Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы .11
1.1. Эпидемиология первичных и метастатических карцином печени 11
1.2. Основные методы диагностики карцином печени 17
1.2.1. Методы лучевой диагностики 17
1.2.2. Серологические методы диагностики 18
1.2.3. Тонкоигольная аспирационная биопсия печени .19
1.2.4. Цитологические и иммуноморфологические характеристики первичных и метастатических карцином печени 24
1.3. Заключение 37
Глава 2. Материалы и методы исследования. 39
2.1. Характеристика материала для цитологического исследования. 39
2.2. Получение и подготовка материала для цитологического исследования 42
2.3. Фиксация и окрашивание цитологических препаратов 42
2.4. Методика микроскопического исследования цитологических препаратов 43
2.5. Дополнительные методы пробоподготовки цитологических препаратов 44
2.6. Иммуноцитохимическое исследование 45
2.7. Оценка полученных результатов при иммуноцитохимическом исследовании 48
2.8. Методика статистического анализа данных 48
Глава 3. Результаты собственных наблюдений 50
3.1. Биопсия печени 50
3.2. Сравнительная характеристика адекватности материала для цитологического исследования, полученного при сorе-биопсии и тонкоигольной аспирационной биопсии 52
3.3. Сравнительная характеристика результатов цитологического и гистологического исследований, полученного при сorе - биопсии .54
3.4. Оценка качества цитологических препаратов при сравнении традиционного способа нанесения материала и метода жидкостной цитологии 61
3.5. Оценка качества препаратов при использовании жидкостной цитологии и метода клеточного блока .66
3.6. Цитоморфологические особенности первичных и метастатических карцином печени .70
3.7. Иммуноцитохимическая диагностика карцином печени 101
3.7.1. Дифференциальная диагностика высокодифференцированной гепатоцеллюлярной карциномы и реактивно измененных гепатоцитов при нодулярной гиперплазии 101
3.7.2. Дифференциальная диагностика низкодифференцированных первичных и метастатических карцином печени 106
3.7.3. Определение первичного очага при метастазах аденокарцином в печень 113
3.7.4. Определение гормонального статуса метастатической карциномы молочной железы у пациенток, находящихся на диспансерном наблюдении 129
Заключение 137
Выводы 146
Практические рекомендации 148
Список сокращений 149
Список литературы 150
- Эпидемиология первичных и метастатических карцином печени
- Сравнительная характеристика результатов цитологического и гистологического исследований, полученного при сorе - биопсии
- Дифференциальная диагностика высокодифференцированной гепатоцеллюлярной карциномы и реактивно измененных гепатоцитов при нодулярной гиперплазии
- Определение гормонального статуса метастатической карциномы молочной железы у пациенток, находящихся на диспансерном наблюдении
Эпидемиология первичных и метастатических карцином печени
В клинической практике проблема своевременной диагностики карцином печени имеет большую актуальность, о чем свидетельствует факт отсутствия специфических симптомов заболевания не только на начальных, но нередко и на поздних стадиях процесса [9,27,131].
В России распространенность первичной карциномы печени (ПКП) составляет 6,35 на 100 000 населения [18]. Заболеваемость наиболее высока в районах, эндемичных по вирусному гепатиту В, особенно в странах Азии и в регионах Африки. Российская Федерация относится к странам со средней заболеваемостью, где ежегодно за последние 3 года регистрируется более 8 тыс. новых случаев, при этом доля активно выявленных больных невысокая и в последние года составляет не более 7%, что несомненно выше показателей предыдущих лет, особенно 2011года - 2,5% [3,18]. ПКП поражает все возрастные группы, но чаще всего встречается у лиц после 60–70-ти лет. По частоте встречаемости среди всех злокачественных новообразований у мужчин занимает 13 место, у женщин – 18 [18].
По экспертной оценке, ВОЗ, ежегодно в мире от ПКП погибает более 1,3 млн человек. Россия по показателям смертности занимает 3-е место в Европе и 31-е - в мире. [7,76]. Отмечается очень большой разброс показателя смертности от ПРП по регионам РФ. Наиболее высокая смертность отмечается в республиках Саха (16,5 на 100 тыс. мужчин и 8,2 на 100 тыс. женщин), Тыва (12,1 и 6,3 соответственно) и Магаданской области (10,9 и 6,1). Самая высокая смертность среди мужчин – в Чукотском автономном округе (21,6 на 100 тыс. населения), самый низкий соответствующий показатель в Липецкой области [3].
