«Дифференцированный прогноз трансплантации стволовых клеток в онкологии» Гривцова Людмила Юрьевна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Литературный обзор Стволовые кроветворные клетки стр. 19

Глава 2. Материалы и методы стр. 75

Глава 3. Модификация метода оценки количества стволовых кроветворных клеток стр. 90

Глава 4. Результаты

4.1 Общая иммуно-гематологическая характеристика кроветворной ткани аутологичной и аллогенной трансплантации стр. 97

4.2 Иммунологический профиль мобилизованных периферических СКК онкологических больных и доноров стр. 104

4.3 Линейно-нерестриктированные антигены мобилизованых СКК стр. 117

4.4 Линейно-рестриктированные антигены мобилизованных СКК стр. 155

4.5 Субпопуляции мобилизованных СКК взрослых больных и эффективность аутологичной трансплантации кроветворной ткани стр. 185

4.6 Аутологичная трансплантация мобилизованных СКК у детей, больных злокачественными опухолями стр. 201

4.7 Субпопуляции мобилизованных СКК доноров и эффективность аллогенной трансплантации в детской онкологии стр. 223

Глава 5. Заключение стр. 233

Выводы стр. 264

Практические рекомендации стр. 266

Список сокращений

• Иммунологический профиль мобилизованных периферических СКК онкологических больных и доноров
• Линейно-рестриктированные антигены мобилизованных СКК
• Аутологичная трансплантация мобилизованных СКК у детей, больных злокачественными опухолями
• Субпопуляции мобилизованных СКК доноров и эффективность аллогенной трансплантации в детской онкологии

Введение к работе

Актуальность исследования

Аутологичная и аллогенная трансплантации стволовых кроветворных клеток (СКК) в настоящее время широко используются в онкологии. 86% аутологичных трансплантаций в Европе это - трансплантации периферических стволовых кроветворных клеток, мобилизованных воздействием ростовых факторов (Copelan Е.А. et al 2006; Hequet О. et al., 2015; Korbling M. et al 2003; O'Meara A. et el., 2014; Passweg J.R. etal., 2012).

Главным ориентиром эффективности трансплантации является количество CD34 клеток, минимальная доза трансплантационная доза которых, составляет не менее 2 миллионов на кг массы тела реципиента (Наші Т. et al, 2003; Olansky D.M. et al., 2011; PeralesM.A. etal., 2015).

CD34 клетки неоднородны и представлены ранними, плюрипотентными и полипотентными предшественниками, способными восстанавливать все ростки кроветворения, бипотентными и унипотентными предшественниками, ответственными за созревание отдельных кроветворных линий (Babovic S. et al. 2014; Benz С. et al., 2012; Eaves C.J., et al., 2015; Kondo M. et al., 2003). Ранняя, линейно не рестриктированная СКК - это CD34 клетка, отрицательная в отношении экспрессии линейно не ограниченных антигенов HLA-DR и CD38. На клетке такого уровня может выявляться слабая экспрессия молекулы Thy-1 (D'Arena G., et al 1998; Humeau L., et al., 1996; Mayani H., et al., 1994).

Пул линейно коммитированных клеток обеспечивает при трансплантации кроветворной ткани достаточно быстрое восстановление как лейкоцитов (в основном, за счет нейтрофилов), так и тромбоцитов и характеризуется гетерогенной экспрессией линейно-специфичных антигенов CD13, CD33 CD7, CD19, CD10 (Gaipa G., et al., 2002). Гетерогенность или субпопуляционный состав СКК отражает их иммунофенотипический профиль, то есть совокупность экспрессии мембранных и внутриклеточных белков, детектируемых в том числе и иммунологическими методами с использованием моногоцветной проточной цитометрии (Azouna N.B. et al., 2011; Gur-Cohen S. et al. 2012; Rose J.A. et al., 2015; Siena S. et al, 1991).

Изучение вклада каждой из субпопуляций в общий мобилизующийся пул и влияния их на полноту и скорость восстановления кроветворения при трансплантации и высокодозной химиотерапии представляют значительный научный и практический интерес. Важной представляется оценка особенностей субпопуляционного состава стволовых клеток у пациентов различного возраста, с различными опухолевыми процессами в сопоставлении со здоровыми лицами.

Решение актуальной проблемы детальной иммунологической характеристики стволовых гемопоэтических клеток возможно в крупных научных центрах, имеющих трансплантационные отделения и проводящих иммунологические исследования стволовых клеток.

Таким образом, детальное изучение иммунологических характеристик СКК, позволяющих легко выявлять их субпопуляции является актуальным. На основании субпопуляционного состава мобилизованных СКК возможна индивидуализация лечения онкологических больных с использованием трансплантации СКК.

Цель исследования - дифференцированный прогноз трансплантации стволовых кроветворных клеток в онкологии на основе их субпопуляционного состава.

Задачи исследования:

1. Охарактеризовать субпопуляционный состав линейно-коммитированных и полипотентных стволовых клеток крови онкологических больных и здоровых лиц на основании экспрессии маркера стволовых клеток CD34, пан-лейкоцитарных антигенов CD45 и CD50, линейно-нерестриктированных молекул HLA-DR, CD38, CD71 и антигена Thy-І (ранние СКК) и маркеров линейной дифференцировки - миелоидных CD 13, CD33, мегакариоцитарных CD61, эритроидных - гликофорин А и лимфоидных CD7 (Т-клетки) и CD 19 (В-клетки).

2. Провести сравнение гемопоэтического потенциала на основании субпопуляционного состава мобилизованных стволовых клеток крови онкологических больных в зависимости от возраста (взрослые, дети).

3. Дать сравнительную характеристику субпопуляционного состава стволовых кроветворных клеток онкологических больных и здоровых лиц.

4. Определить эффективность мобилизации различных субпопуляций стволовых кроветворных клеток в зависимости от нозологической формы заболевания онкологических больных

5. Выявить клинически значимые субпопуляции СКК, содержание которых в трансплантируемой ткани отражается на эффективности восстановления лейкоцитов и тромбоцитов крови при аутологичной и аллогенной трансплантации периферических СКК у онкологических больных.

