Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Лекарственная устойчивость 10
1.2. Лекарственная устойчивость к препаратам класса нитрозомочевин 11
1.3. Механизмы лекарственной устойчивости меланомы 13
1.3.1. Белки-транспортеры семейства ABC, участвующие в развитии МЛУ меланомы 14
1.3.2. Меланосомы 16
1.3.3. Глутатион S-трансферазы в развитии резистентности меланомы 17
1.3.4. Повышенная активность протоновых помп 18
1.3.5. Активность антиапоптотических белков семейства Bcl-2 19
1.3.6. Активация ядерного фактора NFB 20
1.3.7. р53 и р63 21
1.3.8. Мутации NRAS/BRAF 22
1.3.9. Повышенная способность к репарации ДНК 23
1.4. Молекулярные механизмы преодоления лекарственной устойчивости
липосомальными противоопухолевыми препаратами 24
1.4.1. Липосомальный доксорубицин преодолевает МЛУ, связанную с
гиперэкспрессией ABC-транспортеров 26
1.4.2. Липосомальный цисплатин преодолевает резистентность 28
1.4.3. Липосомальные препараты из класса нитрозомочевин преодолевают
лекарственную устойчивость, связанную с отсутствием CD95-рецептора 30
1.5. Сигнальные пути клеточной гибели 31
1.6. Заключение 36
Глава 2. Материалы и методы исследования 38
2.1. Материалы и оборудование 38
2.2. Методы исследования 42
2.2.1. Изучение цитотоксического действия препаратов методом МТТ-тест 42
2.2.2. Определение апоптоза методом двойного окрашивания аннексином V-FITC и пропидием йодидом 43
2.2.3. Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) 44
2.2.4. Подготовка клеточного материала и выделение общей РНК 45
2.2.5. Количественная полимеразно-цепная реакция в реальном времени и
определение уровня экспрессии мРНК рецепторов клеточной гибели
суперсемейства TNFSFR 46
2.2.6. Определение уровня экспрессии мРНК Beclin 1 с помощью ПЦР с обратной транскрипцией 47
2.2.7. Определение активных каспаз-3, -8 и -9 48
2.2.8. Оценка выброса родамина 123 на клеточных линиях меланом человека 48
2.3. Статистическая обработка результатов 49
Глава 3. Результаты исследований 50
3.1. Рецепторы внешнего пути апоптоза в клетках линий меланомы человека 50
3.1.1. Экспрессия мРНК рецепторов внешнего пути апоптоза в клетках линий меланомы человека, используемых в исследовании 50
3.1.2. Влияние аранозы-лио, липосомальной аранозы и пустых липосом на экспрессию мРНК рецепторов внешнего пути апоптоза 53
3.1.3. Заключение 56
3.2. Цитотоксическая активность и механизм клеточной гибели, индуцируемый противоопухолевыми препаратами из класса нитрозомочевин 57
3.2.1. Цитотоксическая активность и механизм клеточной гибели, индуцируемый аранозой-лио и липосомальной аранозой 58
3.2.2. Цитотоксическая активность и механизм клеточной гибели, индуцируемой ормустином-лио и липосомальным ормустином 64
3.2.3. Заключение 68
3.3. Влияние лекарственных форм препаратов класса нитрозомочевин на активацию каспаз 69
3.3.1. Активация каспаз -8 и -9 после инкубации клеток меланомы с липосомальной аранозой и аранозой-лио 69
3.3.2. Активация каспазы-3 после инкубации клеток меланомы с липосомальной аранозой и аранозой-лио 76
3.3.3. Активация каспаз -3, -8 и -9 после инкубации клеток меланомы с липосомальным ормустином и ормустином-лио 79
3.3.4. Заключение 84