По классификации ВОЗ (2019 г.) ПКП по гистогенезу разделяют на гепатоцеллюлярную карциному (ГЦК), исходящую из гепатоцитов; холангиоцеллюлярную карциному (ХЦК), исходящую из эпителия желчных протоков; смешанную гепатохолангиоцеллюлярную и фиброламеллярную карциному (ФЛК), которая формально классифицируется как вариант ГЦК, а также гепатобластому.
Классификация ВОЗ опухолей печени и внутрипеченочных желчных протоков (2019г.).
Доброкачественные гепатоцеллюлярные опухоли
8170/0 Гепатоцеллюлярная аденома
HNF1A- инактивированная гепатоцеллюлярная аденома
Воспалительная гепатоцеллюлярная аденома
В-катенин активированная гепатоцеллюлярная аденома
В-катенин активированная воспалительная гепатоцеллюлярная аденома
Злокачественные гепатоцеллюлярные опухоли и предшественники 8170/3 Гепатоцеллюлярный карцинома, неспецифического типа 8171/3 Гепатоцеллюлярный карцинома, фиброламеллярная 8172/3 Гепатоцеллюлярный карцинома, скиррозная 8174/3 Гепатоцеллюлярный карцинома, светлоклеточного типа Гепатоцеллюлярный карцинома, по типу стеатогепатита Гепатоцеллюлярный карцинома, макротрабекулярная массивная Гепатоцеллюлярный карцинома, хромофобная Гепатоцеллюлярный карцинома, богатая нейтрофилами Гепатоцеллюлярный карцинома, богатая лимфоцитами 8970/3 Гепатобластома, неспецифического типа
Доброкачественные опухоли внутрипеченочных желчных протоков и предшественники
8160/0 Аденома желчного протока
9013/0 Аденофиброма, неспецифического типа
8148/0 Билиарная интраэпителиальная неоплазия низкой степени
8148/2 Билиарная интраэпителиальная неоплазия высокой степени 8503/2 Внутрипротоковое папиллярное новообразование с интраэпителиальной неоплазией низкой степени 8503/3 Внутрипротоковое папиллярное новообразование с интраэпителиальной неоплазией высокой степени 8470/0 Муцинозное кистозное новообразование с интраэпителиальной неоплазией низкой степени 8470/0 Муцинозное кистозное новообразование с интраэпителиальной неоплазией высокой степени 8470/0 Муцинозное кистозное новообразование, ассоциированное с инвазивной карциномой
Злокачественные опухоли внутрипеченочных желчных протоков
8160/3 Холангиокарцинома
Внутрипеченочная холангиокарцинома большого желчного протока Внутрипеченочная холангиокарцинома малого желчного протока
8020/3 Недифференцированная карцинома, неспецифического типа
8180/3 Комбинированная гепатоцеллюлярная карцинома и
8240/3 холангиокарцинома
8240/3 Нейроэндокринная опухоль неспецифического типа
8249/3 Нейроэндокринная опухоль, G-1
8249/3 Нейроэндокринная опухоль, G- 2
8246/3 Нейроэндокринная опухоль, G- 3
8013/3 Нейроэндокринная карцинома неспецифического типа
8041/3 Крупноклеточная нейроэндокринная карцинома
8154/3 Мелкоклеточная нейроэндокринная карцинома
Смешанная нейроэндокринная и не нейроэндокринная опухоль (MiNEN)
Основная доля поражений приходится на ГЦК: более 85% ПКП. ГЦК -опухолевая патология печени с агрессивным течением и неблагоприятным прогнозом: 5-летняя выживаемость не превышает 15%. В мире, в структуре онкологической заболеваемости ГЦК занимает 6 место среди всех регистрируемых случаев рака и 2-е место среди причин онкологической смертности. Наибольшая заболеваемость и смертность от ГЦК наблюдается в странах эндемичных по хронической вирусной инфекции печени. В Европе ГЦК составляет 2% всех злокачественных новообразований и обычно встречается у лиц на 6 – 7 -ом десятилетии [76].