Научная новизна

Впервые, на большом клиническом материале (1187 образцах кроветворной ткани у 430 онкологических больных разного возраста и у 50 взрослых доноров аллогенной кроветворной ткани, наблюдающихся в отделениях ФГБНУ «РОНЦ им Н.Н. Блохина») подробно охарактеризован мембранный иммунофенотип мобилизованных периферических стволовых кроветворных клеток.

Показано, что субпопуляции стволовых кроветворных клеток различных этапов дифференцировки и линейной коммитированности, обуславливающие полноту и скорость восстановления гемопоэза и отдельных ростков крови, могут быть оценены проточно-цитометрически в материале трансплантации онкологических больных.

Описаны специфические иммунофенотипы наиболее ранних - CD34 CD38HLA-
DR", CD34 Thyl CD71 и плюрипотентных стволовых кроветворных клеток -
CD34⁺CD3 8ⁱHLA-DR^dThy- 1⁺CD117⁺CD7 ^СБб l^ymp^CD ІЗ/СБЗЗ*. Изучены

бипотентные гранулоцитарно-макрофагальные - CD34⁺CD38⁺HLA-DR⁺CD117⁺
CD13/CD33 lymph" и общие предшественники эритроцитов-мегакариоцитов -
CD34⁺CD38⁺HLA-DR⁺CD117⁺CD13/CD33^±CD71+CD61^±lymph", унипотентные-

миелоидные - CD34⁺CD38⁺HLA-DR⁺CD117^±myef lymph".

Установлена мобилизация в периферическое русло субпопуляции СКК, которая, иммунофенотипически, соответствует общему лимфоидному предшественнику CD34⁺CD38⁺HLA-DR⁺CD90^±CD10^±myel".

Впервые доказана мобилизация в периферическое русло субпопуляции CD34 CD45^neg клеток, гетерогенных по размеру и экспрессии остальных изучаемых маркеров СКК. Установлены иммунофенотипические различия данных клеток у доноров и онкологических больных.

Подтверждена эффективная мобилизация миелоидно-коммитированных СКК, гетерогенных в отношении экспрессии пан-миелоидных антигенов CD 13, CD33, вероятность коэкспрессии которых на уровне одной СКК является низкой (р=0,012).

Аутологичные СКК и детей и взрослых гетерогенны в отношении c-kit рецептора. У взрослых онко гематологических больных показана взаимосвязь CD117^ow СКК и CD19⁺ СКК, CD117⁺⁺ и CD33⁺ СКК. У детей возможно существование субпопуляции CD117^ow lymph⁺ (CD 19 и CD7). Установлена наиболее выраженная мобилизация CD34⁺CD117⁺ СКК у онкологических больных (р=0,029).

Аутологичные и аллогенные СКК неоднородны по экспрессии рецептора трансферрина CD71. Аутологичные CD34⁺CD71^low СКК детей являются CD 13 , и экспрессируют стволовоклеточный антиген более ярко в сравнении с CD71 , которые в большинстве - CD 13-негативны.

Мегакариоцитарно-рестриктированные CD34 CD61 СКК - четкая отдельная популяция, большинство из которых CD45^neg Thy-1 myel .

CD 19 СКК детей и доноров могут быть описаны как клетки небольшого размера, с иммунофенотипом CD34⁺HLA-DR⁺myel"CD71⁺CD10^±CD90⁺CD45⁺ (пре-пре-В, про-В этапы костномозговой дифференцировки).

У взрослых вероятность коэкспрессии CD 19, CD 10, CD45 мала, и большинство CD19⁺CKK являются CD45^lowCD10 (про-В этап).

Выявлена мобилизация гетерогенной популяции CD34 CD7 СКК. Среди аутологичных CD7 СКК и детей и взрослых показана возможность присутствия CD7 CD45 СКК с экспрессией миелоидных антигенов (миелоидно-коммитированные предшественники, би-плюрипотентные) и CD7⁺⁺CD45^owHLA-DR CD38 СКК -являющихся, с высокой долей вероятности, Т-линейными предшественниками.

Установлена взаимосвязь иммунофенотипа мобилизованных периферических аутологичных СКК с нозологической формой опухоли и выявлена разница в эффекте мобилизации отдельных субпопуляций.

У взрослых больных наилучший эффект мобилизации на основании суммарного количества CD34 СКК в материале первого дня сбора установлен при НХЛ (неходжкинские лимфомы) и ММ (множественная миелома) в сравнении с ЛХ (лимфомой Ходжкина) (р=0,01). СКК больных множественной миеломой характеризовались более выраженной пропорцией В-линейных CD 19 СКК, тогда как

количество CD34 CD45^neg клеток было достоверно более низким в сравнении с группой ЛХ, различия обусловлены как CD45" (р=0,023) так и CD45 ^ow(p=0,016) СКК. У больных ММ среди СКК выявлено преобладание CD34⁺HLA-DR⁺ и CD34⁺CD38⁺ субпопуляций, в сопоставлении с группой больных НХЛ.

У детей лучший эффект мобилизации выявлен для группы больных СЮ (Саркомой Юинга) и нейробластомой, в сравнении с медуллобластомой и гемобластозами (р=0,03). У больных гемобластозами среди СКК выявлялось наибольшее количество субпопуляций CD45^neg (р<0,034, для всех групп сравнения) и количество CD34⁺CD117⁺ СКК (р<0,016, для всех групп сравнения), в сравнении с остальными группами больных (ОССЮ (опухолями семейства Саркомы Юинга), гемобластозами, мягкотканными опухолями, медуллобластомой).

Впервые установлено, что большее содержание CD34⁺CD38" СКК и самое высокое количество Thy-1 СКК (р<0,03 для все групп сравнения) выявляется у детей, больных медуллобластомой. А количество CD34 CD117 и CD34 CD33 СКК у больных медуллобластомой было наименьшим (р<0,01, для всех групп сравнения). СКК больных ПНЕО (примитивными нейроэндокринными опухолями), отличало более выраженное количество CD34⁺HLA-DR"CD38" СКК, практически сопоставимое с группой медуллобластом количество Thy-І СКК (р=0,001 для всех групп, за исключением медуллобластомы) и выраженная в сопоставлении с остальными группами детей пропорция В-линейных предшественников CD19 (р<0,038, для всех групп сравнения).