3.4. Влияние липосомальной аранозы и аранозы-лио на индукцию аутофагии 85
3.5. Оценка изменения функциональной активности Р-гликопротеина по выбросу родамина 123 на клеточных линиях меланомы под влиянем лекарственных форм аранозы 3.5.1. Изучение влияния аранозы на развитие лекарственной устойчивости через усиление активности Р-гликопротеина 90
3.5.2. Оценка способности аранозы блокировать функцию Р-гликопротеина 92
3.5.3. Влияние лекарственных форм аранозы на функциональную активность Р гликопротеина 94
3.5.4. Заключение 98
Глава 4. Обсуждение результатов исследований 99
Выводы 105
Список сокращений 106
Список литературы 107
- Белки-транспортеры семейства ABC, участвующие в развитии МЛУ меланомы
- Изучение цитотоксического действия препаратов методом МТТ-тест
- Экспрессия мРНК рецепторов внешнего пути апоптоза в клетках линий меланомы человека, используемых в исследовании
- Активация каспаз -3, -8 и -9 после инкубации клеток меланомы с липосомальным ормустином и ормустином-лио
Белки-транспортеры семейства ABC, участвующие в развитии МЛУ меланомы
Участие АВС-транспортеров в развитии МЛУ меланомы активно изучалось долгие годы, и долгое время велись дискуссии относительно преобладания того или иного белка в развитии резистентности. В исследовании W. Berger et al. [58] мРНК MRP1 и экспрессии этого белка на 40 клеточных линиях меланомы показали, что чувствительность к большому числу химиопрепаратов обратно коррелирует с экспрессией MRP1. Анализ экспрессии мРНК MRP1 и MDR1 в 18 образцах опухолей, полученных от пациентов с меланомой, показал в большинстве опухолей до лечения экспрессию MRP1, которая возрастала после химиотерапии. Однако мРНК MDR1 не удалось определить ни в одном из образцов. Похожие результаты получили D. Schadendorf et al.: 43 % первичных и метастатических меланом экспрессировали MRP1, тогда как MDR1 определили только в одной первичной опухоли [133]. Авторы предположили, что природа МЛУ меланомных клеток вряд ли связана с MDR1/Pgp. В противоположность этим результатам, A. Molinari et al. при изучении культуры клеток меланомы человека М14 обнаружили наличие MDR1, а не MRP1 [118]. В дальнейшем этой же группой ученых было проведено сравнение субклонов меланомы М14 (устойчивой к химиотерапии MDR1-позитивной и чувствительной MDR1-негативной) и было показано, что MDR1/Pgp связан с МАРК-сигнальным путем и вовлечен в миграцию и метастазирование меланомы [68]. N. Walsh et al. провели ретроспективное исследование экспрессии белков-транспортеров MDR1 и MRP1 у 134 больных меланомой, включая 92 с первичной опухолью и 42 – с метастатической, и обнаружили, что чаще при меланоме эксперссирован MRP1, но, в отличие от результатов D. Schadendorf et al., эта группа исследователей обнаружила значительно более высокий процент MRP1 при метастатической меланоме, по сравнению с первичными опухолями [153]. Также экспрессия MDR1/Pgp была обнаружена более чем в половине исследованных образцов.
Таким образом, экспрессия MDR1 и MRP1 часто встречается при меланоме, особенно метастатической, и участвует в развитии лекарственной устойчивости меланомы. Соответственно, ингибирование этих белков-транспортеров может быть важным этапом в преодолении МЛУ меланомы.