Фиброламеллярная карцинома - вариант ГЦК, который выявляется преимущественно у детей, подростков и взрослых до 30–35 лет, не страдающих хроническим заболеванием печени. По приблизительным оценкам, ФЛК составляет около 5% всех случаев ГЦК, варьируясь от 0,85 до 16% в зависимости от дизайна исследования [40,90]. ФЛК имеет более благоприятный прогноз, пятилетняя выживаемость составляет до 80%, а пятилетняя безрецидивная выживаемость составляет от 18 до 50% [90]. Полученные к настоящему времени данные о клеточном происхождении этого типа опухоли неоднозначны. Предполагается, что ФЛК представляет собой подтип ГЦК, развивающийся из бипотентных гепатоцитарных клеток предшественников, не содержащих мутаций и хромосомных аберраций, наиболее часто обнаруживаемых при ГЦК [126,67,107].
Вторым по распространенности раком печени является холангиоцеллюлярная карцинома с самым высоким уровнем заболеваемости в Юго-Восточной Азии (30–40 случаев на 100000 населения) и низкой заболеваемостью в западных странах (менее 5 случаев на 100000 населения) [13, 25,30,56]. ХЦК в большинстве случаев возникает после 50 лет и чаще встречается у женщин. Факторами риска развития данной патологии являются склерозирующий холангит, кисты желчных протоков, паразитарная инвазия желчных путей сосальщиками [13,56]. В зависимости от локализации опухолевого поражения ХЦК классифицируется как внутрипеченочный и внепеченочный. Во внепеченочном варианте выделяют опухоли проксимальных (опухоль Клацкина) и дистальных желчных протоков [24]. В патогенезе нарушения клеточной дифференцировки при ХЦК большая роль отводится значительному разнообразию хромосомных аберраций [126]. По макроскопическим характеристикам различают следующие формы ХЦК: узловую, перипротоковую инфильтративную, внутрипротоковую и смешанную узловую с перипротоковой инфильтрацией. Последний вариант, редко встречающийся в Европе, относят к агрессивным формам ХЦК, сопровождающимся низкой продолжительностью жизни [39,126].
Гепатобластома - наиболее распространенная злокачественная опухоль печени у детей, которая развивается из эмбриональных плюрипотентных клеток. Составляет 1% злокачественных новообразований в педиатрии и 79% всех случаев рака печени у детей [16].
Показатель заболеваемости составляет 0,1 на 100 тыс. детского населения в возрасте 0–14 лет [19], а соотношение мальчики: девочки — 1,2-3,6:1 соответственно [151]. Общая частота встречаемости гепатобластом 0,5-1,5 случая на миллион, при этом 11,2 приходится на возраст до 18 месяцев [151] и 5% случаев гепатобластом диагностируются у детей старше 4 лет [91].
Сравнительная характеристика результатов цитологического и гистологического исследований, полученного при сorе - биопсии
С учетом клинических данных сравнительная оценка гистологических и цитологических результатов исследования мазков-отпечатков при сorе-биопсии представлена в таблице 7. Полное совпадение цитологического и гистологического результатов при сorе-биопсии в 80,3% (159/198) наблюдений. При доброкачественных процессах при сorе-биопсии полное совпадение цитологического и гистологического результатов имело место в 50% (9/18) наблюдений. Однако, при анализе данных случаев ввиду выраженного полиморфизма гепатоцитов возникали вопросы дифференциальной диагностики с ГЦК. Неинформативный материал для цитологического и гистологического исследований при сorе-биопсии имел место в 8,6% (17/198) наблюдений.
Без учета клинических данных наблюдения были расценены как ложноположительные цитологические заключения.
При повторном изучении обсуждаемых 26 цитологических препаратов с ложноотрицательными заключениями с учетом гистологического заключения не удалось ни в одном случае выявить признаки злокачественного процесса (табл.8).