Научно-практическая значимость

В работе установлена клиническая значимость субпопуляций СКК при аутологичной и аллогенной трансплантациях мобилизованных периферических клеток в отношении восстановления кроветворения в ранний посттрансплантационный период у онкологических больных.

У взрослых онкологических больных выраженная пропорция субпопуляций CD45^low, CD45 , и менее 70,0% CD34⁺CD33⁺ СКК отражала более эффективное восстановление кроветворения (р<0,05).

У детей с онкогематологической патологией присутствие большего количества CD45^low, выраженная пропорция CD34⁺CD38⁺ СКК, менее 90,0% CD13⁺CD34⁺ СКК характеризовало группу с более быстрым восстановлением кроветворения (р<0,04).

У детей - реципиентов аллогенных СКК, полученных от взрослых родственных доноров, выраженная пропорция CD45^neg СКК, и менее 90,0% CD13⁺CD34⁺CKK, обеспечивали более быстрое восстановление кроветворения. Задержка в сроках восстановления лейкоцитов ассоциировалась с повышенным содержанием среди трансплантируемых СКК субпопуляции CD34⁺CD7⁺ (р=0,022).

У взрослых онкогематологических больных СКК лейкаферезных продуктов, содержащих менее 1,0% CD34 клеток, характеризовались более высоким содержанием CD34⁺CD45^low (р=0,039), CD34⁺CD38⁺ (р=0,023), CD34⁺CD33⁺ (р=0,026) и CD34⁺CD7⁺ (р=0,045) клеток.

У детей в лейкаферезных продуктах (ЛП), содержащих менее 2,0 xlO / кг СКК, более низким в сравнении с ЛП, содержащими 2,0 х107 кг и более СКК, было относительное (процент) количество CD13⁺ (р=0,013), CD71⁺ (р=0,002) клеток а количество CD45^low(p=0,0001), CD38"HLA-DR" СКК (р=0,021) и CD61⁺ (р=0,045) субпопуляций СКК было более высоким.

Среди донорских СКК при содержании в ЛП 0,2% и более CD34⁺ СКК достоверно более высоким было количество (%) CD45^low (р=0,03), CD45-HLA-DR⁺ (р=0,013), CD50⁺ (р=0,038) СКК. Количество CD34⁺CD33⁺ клеток в образцах с содержанием 0,2% и более СКК было напротив достоверно более низким (р=0,023).

Выявлены клинически значимые субпопуляции СКК, не взаимосвязанные с суммарной дозой CD34 клеток.

При аутологичной трансплантации у взрослых больных CD34 CD45^ow СКК, независимо от суммарной дозы СКК, опосредовали скорость восстановления, как лейкоцитов, так и тромбоцитов, a CD34 CD90 СКК опосредовали скорость восстановления тромбоцитарного звена.

При аутологичной трансплантации у онкологических больных детского возраста независимыми от суммарной дозы СКК являлись CD34 CD38" СКК, опосредующие скорость восстановления лейкоцитов и CD34 HLA-DR СКК, количественно опосредующие скорость восстановления тромбоцитарного звена.

При аллогенной частично-родственной трансплантации мобилизованных периферических СКК в детской онкогематологической практике (трансплантация клеток от взрослых доноров) независимой от суммарной дозы СКК, количественно значимой, явилась субпопуляция CD3 4 CD 13 СКК.

Работа на основании обширного исследования субпопуляционного состава стволовых кроветворных клеток позволила рекомендовать внедрение в клинику факторов иммунологического прогноза эффективности раннего восстановления показателей кроветворения у онкологических больных при аутологичной и аллогенной трансплантации:

1. Характеристика СКК при аутологичной и аллогенной трансплантации ткани в онкологической практике должна включать не только подсчет суммарного количества CD34 клеток, необходима оценка субпопуляционного состава.

2. С целью улучшения непосредственных результатов трансплантации СКК в онкологии, необходима количественная оценка ранних субпопуляций СКК CD34⁺CD45^neg, CD34⁺ CD90⁺, CD34⁺CD38" и коммитированных СКК (мегакариоцитарных CD34 CD61 , миелоидно-коммитированных CD34 CD 13 CD33 ).

3. Для выявления клинически значимых субпопуляций у взрослых онкогематологических больных может быть предложена следующая комбинация МКА CD34/CD45/CD33/CD7/CD90.

4. В условиях детской клиники при прогнозе эффекта аутологичной трансплантации СКК необходима иммунофенотипическая характеристика трансплантируемых СКК на основании сочетания CD34/CD45/CD38/CD13.

5. При оценке эффекта аллогенной трансплантации СКК следует оценить совокупность экспрессии CD34,CD45,CD13, CD7, CD90.

6. Учитывая высокую частоту выявления субпопуляций CD45^neg СКК как у взрослых онкогематологических больных, так и у детей и её клиническую значимость, при трансплантации целесообразна питометрическая оценка суммарного количества СКК в трансплантированной ткани с применением комбинации CD34 и нуклеотропных красителей (Syto 16).

Личный вклад

Соискатель лично участвовала в процессе подготовки больных к транспланатации стволовых кроветворных клеток, анализировала иммунологические и гематологические показатели, создала базу данных и полностью провела статистический обсчет результатов, включая анализ роли иммунологических и гематологических показателей при оценке эффективности восстановления кроветворения у онкологических больных при аутологичной и аллогенной трансплантации и высокодозной химиотерапии.

Соответствие паспорту специальности

Диссертация соответствует паспорту специальности 14.01.12 онкология, конкретно пунктам 2 и 7.