Большой интерес вызывает субпопуляция опухолевых клеток меланомы, экспрессирующая белок-транспортер АВСВ5. Эти клетки обладают повышенной туморогенностью и свойствами стволовых клеток [134]. Белок АВСВ5 на 73% гомологичен АВСВ1 (MDR1), впервые был выявлен в тканях нейроэктодермального происхождения, в частности, в предшественниках меланоцитов, в клеточных линиях меланомы и образцах опухолей, полученных от пациентов. Экспрессия АВСВ5 также обнаружена в ограниченных субпопуляциях клеток гепатокарциномы и колоректального рака. АВСВ5-положительные клетки меланомы обладают свойствами самообновления и дифференцировки. Увеличение их количества в образцах опухолей больных меланомой положительно коррелирует с прогрессией новообразования, подтверждая, что экспрессия АВСВ5 связана с агрессивностью заболевания. Более того, в исследовании, проведенном T. Schatton et al., лечили мышей с ксенографтами меланомы моноклональными антителами АВСВ5, и рост опухоли приостанавливался [134]. Как член семейства АВС-транспортеров, АВСВ5 принимает участие в развитии резистентности за счет повышенного выброса лекарственных препаратов [151]. Это было показано в экспериментах при измерении внутриклеточного накопления родамина 123 и доксорубицина в клетках меланомы [80; 81]. M. Chartrain et al. исследовали влияние препаратов, применяемых для лечения меланомы, на АВСВ5-экспрессирующих клетках [61]. На модели ксенографта меланомы WM266-4 in vivo показали, что после терапии темозоломидом происходила значительная регрессия опухоли, однако выжившие клетки оказались АВСВ5-положительными. Эти результаты далее были подтверждены в исследовании, проведенном на образцах опухолей пациентов, получавших дакарбазин – эталонный препарат для лечения метастатической меланомы. Аналогичные результаты были получены при лечении вемурафенибом, ингибитором мутированной киназы V600E BRAF, и рядом других химиопрепаратов. АВСВ5-положительные клетки оставались живы при цитотоксических для других популяций клеток концентрациях лекарств.
Доказано, что антимеланомная терапия способствует приобретению химиорезистентности путем отбора субпопуляций опухолевых клеток, экспрессирующих АВСВ5. Эти данные важны для понимания природы рецидивов, наблюдаемых после лечения меланомы. Мониторинг АВСВ5 можно использовать для оценки эффективности лечения меланомы. Также АВСВ5 может быть потенциальной мишенью при лечении меланомы [61]. Y. Luo et al. описали минорную популяцию клеток меланомы, которая гиперэкспрессировала АВСВ1 и АВСВ5, а также выбрасывала флуоресцентный краситель Хёхст и противоопухолевые препараты [111]. Подобные минорные популяции встречаются в гемопоэтических стволовых клетках и химиорезистентных клетках некоторых солидных опухолей, однако впервые были выделены из клеток меланомы человека [88]. Обнаружили, что минорная популяция клеток меланомы, полученная из клинических образцов, была резистентна к паклитакселу, субстрату АВСВ1, in vitro и in vivo. Однако эти клетки были также устойчивы к темозоломиду, который не является субстратом АВС-транспортеров. Резистентность к темозоломиду обеспечивалась через усиление способности к восстановлению ДНК и повышение экспрессии IL-8 [111]. Генетические исследования идентифицировали 3 сигнальных пути (NFB, -6-4-интегрин и IL-1), которые были активны в побочной популяции меланомных клеток. Y. Luo et al. полагают, что эта АВСВ1- и АВСВ5-положительная минорная популяция является источником резистентных клеток в меланомах, и что обнаруженные гены активных сигнальных путей могут быть потенциальной мишенью для эффективной терапии меланомы [111].