Наибольшие затруднения при оценке патологического процесса по традиционным цитологическим препаратам вызвало одно наблюдение, где ошибочно установлено ложноотрицательное заключение о реактивной гиперплазии гепатоцитов (рис.1А), и одно наблюдение, где ошибочно установлено ложноположительное заключение о наличии гепатоцеллюлярного рака (рис.1Б). При сравнении морфологии гепатоцитов в данных наблюдениях обращает на себя внимание мономорфность клеток, отсутствие комплексов, минимального полиморфизма в клетках, отсутствие нуклеол в ядрах при высокодифференцированном ГЦК (рис.1А). И наоборот, выраженный клеточный и ядерный полиморфизм с наличием гипертрофированных нуклеол наблюдался в участке очаговой гиперплазии печени, что может объективно приводить к ложноположительному диагнозу даже опытного цитолога (рис.1Б). А. Б.
Данный факт является объективной причиной ограничения возможности традиционного цитологического метода исследования и свидетельствует о необходимости применения дополнительных методов цитологической диагностики.
Особое внимание было уделено 12 наблюдениям из 198 сore-биопсий (6,1%) с ложноотрицательными гистологическими результатами, которые без учета клинических данных изначально были отнесены к ложноположительным цитологическим результатам. При ретроспективном просмотре препаратов цитологический диагноз после сопоставления с гистологическим не изменился:
в 6-ти случаях core-биопсия осуществлялась у пациентов, имеющих в анамнезе карциному с верификацией первичного опухолевого очага и клинические данные метастатического процесса; повторное взятие материала было нецелесообразным, несмотря на отсутствие гистологической верификации метастатического поражения печени по причине получения неинформативного материала;
в 3-х случаях при повторном взятии материала цитологический диагноз подтвердился гистологической верификацией карциномы метастатического характера;
в 3-х случаях по морфологии клеточного состава доставленного материала цитологическая картина соответствовала гепатоцеллюлярному раку, и при повторном получении материала для гистологического исследования цитологический диагноз первичной карциномы печени подтвердился (рис. 2-4).
Клиническое наблюдение 1. Ж. 34 года. Данные УЗИ: объемное образование печени.
Результат цитологического и гистологического исследований материала, полученного при core-биопсии представлены на рисунке 2.
В цитологических препаратах, полученных путем мазков - отпечатков при core биопсии, множественные обширные плотные комплексы из гепатоцитов с умеренным клеточным полиморфизмом (рис.2А).
В гистологических препаратах уже операционного материала четко определяется ГЦК трабекулярного строения, не имеющая четкой границы с окружающей ее паренхимой печени. Строма представлена эластическими прослойками в виде перегородок, разделяющих трабекулы (рис.2Б).
Гепатоциты с умеренным клеточным полиморфизмом. Традиционный препарат.
Окраска MGG. Объектив х 20. Б. ГЦК трабекулярного строения. Гистология.
Операционный материал. Окраска гематоксилином и эозином. Объектив х 20. Клиническое наблюдение 2. М. 59 лет. Данные УЗИ: объемное образование печени.
Результаты цитологического и гистологического исследований материала, полученного при core-биопсии, представлены на рисунке 3. В цитологических препаратах обширные поля гепатоцитов с незначительным полиморфизмом и нарушением ядерно-цитоплазматического соотношения, встречаются двуядерные клетки (рис.3А). В биоптате повторной соrе-биопсии карцинома ГЦК трабекулярного строения. Строма представлена в виде перегородок, разделяющих трабекулы, видны оптически пустые сосуды и желчные протоки в портальных зонах (рис.3Б).
Клиническое наблюдение 3. М. 62 года. Данные УЗИ: объемное образование печени.
Результаты цитологического и гистологического исследований материала, полученного при core-биопсии, представлены на рисунке 4. В цитологических препаратах обширные поля полиморфных «голых» ядер с наличием внутриплазматических включений (рис.4А). В гистологических препаратах повторной соrе-биопсии ГЦК трабекулярного строения с участками солидного строения, не имеющая четкой границы с окружающей ее паренхимой печени; опухолевые клетки наряду с гепатоцитами присутствуют в составе ложных долек или полностью их заполняют. Строма представлена в виде перегородок, разделяющих трабекулы, видны оптически пустые сосуды и желчные протоки в портальных зонах (рис.4Б).
Сопоставление цитологических и гистологических диагнозов при соrе-биопсии приведено в таблицах 9,10. Исходя из данных сопоставления результатов цитологических и гистологических диагнозов при соrе-биопсии, показана целесообразность совместного исследования трепанобиоптатов при core-биопсии двумя методиками, что повышает чувствительность и достоверность морфологического исследования.