Научные положения, выносимые на защиту

На основании углубленных иммунологических исследований субпопуляционного состава мобилизованных стволовых кроветворных клеток у 430 онкологических больных и 50 доноров аллогенных СКК установлена прогностическая роль отдельных субпопуляций стволовых кроветворных клеток в эффективности восстановления кроветворения в ранний период при аутологичнои и аллогеннои трансплантации кроветворной ткани на фоне высокодозной химиотерапии. Предложена оценка конкретных субпопуляций стволовых клеток трансплантация которых значима для восстановления кроветворения при аутологичнои и аллогеннои трансплантации.

7. Периферические стволовые кроветворные клетки, трансплантируемые онкологическим больным для сокращения критической панцитопении, гетерогенны по субпопуляционному составу и включают ранние полипотентные предшественники (CD38" и /или HLA-DR"; CD90⁺; CD45-негативные), лимфоидные предшественники (CD10⁺,CD7⁺,CD2⁺, CD19⁺,CD56⁺), мегакариоцитарно- (CD61 ), а также миелоидно-коммитированные предшественники СКК (CD117⁺, CD13⁺, CD33⁺).

8. Трансплантируемые стволовые кроветворные клетки здоровых доноров отличаются от стволовых кроветворных клеток онкологических больных выраженной пропорцией ранних (CD38HLA-DR", CD90⁺, CD45-негативных) клеток (р<0,045), лимфоидных (CD7⁺, CD2⁺, CD19⁺, CD56⁺) клеток (p=0,01) и мегакариоцитарно-коммитированных предшественников (р=0,006).

9. Ранние плюрипотентные стволовые клетки (Thy-1 ) преобладают у детей, больных медуллобластомой и нейробластомой (р<0,04). CD 19 лимфоидные стволовые клетки преобладают у больных множественной миеломой (р=0,02) и детей, больных примитивными нейроэндокринными опухолями (р=0,003), a CD7 стволовые клетки - у детей с нейробластомой (р=0,02). CD45-негативные и c-kit стволовые клетки чаще выявляются у больных гемобластозами (р<0,03 и р<0,04) вне зависимости от возраста.

4. Ауто логичная трансплантация субпопуляций ранних полипотентньгх стволовых кроветворных клеток (CD45-негативных, р<0,04; Thy-1-позитивных, р<0,05) независимо от суммарной дозы трансплантируемых CD34 клеток определяет высокую эффективность восстановления кроветворения и сокращение сроков критической цитопении (лейкоцитов до 10 дней, тромбоцитов до 14 дней) у онкологических больных.

5. Трансплантируемые CD38" стволовые кроветворные клетки (менее 65%) независимо от дозы CD34 клеток, опосредовали эффективность восстановления лейкоцитов при аутологичной трансплантации у детей (р=0,044).

6. Наличие мономорфной (более 70-90%) по экспрессии миелоидных антигенов (CD 13, CD33) популяции стволовых кроветворных клеток в материале аутологичной или аллогенной трансплантации достоверно замедляет (р<0,05) сроки восстановления гемопоэза у детей и больных взрослого возраста.

7. У онкологических больных взрослого возраста субпопуляции CD34 CD45^ow, CD34 CD33 взаимосвязаны с суммарной дозой CD34 клеток у (обратная корреляция, р=0,039 и р=0,026). В детском возрасте с общим содержанием CD34⁺ клеток коррелируют CD34 CD 13 клетки (прямая корреляция р=0,013) и CD34⁺CD45^ow клетки (обратная корреляция, р=0,008). При аллогенной трансплантации суммарная доза трансплантируемых CD34 клеток обратно пропорциональна количеству CD34 CD33 миелоидных предшественников (р=0,023).

8. Для выявления суммарного пула стволовых кроветворных клеток целесообразно использование, наряду с оценкой экспрессии CD34 антигена, нуклеотропного красителя sytol6 (вместо общелейкопитарного антигена CD45), так как CD45 отсутствует на значительной части мобилизованных стволовых кроветворных клеток

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в клиническую практику отделений трансплантации и химиотерапии гемобластозов научно-исследовательских институтов ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» МЗ РФ и клинических подразделений Главного

воєнного клинического госпиталя им. академика Н.Н. Бурденко и ФГБУ НМХЦ им. Н.И. Пирогова.

Апробация работы

Апробация диссертационной работы состоялась 17 апреля 2015 года на совместной научной конференции с участием лаборатории иммунологии гемопоэза, лаборатории иммунологии опухолей централизованного клинико-лабораторного отдела, отделения химиотерапии гемобластозов, отделения трансплантации костного мозга и интенсивной химиотерапии с реанимацией (ОРИТ №3), отделения амбулаторной химиотерапии НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» МЗ РФ, лаборатории гемоцитологии, отделения химиотерапии и реанимации, отделения химиотерапии гемобластозов НИИ детской онкологии и гематологии ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» МЗ РФ.

Публикации

Автором опубликовано 40 научных работы по теме диссертации, в том числе 33 статьи в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ.

Объём и структура дисертации

Диссертация представлена на 337 страницах. Состоит из введения, обзора литературы, главы по клинической характеристике больных и использованных методов исследования, двух глав собственных результатов, заключения, выводов и одного приложения (рисунки к главам результатов). Библиографический указатель включает 414 источников, в том числе 7 отечественных и 407 зарубежных. Работа иллюстрирована 26 таблицами и 34 рисунками.

Иммунологический профиль мобилизованных периферических СКК онкологических больных и доноров

Аутологичная и аллогенная трансплантация стволовых кроветворных клеток (СКК) обеспечивает замену и/или восстановление нарушенного, патологического кроветворения и широко используется в клинической онкологической практике у больных на фоне применения высоких доз цитостатиков и/или облучения. Эффективность трансплантации СКК показана при широком спектре нозологии, включающих онкогематолгические заболевания и ряд солидных опухолей, а также врожденных или приобретенных патологий костного мозга. В большинстве случаев (86% аутологичных трансплантаций в Европе) это - трансплантации периферических стволовых кроветворных клеток, мобилизованных воздействием ростовых факторов. Количество стволовых кроветворных клеток в трансплантате определяет клинический эффект, то есть скорость и полноценность восстановления травмированного кроветворения [79, 160, 199, 266, 277].