Изучение цитотоксического действия препаратов методом МТТ-тест
Клетки рассаживали в 6-луночные планшеты в количестве 200 тысяч/лунка в 4 мл полной среды RPMI-1640 c 10% ТЭС. Через сутки в лунки с клетками добавляли исследуемые препараты. В контрольных лунках клетки инкубировали без препаратов. Через 24 ч инкубации клетки снимали 500 мкл раствора Версена, кроме клеточной линии mel Kor, отмывали и помещали в пробирки по 100 тысяч клеток на пробирку в 100 мкл аннексин-связывающего буфера. В пробирки добавляли по 5 мкл аннексина V-FITC и 5 мкл пропидия йодида (PI). Образцы инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут. Далее к пробам добавляли 400 мкл аннексин-связывающего буфера и проводили анализ на проточном цитомфлуориметре FACSCanto II (Becton Dickinson). Клетки анализировали на основе параметров, измеряемых проточной цитометрией. Клетки в момент прохождения через луч лазера рассеивают свет во всех направлениях и испускают небольшое количество света за счет флуоресценции. Размер и форму клеток определяет прямое рассеивание света (FCS) – количество света в направлении лазерного пучка под углом 0, тогда как боковое рассеивание (SSC) – под углом 90 по отношению к лазерному пучку определяет структурные особенности различных популяций клеток. На цитограмме устанавливали соответствующее окно дискриминации (гейт), в котором на основании SSC и FCS вырезали основной пул клеток с целью удаления крупных (агрегаты) частиц и мелких (дебрис) частиц. Интенсивность флуоресценции проводилась с учетом анализа гистограмм. На гистограммах по оси Y отображено число событий (число клеток), а по оси X – интенсивность флуоресценции. В зависимости от цели исследования в каждом образце накапливали не менее 10 тысяч событий. Длина волны для красной флуоресценции (РI) устанавливалась в канале РЕ-флуоресценции (585/42 нм), а длина волны для зеленой флуоресценции устанавливалась в канале FITC (530/30 нм). При анализе двойного окрашивания клеток в режиме «dot plot» аннексином V-FITC (AnnV-FITC) в сочетании с PI были получены данные в логарифмическом измерении для обоих каналов FITC и РЕ.
Анализ апоптотических клеток, окрашенных AnnV-FITC/PI, проводился по следующим параметрам: интактные (живые) клетки AnnV-FITC–/PI–; ранний апоптоз AnnV-FITC+/PI и поздний апоптоз или некроз AnnV-FITC+/PI+ .
Экспрессию CD95 антигена исследовали в реакции иммунофлуоресценции. Для этой реакции клетки снимали с культуральных флаконов раствором Версена в объеме 2 мл. После чего клетки дважды отмывали раствором PBS с pH=7,4 по 1 мл. Далее готовили необходимое количество образцов из расчета 500 тысяч клеток/ 50 мкл PBS. В образцы добавляли по 10 мкл моноклональных антител CD95, меченных фикоэритрином (PE), и инкубировали в течение 30 мин при t=+4 C. Затем клетки дважды отмывали в 1 мл раствора РВS, после ресуспендировали образцы в 350 мкл 1% раствора формалина в PBS и анализировали на проточном цитофлуориметре FACSCanto II (Becton Dickinson).
Клетки снимали с культуральных флаконов 0,02% раствором Версена, объемом 2 мл, содержащим 0,25% трипсина. Клетки находились в трипсине 2 минуты при постоянном наблюдении за их состоянием с помощью микроскопа. Добавляли 10 мл буфера STE (0,1M NaCl; 1M Tris-HCl pH=8.0; 1mM EDTA) и центрифугировали в течение 5 мин при 800 об/мин. Удаляли супернатант, а клеточный осадок ресуспендировали в 5 мл физиологического раствора и центрифугировали в течение 5 мин при 1200 об/мин. Из полученного осадка клеток далее выделяли РНК.
Выделение РНК из предварительно обработанных образцов производилось по протоколу, предложенному P. Chomczynski и N. Sacchi [66]. Подготовленный клеточный материал лизировали в 0,5 мл гуанидин-тиоционатного буфера (4M гуанидин-тиоционата, 25mM цитрата Na, 0,5% N-лаурилсаркозила Na и 0,1M меркаптоэтанола). Во время лизиса материал пропускали через иглу 19G не менее 20 раз. Далее в пробирку добавляли 0,5 мл водонасыщенного фенола (pH=5,2), и 0,125 мл раствора ацетата Na (pH=4,2), встряхивали, и добавляли 0,25 мл хлороформа. Полученную смесь встряхивали до молочно-белого цвета и центрифугировали в течение 10 мин при 12000 об/мин и охлаждении до +4C. После центрифугирования отбирали 0,65 мл верхней водной фазы, содержащей клеточную РНК, и смешивали с 0,65 мл изопропанола. Инкубация РНК в изопропаноле проводилась в течение 20 часов при температуре –20 C. После инкубации РНК осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 12000 об/мин, удаляли супернатант и дважды промывали в 80% этаноле. После промывок осадок РНК высушивали в термостате в течение 20 минут при +37 С, растворяли в деионизованной воде, и измеряли концентрацию раствора. Для синтеза кДНК с использованием ревертазы брали 2 мкг матричной РНК, выделенной на предыдущем этапе. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием фермента RevertAid Reverse и коммерческого набора реактивов (Fermentas, США) в условиях, предложенных фирмой-производителем. Для отжига использовали смесь случайных гексамеров (Синтол, Россия). В качестве отрицательного контроля использовали рабочую смесь без добавления РНК. Пробу доводили до конечного объема 120 мкл деионизованной водой.
