАМ, перепрограммированных опухолевыми супернатантами клеток рака молочной железы (MCF-7) и рака толстого кишечника (Colo206F). Для изучения эндоцитоза был выбран ацетилированный липопротеин низкой плотности acLDL в качестве эталонного лиганда [105]. EGF, известный эпидермальный фактор роста, активация которого является ключевым событием для прогрессирования рака толстой кишки и рака молочной железы [54, 116, 212, 229], был использован в качестве опухолеспецифического лиганда.
EGF экспрессируется во многих типах опухолей [229]. Сигнальный путь EGF/EGFR является важным регулятором роста первичной опухоли, инвазии и метастазирования при эпителиальных злокачественных новообразованиях [175]. Как было показано, EGF индуцирует эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) в EGFR-экспрессирующих клетках карциномы молочной железы человека за счет снижения экспрессии E-кадгерина и увеличения экспрессии мезенхимальных белков, таких как TWIST, SLUG и Snail.
Скавенджер-рецепторы (SR) способны связывать эндогенные и чужеродные молекулы и способствовать их удалению [144, 154, 220]. Стабилин-1 является трансмембранным рецептором, который относится к скавенджер-рецепторам класса H и играет важную роль в клиренсе (поглощении и деградации) «нежелательных» собственных веществ. Стабилин-1, экспрессируемый на М2 макрофагах, опосредует эндоцитоз классического лиганда acLDL, а также члена семейства гормонов роста плацентарного лактогена (PL) [110, 111, 163]. Большое количество стабилин-1+ ОАМ было обнаружено в метастатических опухолях молочной железы человека, а также при РТК, где ОАМ ассоциированы с более короткой выживаемостью [9, 170].
Для начала было изучено, может ли стабилин-1 участвовать в клиренсе эпидермального фактора роста (EGF). Для этого использовались клетки яичника китайского хомячка (СНО), эктопически экспрессирующие рекомбинантный стабилин-1, на которых ранее была продемонстрирована функция поглощения acLDL стабилином-1 [107]. СНО клетки не экспрессируют EGFR и стабилин-1 и являются идеальным объектом для трансфекции и изучения процессов эндоцитоза в виду наличия всех компонентов рецептор-опосредованного эндоцитоза. Анализ эндоцитоза был выполнен с использованием Alexa488-меченного EGF. После 30 мин инкубации связанный/интернализованный лиганд количественно определялся при помощи проточной цитометрии. В клетках CHO, трансфецированных стабилином-1, был обнаружен приблизительно в 20 раз более сильный флуоресцентный сигнал по сравнению с контрольными клетками CHO, стабильно трансфицированными пустым вектором (p 0,001, Рисунок 31), что указывает на то, что стабилин-1 участвует в поглощении EGF. Эндоцитарная активность стабилина-1 контролировалась поглощением acLDL-Alexa488, ранее идентифицированного как лиганд стабилина-1 [107] (Рисунок 34).
Поскольку сигнал проточного цитометра может быть вызван не только интернализацией лиганда, опосредованной рецептором, но также и удержанием лиганда на поверхности, была исследована способность стабилина-1 интернализовать EGF с помощью конфокальной микроскопии (рисунок 35). Через 30 мин эндоцитоза флуоресцентно меченный EGF был обнаружен в клетках CHO-стабилин-1, но не в клетках CHO-вектор. EGF ко-локализуется со стабилином-1 в EEA1-позитивных ранних/сортирующих эндосомах, что указывает на то, что стабилин-1 транспортирует EGF в эндосомальную систему. В контрольных клетках вектора CHO совместной локализации EGF с EEA1 не наблюдалось.
Ко-локализация стабилина-1 и EGF была сходна с acLDL (рисунок 35). Таким образом, было обнаружено, что стабилин-1 действует как скавенджер-рецептор для интернализации и эндоцитарного транспорта EGF, и, таким образом, является важным регулятором роста опухоли.
Далее было продемонстрировано, что поглощение общего лиганда скавенджер-рецепторов acLDL и опухолеспецифического лиганда EGF в модельных ОАМ значительно уменьшалось в присутствии цисплатина. Чтобы оценить влияние цисплатина на клиренс функцию ОАМ, были использованы те же лиганды - acLDL и EGF. Поглощение acLDL-AlexaFluor488 или EGF-AlexaFluor488 в ОАМ определяли количественно с помощью проточной цитометрии. Во-первых, было показано, что ОАМ, перепрограммированные супернатантами опухолевых клеток, продемонстрировали усиленное поглощение как acLDL, так и EGF по сравнению с M2-дифференцированными макрофагами (рисунок 36).
Цисплатин подавлял поглощение acLDL и EGF в модельных ОАМ рака молочной железы и рака толстого кишечника. В случае acLDL, самый сильный эффект цисплатина был выявлен в ОАМ, стимулированных супернатантами MCF-7 (в 5,4 раза, р=0,023). В ОАМ, стимулированных супернатантами Colo206F, была обнаружена тенденция к снижению поглощения acLDL, которая не достигла статистической значимости (в 2 раза, р=0,079) (рисунок 36). Цисплатин статистически значимо подавлял поглощение EGF в ОАМ, дифференцированных в присутствии супернатантов MCF-7 (в 2,25 раза, р 0,01) и супернатантов Colo206F (в 1,8 раз, р 0,001) (рисунок 36).
В то же самое время было обнаружено, что экспрессия стабилина-1, проанализированная с помощью ПЦР в режиме реального времени, существенно не изменялась после обработки цисплатином в макрофагах, дифференцированных в присутствии или в отсутствие кондиционированных супернатантов опухолевых клеток (рисунок 37).