Стволовые кроветворные клетки (СКК) - очень малочисленная, но гетерогенная клеточная популяция, объединяющая в себе несколько типов (субпопуляций) клеток, отличающихся по уровням дифференцировки и способности к пролиферации. Среди них присутствуют как недифференцированные, практически не делящиеся стволовые клетки (СК), так и коммитированные (ограниченные в направлении дифференцировки) клетки-предшественники [13, 249, 275].

Популяция стволовых кроветворных клеток среди всех СК была идентифицирована первой. Её изучение сыграло ключевую роль в понимании биологии и функций стволовых клеток в целом [25, 105, 251, 268, 295,319,351]. Любую клетку из пула стволовых, в том числе и СКК, характеризует ряд особых свойств: СК способны к самообновлению/самовосстановлению на протяжении длительного времени или даже в течение всей жизни организма (long erm subset).

Стволовые клетки, обладающие способностью к самовосстановлению, находятся в состоянии G0/G1 клеточного цикла, так называемые «покоящиеся» стволовые клетки [124, 145]. Процессы пролиферации и дифференцировки СК запускаются при необходимости (нарушения целостности организма любого генеза). Стволовые клетки могут дифференцироваться в специализированные клетки организма (по крайнее мере 2-х фенотипов), данное свойство СК приобретают на этапе кратковременно живущего пула неспециализированных коммитированных СК, которые переходят в G1 фазу клеточного цикла [319].

По мере дифференцировок и приобретения клеточной специализации СК постепенно утрачивают способность к самовосстановлению и снижают потенциал пролиферации, а возможность дифференцировок ограничивается одним типом клеток.

СК обладают способностью делиться ассиметрично, то есть при пролиферации образуются 2 дочерние клетки. Одна из которых приобретает свойства коммитированного предшественника, способного к узконаправленной дифференцировке, восполняющего клеточные потери организма. Другая остается неспециализированной, и составляет так называемый резерв. Это их свойство позволяет сохранять целостность организма на протяжении всей жизни и обеспечивать стабильность системы кроветворения. Соблюдение баланса между механизмами пролиферации и дифференцировки опосредуется взаимодействием целого ряда факторов, в том числе и белков клеточной мембраны самой СК и её микроокружения [75, 319]. Грань между различными субпопуляциями СКК (наиболее ранними долгоживущими и дифференцирующимися коммитированными) является достаточно тонкой, размытой и определить её не всегда возможно.

Определенные успехи в выделении различных субпопуляций СКК, а также и популяций СК других специфичностей были достигнуты в результате характеристики их мембранного иммуно фенотипа. Иммунологический профиль любой клетки может быть определен с использованием методов многоцветной проточной цитометрии. Применение различных комбинаций мембранных антигенов при характеристике СКК с наибольшей точностью позволяет охарактеризовать уровень дифференцировки клеток, а также опосредовано определять степень пролиферативной и репопулирующей способности СКК, выделять различные субпопуляции. Каноническим для оценки количества СКК кроветворной ткани является метод проточной цитометрии с использованием моноклональных антител к антигену CD34 [201]. В случае трансплантации кроветворной ткани у онкологических больных именно количество С034+клеток и число их различных субпопуляций определяет эффективность восстановления кроветворения в целом и полноценность функционирования различных звеньев иммунной системы в частности.

Накоплены огромные знания относительно биологии стволовых клеток (СК), как кроветворных, так и стволовых клеток других специализаций, разработаны конкретные программы практического использования стволовых клеток в медицине. [13, 24, 75, 199].

Особый интерес вызывали и вызывают методы клеточной трансплантации как собственно терапевтическое воздействие, и, соответственно интерес к изучению столовых клеток крови не ослабевает до сих пор.

Линейно-рестриктированные антигены мобилизованных СКК

Учитывая необходимость набора более 2х106/кг CD34+ клеток, у взрослых больных проводилось от 2 до 4-5 сеансов лейкафереза, в зависимости от эффективности стимуляции кроветворения и мобилизации СКК.

У детей необходимое для трансплантации количество СКК (2 млн и более CD34+ клеток на кг массы тела больного) в большинстве случаев было набрано в ходе 1-й процедуры лейкафереза. В том случае если мобилизация СКК была неэффективной, и за 2 процедуры сбора не было набрано достаточного количества CD34+ клеток на фоне продолжающейся стимуляции гемопоэза ростовыми факторами, осуществляли эксфузию костного мозга (14 больных). При невозможности эксфузии (6 человек) проводились повторные процедуры сбора СКК.

Оценка качества трансплантационного материала осуществлялась иммунологически в реакции прямой иммуно флуоресценции с учетом данных на проточном цитометре.

В образцах непосредственно после процедуры лейкофереза проводился подсчёт CD34+ клеток, а также числа зрелых Т-клеток (CD3+), у части доноров проводилась так же оценка количества субпопуляций Т-лимфоцитов (CD8, CD4) и числа NK-клеток (CD56).

До постановки реакции иммунофлуоресценции клетки освобождали от эритроцитов стандартным путем инкубации с лизирующим раствором (FACS lysing solution, Becton Dickinson) в течение 5-10 минут в темноте при комнатной температуре.

При оценке количества стволовых кроветворных клеток использовались прямые коньюгаты моноклональных антител: к антигену CD34: Clone НРСА-2а (8G12), изотип IgGl, метка РЕ (фикоэритрин), Clone НРСА-2а (8G12), изотип IgGl, метка PerCP, Clone НРСА-2а (8G12), изотип IgGl, метка Pe-cy5 (тандемный краситель фикоэритрин- цианин 5), антитела к антигену CD45, изотип IgGl, метка FITC (флуоресцеинизотиоционат), РЕгСР и РЕ-су5. Также применены изотипические контроли: иммуноглобулины мыши соответствующего изотипа с необходимой флуоресцентной меткой (РЕ, FITC, РегСР, РЕ-су5).