Количественную ПЦР в реальном времени проводили с использованием двукратной реакционной смеси (40 мM Tris-HCl, 100 мM KCl, 4 мM MgCl2, 1 мM каждого из четырех дезоксирибонуклеотидов и 0,2 мM -меркаптоэтанола) и Taq ДНК-полимеразы (Fermentas, США). В каждую пробу было добавлено 5 l кДНК, 250 nM прямого, 250 nM обратного праймера и 140 nM флуоресцентного зонда.
В каждом образце был исследован уровень экспрессии следующих генов: DR3, DR4/5, FAS, TNFR1, TNFR2 и TRAIL. Уровень экспрессии определяли относительно гена ABL.
Данный эксперимент проводился на приборе DTlite, (ДНК-технология, Россия). Программа проведения реакций был следующий: предварительная обработка 5 минут при +94C; денатурация 10 секунд при +94C; отжиг праймеров и синтез 12 секунд при + 60C.
Для детекции флуоресценции был выбран канал Hex. Измерения велись относительно гена ABL, уровень экспрессии которого был принят за 100%. В качестве положительного контроля использовали векторы pET-15b, экспрессирующие клонированные геномные последовательности. Правильность синтезированных олигонуклеотидных последовательностей подтверждена секвенированием по Сэнгеру на анализаторе ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Количественный уровень экспрессии мРНК исследуемых генов определялся относительно уровня экспрессии контрольного гена ABL по формуле (количество мРНК целевого гена)/(количество мРНК контрольного гена)100%=уровень экспрессии целевого гена в % по общепризнанной методике [119]. Количество мРНК контрольного гена ABL в образце определялось по калибровочной кривой, полученной после проведения ПЦР в реальном времени c количественными стандартами. В качестве стандартов использовались разведения олигонуклеотидной последовательности, соответствующей фрагменту гена ABL, с концентрациями 103, 104 и 105 молекул олигонуклеотида в миллилитре. Образцы считались неинформативными в случае, если среднее количество молекул мРНК контрольного гена ABL в трёх повторах эксперимента составляло меньше 2103.
Экспрессия мРНК рецепторов внешнего пути апоптоза в клетках линий меланомы человека, используемых в исследовании
Инкубация клеток меланомы с лекарственными формами препаратов из класса нитрозомочевин аранозы и ормустина приводит к активации инициаторных каспаз -8 и -9, что говорит об инициации как внешнего, так митохондриального путей апоптоза. Обнаружено, что процент клеток с активными каспазами значимо не меняется при сравнении действия «липосомальной» лекарственной формы и «лиофилизата для приготовления раствора для инъекций» препаратов из класса нитрозомочевин.
В клетках линии mel Kor после инкубации с обеими лекарственными формами аранозы и ормустина наблюдается более высокий процент активной каспазы-9, чем каспазы-8, такой же результат получили на клеточной линии mel Is после инкубации с лекарственными формами ормустина.