Дифференциальная диагностика высокодифференцированной гепатоцеллюлярной карциномы и реактивно измененных гепатоцитов при нодулярной гиперплазии
Проведение дифференциальной диагностики высокодифференцированного ГЦК и реактивно измененных гепатоцитов при нодулярной гиперплазии является сложной задачей. Рекомендованная панель из основных антител, представленная HSP70, glutaminе synthetase, GPC3, ARG1 имеет высокую чувствительность и специфичность. В нашем исследовании для дифференциальной диагностики высокодифференцированной ГЦК и реактивно измененных гепатоцитов при нодулярной гиперплазии на материале клеточного блока мы применяли GPC3, ARG1, CD34. Однако в традиционных цитологических препаратах и препаратах Cellspin из-за особенностей нанесения материала трудно идентифицировать архитектонику опухоли, что ограничивает применение антител, а именно CD34. Этим требованиям соответствовал препарат КБ. В интернет поисковых системах мы не нашли ни одной работы, отражающей применение CD34 для диагностики ГЦК на материале ТИАБ/клеточных блоках; в зарубежных работах встречаются единичные сообщения, лишь отражающие применение GPC3, ARG1на материале клеточных блоков.
CD34 является маркером эндотелиальных клеток, окружающих трабекулы ГЦК, и экспрессируется в пролиферирующих эндотелиальных клетках при злокачественной трансформации. CD34 обычно не экспрессируется в синусоидальном эндотелии печени.
Клинические наблюдения цитологической и ИЦХ диагностики высокодифференцированного ГЦК приведены на рисунках 42-44.
Клиническое наблюдение 7. М. 58 лет. Данные УЗИ: объемное образование печени.
Результаты цитологического и ИЦХ исследований материала, полученного при ТИАБ, представлены на рисунке 42. В цитологических препаратах, полученных путем ЖЦ, обширные комплексы из гепатоцитов с умеренным клеточным полиморфизмом (рис.42А). При ИЦХ исследовании на материале КБ определяется яркая ядерная и цитоплазматическая реакция с антителом к ARG1 (рис.42Б), слабая цитоплазматическая реакция с антителом к GPC3 (рис.42В), положительная реакция CD34 в соединительнотканных прослойках, разделяющих структуры ГЦК (рис.42Г).
Клиническое наблюдение 8. М. 61 год. Данные УЗИ: объемное образование печени. Результаты цитологического и ИЦХ исследований материала, полученного при ТИАБ, представлены на рисунке 43. В цитологических препаратах, полученных путем ЖЦ, обширные поля мономорфных гепатоцитов со светлой пенистой цитоплазмой и с незначительным ядерным полиморфизмом (рис.43А).
При ИЦХ исследовании на материале КБ определяется яркая ядерная и цитоплазматическая реакция с антителом к ARG1 (рис.43Б), яркая цитоплазматическая реакция с антителом к GPC3 (рис.43В), положительная реакция CD34 в соединительнотканных прослойках, разделяющих структуры ГЦК (рис.43Г).
Клиническое наблюдение 9. М. 67 год. Данные УЗИ: объемное образование печени.
Результаты цитологического и ИЦХ исследований материала, полученного при ТИАБ, представлены на рисунке 44. В цитологических препаратах, полученных путем ЖЦ, обширные поля мономорфных гепатоцитов с незначительным ядерным полиморфизмом, лежащих как разрозненно, так и в плотных комплексах, значительная часть в виде «голых» ядер (рис.44А). При ИЦХ исследовании на материале КБ определяется яркая ядерная и цитоплазматическая реакция с антителом к ARG1 (рис.44Б), яркая цитоплазматическая реакция с антителом к GPC3 (рис.44В), положительная реакция CD34 в соединительнотканных прослойках, разделяющих структуры ГЦК (рис.44Г).
В сложных диагностических случаях исследование образцов клеточных блоков показало, что панель из 3 антител GPC3, ARG1, CD34 существенно облегчает работу цитолога при дифференциальной диагностике высокодифференцированного ГЦК и реактивно измененных гепатоцитов при нодулярной гиперплазии. В целом отмечено, что положительное окрашивание по крайней мере 2 или 3 маркеров подтверждает диагноз ГЦК, но отсутствие окрашивания было недостаточным, чтобы исключить ГЦК в условиях ограниченного количества клеточного материала, полученного при ТИАБ.