Оценку количества стволовых CD34+ клеток осуществлялся на основании ISHAGE-протокола в реакции двойной иммунофлуоресценции с использованием прямых коньюгатов моноклональных антител к антигену стволовых клеток CD34 и общелейкоцитарному антигену CD45.

С учетом необходимости оценки субпопуляций CD34+ клеток, в том числе и не экспрессирующих общелейкоцитарный антиген, данный протокол был нами несколько модифицирован. Подсчет количества стволовых CD34+ клеток проводили не в пределах CD45+ клеток (стандартный протокол) а на всю клеточную популяцию образца, а затем полученный процент CD34+ клеток пересчитывали на лейкоциты (CD45+ клетки) в зависимости от их количества в пробе.

Оценка субпопуляционного состава стволовых CD34+ клеток Субпопуляционный состав пула стволовых кроветворных клеток оценивался на основании иммунологического фенотипа CD34+ клеток методом проточной цитометрии с использованием тройной флуоресцентной метки.

Клетки окрашивали напрямую меченными МКА к CD34 и к анализируемым маркерам (стандартная РИФ). Использовали МКА к CD34, меченные фикоэритрином (РЕ), или МКА, меченные флуоресцеина изотиоцианатом (FITC), а так же CD34 РЕ-су5 (фикоэритрин - цианин 5) и CD34 РегСР (пиридининхлорофил). Каждый образец инкубировался с 4-8 трехцветными комбинациями МКА. При анализе на проточном цитометре накапливали не менее 2000 клеток в гейте С034-позитивных событий. При хорошей, и достаточной клеточности количество событий, неспецифически попадающих в гейт было незначительным (доли процента). На рис.5.А показан гейт (R1) анализа CD34+ клеток, рис.5. Б демонстрирует изотипический контроль, количество событий в котором менее 1% числа клеток, специфически окрашенных на CD34.

В работе оценена пропорция ранних предшественников, по экспрессии линейно-неограниченных антигенов (HLA-DR, CD38, рис. 5 Б), маркеров ранних этапов дифференцировки (CD 117, CD71) и молекул клеточной адгезии (CD50, CD56, CD45). А также количество линейно-коммитированных стволовых кроветворных клеток: миелоидных (антигены CD13, CD33), лимфоидных (CD7, CD19) мегакариоцитарных (CD61), в нескольких образцах проанализировано количество эритроидных предшественников по экспрессии антигена клеток красного ряда гликофорина (CD236a). Флуорохромные метки и клон используемых антител указаны в таблице 2. Таблица 2. Характеристика субпопуляций стволовых кроветворных клеток. Антигены и моноклональные антител.

Glycophorin A (CD236a) GlycophorinA GA-R2 (HIR2)/ IgG2b, k PE Immunotech, Coulter На основании проанализированных в работе антигенов с высокой долей вероятности можно охарактеризовать направление дифференцировки и оценить количество полипотентных (КОЕ-ГЕММ) и бипотентных (КОЕ-ГМ, миелоидных CD13+, CD33+) или лимфоидно-коммитированных (В-линия -CD19+CD34+, Т-линия CD7+CD34+) стволовых кроветворных клеток, а так же стволовых клеток с мегакариоцитарной направленностью дифференцировки (CD61+). Популяция клеток предшественников эритроидной направленности дифференцировки (CD71+CD236a+) среди образцов данной анализируемой группы была очень незначительной и анализ данной субпопуляции не проводился.

Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием программы SPSS версия 17 для Windows. При обработке материала использованы функция частот для описания последовательных рядов переменных, средних значений, медианы, стандартной ошибки средних значений и вариабельности значений переменных; функция бивариантных корреляций, для определения коэффициента корреляции 2-х независимых переменных, корелляция достоверна при р 0,05, функции сравнения средних значений независимых и зависимых переменных, доверительный интервал -95% и выше; функция кодирования переменных в соответствии с интервалами значений выбранной переменной.

Аутологичная трансплантация мобилизованных СКК у детей, больных злокачественными опухолями

При оценке коэкспрессии CD38 с антигенами CD 19 и CD90 в образцах взрослых больных установлено, что все CD34+CD19+ и CD34+CD90+ клетки являются С038-позитивными (рис.П.1.16 Г, Д). При этом CD34+CD19+ клетки демонстрировали более яркую экспрессию CD38. Четкой, достаточной для анализа популяции CD38"CD90+ в образцах, оцененных с этой точки зрения не выявлено, однако, количество CD34+CD38" клеток в образцах лейкаферезных продуктов было обратно пропорциональным числу CD34+CD90+ СКК (отрицательная корреляционная связь, близкая к достоверной, р=0,06).

При сравнении образцов ЛП с выраженным (более 70,0% АГ+ клеток -1 группа) количеством CD38+CKK и с содержанием таких клеток менее 70,0% (2-ая группа) у взрослых больных установлено, что более высоким среди образцов второй группы было содержание CD34+ лейкоцитов (р= 0,008), а также CD34+CD33+ клеток (р= 0,017) и CD34+CD71+ СКК (р = 0,004). Количество клеток субпопуляции CD34+CD38"HLA-DR+ достоверно более высоким было в образцах 1-ой группы (р= 0,000).

В образцах ЛП детей, содержащих 70,0% и более CD38+ СКК, достоверно преобладало число CD90+ СКК (р= 0,047; 33,47% против 21,45%; 33 против 52 образцов). Близко к достоверным было преобладание в первой группе количества CD34+CD45" СКК (р=0,056 1,13 против 4,5%, 35 и 64 образца), и числа CD33+ (р= 0,056; 71,5% против 58,5%; 33 против 49 образцов), что отличает СКК детей от взрослых больных.