В клетках линий mel Z, mel Mtp и mel Mtp-X, в которых отсутствовала, или была слабая экспрессия мРНК рецептора внешнего пути индукции апоптоза CD95/Fas, обе лекарственные формы аранозы повышали процент активных каспаз в меньшей степени, чем в CD95/Fas-положительных линиях клеток mel Ibr, mel Kor, mel R и mel Ch. Исключением является линия mel Is, в которой после инкубации с ормустином-лио слабо проявлялись каспаза-8 и каспаза-3. В этой линии экспрессия мРНК CD95/Fas была высокой в необработанных препаратами клетках, но после инкубации с липосомальной аранозой снижалась, а после инкубации с аранозой-лио совсем исчезала. Это может объяснять низкий процент клеток с активными каспазами после инкубации с препаратом.
Ранее было показано, что липосомальные араноза и ормустин вызывают гибель клеток mel Mtp-X по морфотипу апоптоза. Однако здесь мы обнаружили, что в этой клеточной линии слабо повышается процент активных каспаз. Возможно, гибель клеток этой линии под влиянием липосомальных форм нитрозомочевин происходит через активацию митохондриального каспаза-независимого пути апоптоза.
Таким образом, индукция апоптоза препаратами из класса нитрозомочевин аранозой и ормустином более выражена в клетках, у которых есть в наличии рецепторы внешнего пути апоптоза.
Известно, что в некоторых случаях химиопрепараты могут вызывать клеточную гибель посредством аутофагии. Иногда аутофагию и апоптоз наблюдают в одной клетке, так как аутофагия может предшествовать апоптозу. Однако чаще в опухолевых клетках, например, в клетках меланомы человека, аутофагия является способом сохранения жизнеспособности засчет удаления поврежденных химиопрепаратами белков и органелл, поэтому ингибирование аутофагии может способстовать клеточной гибели [73].
Исследование влияния лекарственных форм аранозы на аутофагию было проведено на 5 клеточных линиях меланомы человека. Рябая О.О. и соавт. показали, что клеточные линии mel Kor и mel Mtp имеют дикий тип гена B-RAFWT, а mel Ibr и mel Z – мутантный статус B-RAFV600E [41]. Клетки mel Mtp-X на наличие мутаций в гене B-RAF не тестировалась.
Клеточные линии инкубировали с аранозой-лио и липосомальной аранозой в концентрации 450 мкг/мл в течение 24 часов. Для определения влияния двух лекарственных форм аранозы на процесс аутофагии проводили анализ экспрессии мРНК гена Beclin 1. Белок Beclin 1 (Atg6) стимулирует аутофагию, участвуя в инициации образования аутофагосом.
Базальный уровень мРНК Beclin 1 регистрировали в клетках 4 из 5 исследованных линий меланомы (mel Mtp, mel Ibr, mel Kor, mel Z), его величина варьировала от 0,19 до 0,49 о.е. (рис. 30 и 31). Линия mel Mtp-X имела минимальную базальную экспрессию мРНК Beclin 1. Сравнивали экспрессию мРНК Beclin 1 в необработанных препаратами клетках и ее изменение после инкубации с аранозой-лио и липосомальной аранозой. Изменение экспрессии Beclin 1 рассчитывали по соотношению о.е. в клетках после обработки препаратами к контролю. Соотношение 1 оценивалось как индукция аутофагии, а соотношение 1 – как ингибирование аутофагии (табл. 15).