В нашей работе при дифференциальной диагностике высокодифференцированного ГЦК и реактивно измененных гепатоцитов при нодулярной гиперплазии применение 3 антител позволило выставить утвердительный диагноз о наличии высокодифференцированного ГЦК у 5 пациентов, подтвержденный впоследствии гистологически на операционном материале.
В 100% (n=12) наблюдений ГЦК отмечалось ядерное и цитоплазматическое окрашивание с антителом к ARG1 и в 83,3% (n=10/12) наблюдений яркий мембранный тип экспрессии CD34 в соединительнотканных прослойках, разделяющих структуры высокодифференцированного ГЦК, что не было отмечено ни в одном из 18 наблюдений в участках реактивной гиперплазии гепатоцитов и ни в одном случае метастатического поражения печени. Необходимо учитывать, что небольшая часть ГЦК может быть гиповаскулярной. Цитоплазматическое окрашивание на антитело к GPC3 отмечено в 75% (n=9/12) наблюдений ГЦК.
Определение гормонального статуса метастатической карциномы молочной железы у пациенток, находящихся на диспансерном наблюдении
В работе проведен сравнительный анализ ИЦХ метода определения уровня рецепторов эстрогенов и прогестеронов, белка пролиферативной активности Ki-67 и онкопротеина Her2-neu в метастатическом очаге у 21 пациента, получавших химиотерапию по поводу рака молочной железы с ИГХ данными, полученными до проведения химиотерапии на операционном материале. Иммуноцитохимический анализ уровня рецепторов стероидных гормонов имеет полуколичественную оценку, проводили по D.C. Allred и соавт. (1998), (табл.16).
Показатель степении ээкспрессии рецепторов стероидных ггормонов определяется суммой баллов, отражающих интенсивность окраски и долю окрашенных клеток (рис. 65А,Б, 65А,Б). Эстроген позитивными опухоли считаются опухоли при сумме баллов более 3.
Иммуноцитохимический анализ уровня рецепторов эпидермального фактора роста (HER2-neu) определялся по интенсивности и типу окрашивания мембран клеток по шкале от 0 до 3+ (табл.17) и процента позитивных опухолевых клеток (рис.67А,Б,В). Иммунное окрашивание, представленное в цитоплазме, не учитывалось при оценке HER2-статуса опухоли.
Иммуноцитохимический анализ уровня пролиферативной активности (Ki-67) определялся в репрезентативных полях зрения при увеличении 20 с указанием индекса пролиферативной активности (процентное соотношение окрашенных и неокрашенных ядер клеток на 100 учтенных клеток) (рис.68 А,Б).
Учитывая данные частоты дискордантности по рецепторному статусу первичной опухоли и регионарных метастазов, а также изменение рецепторного статуса после воздействия на опухоль химиотерапевтического лечения, считаем нецелесообразным проводить сравнительный анализ результатов ИЦХ исследования и данных ИГХ исследования первичного очага. Определение статуса стероидных гормонов и HER2 в метастатическом очаге после лечения открывает новые возможности для последующей терапии, в том числе таргетной. После проведенных полных курсов химиотерапии при прогрессировании заболевания статус рецепторов стероидных гормонов и HER2- статус в очаге метастазирования по сравнению со статусом первичного очага изменился у 6 из 21 пациента с карциномой молочной железы (28,6%):
-статус с HER2-негативного на HER2-позитивный был изменён у 1 пациентки; -статус с ER-негативного на ER-позитивный изменен у 3 пациентов и с ER-позитивного статуса на ER-негативный – у 1 пациентки;
- статус c PR-негативного на PR-позитивный изменен у 1 пациентки и с РR-позитивного на РR-негативные изменения не наблюдалось.
Таким образом, ИЦХ исследование позволяет достоверно объективно установить диагноз первичной опухоли, уточнить ее гистогенетическую принадлежность или исключить наличие первичной опухоли в печени.
На основании проделанной нами работы разработан алгоритм комплексной цитологической (рис69.А) и ИЦХ (рис.68Б) диагностики нодулярной гиперплазии печени, первичных и метастатических карцином.