У доноров достоверных отличий в количестве клеток субпопуляций для групп с разным количеством CD38+ СКК не получено. При оценке особенностей иммунологического фенотипа СКК образцах доноров, содержащих менее 70% клеток популяции CD34+CD38+, выявлены закономерности, отличные от образцов всей группы: Количество клеток субпопуляции CD34+HLA-DR" было достоверно взаимосвязано с числом Т 148 линейных предшественников (R= 0,772; р=0,005; п=11), тогда как среди клеток данной субпопуляции присутствие миелоидных предшественников (CD13+, CD33+) и клеток-предшественников, экспрессирующих рецептор трансферрина CD71, было маловероятным (R=-0,796; р=0,002; n=12; R=-0,886; р=0,0001; п=11 и R=-0,735; р=0,01; п=11, соответственно). Для четырех образцов, попавших в эту группу, установлен интересный факт достоверной связи между числом CD34+ клеток с экспрессией молекулы NCAM (CD56), экспрессия которой наиболее характерна для NK-линейных предшественников, и количеством стволовых клеток субпопуляций CD45" и CD45-Aow R= 0 973 р=0027 и R=O,980, р=0,02, соответственно).

Краткое резюме по подглаве 4.3.6.

Субпопуляция CD38+ СКК является гетерогенной (рис.П.1.15). CD38+CKK разнородны по экспрессии CD45 антигена и содержат как CD45+ и CD45neg клетки. По мере нарастания уровней экспрессии CD38 на СКК, уровни экспрессии стволовоклеточного и общелейкоцитарного антигенов снижаются. CD38+ СКК демонстрируют коэкспрессию большинства изученных антигенов (CD50, HLA-DR, CD33, CD13, c-kit, CD19 и CD90).

Количество CD38+ СКК взаимосвязано с процентом CD34+ лейкоцитов в образцах ЛП взрослых больных. В образцах с высоким содержанием CD34+ клеток у взрослых будет повышено содержание субпопуляций CD34+CD38" CD33+CD71+ клеток, скорее всего относящихся к СКК миело-моноцитарной, а также возможно ранней стадии эритроидной рестрикции. У детей присутствие выраженной пропорции CD38+ СКК было ассоциировано с более высоким процентом Thy-1+ и CD33+ СКК. Для донорских СКК различий не получено.

Учитывая спектр экспрессии CD71 имеются основания не относить данный антиген к молекулам узкой линейной направленности, и рассматривать его как линейно нерестриктированный антиген.

Экспрессия CD71 на СКК изучена в 89 образцах (11 образцов ПК и 78 образцов ЛП) взрослых онкологических больных, в 124 образцах (113 ЛП и 11 ПК) у детей и в 25 образцах взрослых доноров СКК.

Разброс значений в отношении CD34+CD71+ СКК был существенным и в образцах ЛП взрослых их количество варьировало от 4,0 до 74,7% (средние 35,8±1,95) при медиане 36,2%, а в образцах ПК от 13,0 до 92,1% (средние 36,4 ± 6,7) при медиане 27,1%. При этом в большинстве образцов, как ЛП (46 из 78 - 59%) так и ПК (8 из 11 - 72,0%), количество CD34+CD71+ клеток составляло менее 40,0% от суммарного пула CD34+ клеток. В образцах ЛП детей количество CD34+CD71+ клеток варьировало от 8,8% до 99,2% (средние 49,1±2,11) при медиане 45,7%, а в образцах ПК от 36,0% до 94,5% (средние 63,9 ± 1,59) при медиане 65,0%, что было более высоким по сравнению с СКК взрослых, однако, из-за разброса значений, различия не являются достоверными.

У доноров среднее количество CD34+CD71+ клеток было наибольшим и составило в среднем 78,7 %±4,9% (медиана 88,9, разброс 9,8-98,4).

Учитывая общепринятые представления о спектре экспрессии CD71 в 24 образцах ЛП детей ив 10 образцах взрослых больных была проанализирована коэкспрессия CD71 и антигена эритроидных предшественников, гликофорина A (CD236a) на уровне одной СКК.

И у детей, и у взрослых, и у доноров экспрессия CD71 на стволовых CD34+ клетках была неоднородной. Выделено 2 популяции CD71+CKK -CD71++ клетки с яркой экспрессией рецептора (область R4 рис.П. 1.17Б и клетки, расположенные правее областей R2 на рис.П. 1.17 А, Б) и клетки со слабой фоновой экспрессией рецептора CD71low (область R2 рис.П.1.17 А, В и область R3 рис.П. 1.17 Б).

Анализ проводился как в отношении CD34+CD71++ клеток (далее в тексте CD71++), так и в отношении всех трансферрин-позитивных СКК (обший пул CD71+, включающий CD71++ и CD71ow популяции, далее в тексте обозначаемый как CD71+).

Уровни экспрессии трансферринового рецептора на популяции CD71ow СКК были сопоставимы с уровнями фоновой экспрессии антигена на клетках гранулоцитарного ряда (рис.П.1.17 А - красным выделены СКК, синим клетки гранулоцитарного ряда) и с уровнями экспрессии CD71 на активированных лимфоцитах (лимфоциты выделены на основании экспрессии CD45 и на рис.П. 1.17 Б окрашены зеленым цветом).

Уровни экспрессии молекулы в пределах субпопуляции CD34+CD71++ были соспоставимы с экспрессией CD71 клетками гранулоцитарного ростка (рис.П.1.17 А) и с CD34"CD71+ клетками эритроидного ряда (рис.П.1.17 В, Г красным на рисунках выделены СКК, фиолетовым ядросодержащие, то есть CD71+ клетки эритроидного ростка).

Во всех анализируемиых группах выявлено 2 популяции CD71+ клеток СКК, отличающихся по экспрессии CD236a - АГ+ (рис.П. 1. 17 Д, Е область R2), составляющие минимальное количество (1,0% и менее от всех CD34+ клеток) и CD71+ CD236a" клетки, составляющие большинство от CD34+CD71+ популяции. Причем среди CD71+ СКК имеются как CD34+ слабо экспрессирующие данные антиген, так и популяция CD34+CD71++. Таким образом, подтверждается факт экспрессии CD71 на СКК, не являющихся эритроидными предшествениками.

Субпопуляции мобилизованных СКК доноров и эффективность аллогенной трансплантации в детской онкологии

Наиболее эффективной стимуляция кроветворения оказалась у детей с опухолями мягких тканей, худший эффект мобилизации СКК зафиксирован у детей группы гемобластозов - острых миелоидных лейкозов и лимфомы Ходжкина.

СКК детей гемобластозами характеризовались повышенным содержанием субпопуляций CD34+CD45neg клеток, CD34+CD33+ клеток (р 0,04) и CD34+CD117+ клеток (р 0,01).

Наибольшее количество Thy-1+ СКК выявлено у больных медуллобластомой, тогда как количество CD34+CD38" СКК (р 0,007), количество CD34+CD117+ клеток (р 0,007), и количество CD34+CD33+ СКК (р=0,003) в данной группе было наиболее низким.

Наибольший процент CD34+ лейкоцитов в ЛП первого дня сбора установлен для группы ОССЮ (р=0,03) и группы мягкотканых опухолей (р=0,035) в сравнении с группой гемобластозов.

При отдельном рассмотрении некоторых нозологических единиц (ПНЕТ, СЮ, медуллобластома и нейробластома, ОМЛ, ЛХ) наилучший эффект мобилизации получен для детей с диагнозом нейробластома и СЮ. Наименьшей пропорция CD34+ лейкоцитов оказалась у больных ЛХ, а также в случае ОМЛ и медуллобластомы и в среднем составило 0,6%. Достоверные различия получены в отношении ЛХ при сравнении со всеми группами (р 0,03), ОМЛ и нейробластомы, медуллобластомы и нейробластомы (р=0,05 в обоих случаях).

Наиболее выраженной мобилизация субпопуляций CD45neg оказалась в группах гемобластозов (ЛХ и ОМЛ). СКК больных ОМЛ отличало более высокое содержание субпопуляций CD34+CD117+ и CD34+CD33+ СКК (р 0,04 в сравнении с медуллобластомой и ПНЕО) и полное отсутствие В-линейных предшественников (CD34+CD19+ и CD34+CD10+) среди СКК. СКК медуллобластомы отличало наименьшее содержание CD34+CD38" СКК (р 0,035 во всех случаях). Наибольшим у больных с медуллобластомой было число CD34+HLA-DR клеток (р 0,041). Выраженным среди СКК данной группы было количество В-линейных предшественников CD34+CD19+ (р 0,01, в сравнении с группами СЮ, ОМЛ и нейробластома) и мегакариоцитарных предшественников в сравнении с СЮ и нейробластомой 0X0,04). Группа ПНЕО характеризовалась наибольшим содержанием CD34+CD19+ СКК в сравнении с группой других солидных опухолей (р 0,003 для СЮ и нейробластомы). СКК нейробластомы характеризовались более выраженной пропорцией CD7+CD34+ CD56+CD34+ клеток (р 0, 02 для обеих субпопуляций в сравнении с ПНЕО и СЮ). В 50% случаев у детей мобилизация СКК была эффективной и позволила набрать пороговую трансплантационную дозу СКК за одну процедуру ЛФ.

Большая набранная доза CD34+ СКК в материале, полученном за один ЛФ, была ассоциирована с более низким содержанием в данном материале CD34+CD45l0W и CD34+HLA-DR CD38 субпопуляций, тогда как количество CD34+CD13+ и CD34+CD71+ СКК было более высоким. В группе образцов, содержащих более 3,0 х106/ кг CD34+ СКК выявлено преобладание более крупных СКК (CD34+FSC++, р= 0,004), CD34+CD45low СКК (р= 0,0001) и популяции CD34+HLA-DR CD38 (р= 0,025).

ЛП с оптимальным содержанием CD34+CKK на кг массы тела больного (от 2,0 до 4,99) в сравнении с группой мега-доз характеризовались преобладанием популяции CD34+CD45low (р=0,024), CD34+HLA-DR СКК (р=0,037), а также СКК с яркой экспрессией рецептора трансферрина (р=0,053) и CD34+CD45" СКК (р=0,039). Среди данных образцов в сравнении с материалом, содержащим менее пороговой дозы CD34+ СКК достоверно более высоким было количество CD13+ и CD71+ СКК (р 0,02 во всех случаях).

Более короткие сроки отмечены в случае трансплантации только периферических СКК, в сравнении с сочетанными (пСКК+КМ) трансплантациями - 10,5 дней против 14,5 дней для лейкоцитов до 1000 кл\мкл (р=0,0001) и 24,6 дня против 37,5 дней в случае восстановления тромбоцитов до 40 000 кл /мкл ( р=0,01).

При сопоставлении сроков восстановления лейкоцитов и тромбоцитов для больных, получивших при трансплантации 3,0х106 и более CD34+ СКК на кг массы тела и больных, получивших меньшее количество СКК, выявлены достоверные различия в скорости восстановления тромбоцитов как до 20 000, так и до 40 000 кл/мкл (16 дней против 22, и 22 дня против 35 дней, р=0,0001, соответственно). Более быстрое восстановление лейкоцитов было ассоциировано с меньшим количеством CD34+CD117+ (р=0,012), и с большим числом CD34+CD2+ (р=0,047). Более короткие сроки тромбоцитопении были опосредованы более низким содержанием в трансплантированной ткани CD34+HLA-DR+ (р=0,024), CD34+CD13+ (р=0,049) и CD34+ CD71++ (р=0,035) субпопуляций СКК.

При анализе скорости восстановления основных показателей крови в зависимости от пропорции субпопуляций СКК в ЛП первого дня сбора (независимо от того, за сколько лейкаферезов был набран трансплантационный материал) более быстрое восстановление лейкоцитов до 1000 клеток на мкл (в течение 10 дней) обусловлено содержанием более 3,0% CD45l0W и менее 65,0% CD38"CD34+ СКК. Более короткий срок критической тромбоцитопении (тромбоциты до 20 000 кл \мкл в течение 13 дней и лейкоциты до 1000 кл\мкл, в течение 9-10 дней) обусловлен трансплантацией не менее 3,0x106 СКК (на кг массы тела больного) содержащих менее 90,0% CD13+CD34+ клеток.