Араноза-лио блокировала аутофагию на двух из четырех клеточных линий меланомы: снижение экспрессии мРНК Beclin 1 на 5% наблюдалось на клеточной линии mel Kor, и на 55% – в клетках mel Z. На клеточных линиях mel Mtp, mel Ibr араноза-лио вызывала индукцию аутофагии – экспрессия мРНК Beclin 1 увеличивалась на 40% и 42% соответственно (табл. 15, рис. 31). На клеточной линии mel Mtp-X наблюдали очень низкий уровень экспрессии Beclin 1 в контроле (около 0,03 о.е.), однако инкубации с аранозой-лио он снизился на 44%. Таблица 15 – Влияние с аранозы-лио и липосомальной аранозы на аутофагию на клеточных линиях меланомы
Клеточная линия Статус B-RAF Изменение экспрессии мРНК Beclin Араноза-лио Липосомальная араноза Электрофореграмма изменения уровня мРНК Beclin1 на клеточных линиях меланомы после инкубации с аранозой-лио и липосомальной аранозой. Липосомальная араноза снижала экспрессию мРНК Beclin 1 по сравнению с контролем на 4 клеточных линиях: в клетках mel Mtp на 67%, в клетках mel Z на 53%, в клетках mel Kor на 43% и в клетках mel Mtp-X – на 67%. Только на клеточной линии mel Ibr была отмечена незначительная индукция аутофагии: экспрессия мРНК Beclin 1 повысилась на 15% (табл. 15, рис. 31).
Д Таким образом, не обнаружено связи между наличием мутаций в гене B-RAF и индукцией или ингибированием аутофагии лекарственными формами аранозы. На 2 из 5 клеточных линий меланомы араноза-лио вызывала индукцию аутофагии, на 2 из 5, наоборот, – незначительное ингибирование аутофагии, и на 1 из 5 – подавляла аутофагию вдвое. Липосомальная араноза подавляла аутофагию на 4 из 5 клеточных линиях меланомы. Снижение экспрессии мРНК Beclin 1 под действием липосомальной аранозы может быть связано с тем, что препарат вызывает гибель клеток по механизму апоптоза, который, в свою очередь, подавляет аутофагию.
Оценка изменения функциональной активности Р-гликопротеина по выбросу родамина 123 на клеточных линиях меланомы под влиянем лекарственных форм аранозы
При исследовании активации сигнальных путей клеточной гибели двумя лекарственными формами препаратов класса производных нитрозомочевин обнаружили, что обе лекарственные формы – «лиофилизат для приготовления раствора для инъекций» и «липосомальная» активируют приблизительно в равной степени как внутренний, так и внешний пути апоптоза. Было сделано предположение о том, что более выраженное цитотоксическое действие липосомальных аранозы и ормустина связано с лекарственной формой препаратов, которая позволяет блокировать Р-гликопротеин, отвечающий за выброс химиопрепаратов из клетки и развитие множественной лекарственной устойчивости. Известно, что производные нитрозомочевины не относятся к соединениям из круга МЛУ, связанной с гиперэкспрессией АВС-транспортеров, однако их воздействие на Р-гликопротеин и другие АВС-транспортеры не исследовалось.
Из литературных данных известно, что липосомы, нагруженные доксорубицином, ингибируют множественную лекарственную устойчивость путем связывания Р-гликопротеина в 185 позиции глицина [128]. Мы предположили, что липосомальная араноза может также блокировать функцию Р-гликопротеина.
Культуры клеток меланомы, используемые в исследовании, ранее были охарактеризованы по экспрессии белков множественной лекарственной устойчивости, по экспрессии мРНК генов этих белков и выбросу родамина 123 [22]. Исследование показало, что чувствительные к аранозе клетки линии mel Kor не экспрессируют pgp170, не содержат мРНК генов множественной лекарственной устойчивости и не выбрасывают родамин 123. Резистентные к цитотоксическому действию аранозы клетки mel Ibr экспрессируют pgp170, содержат мРНК гена MDR1 и выбрасывают родамин 123. Клетки линии mel Mtp-X содержат мРНК гена MDR1 и активно выбрасывают родамин 123. В клетках mel Mtp-X уровень мРНК MDR-1 был повышен в 38 раз, а в клетках mel Ibr в 12,5 раз по сравнению с клеткми mel Kor [22].
Активация каспаз -3, -8 и -9 после инкубации клеток меланомы с липосомальным ормустином и ормустином-лио
Мы исследовали изменение процента каспаз -8, -9 и -3 в клетках меланомы человека после инкубации с лекарственными формами аранозы и ормустина для оценки активации внешнего или митохондриального сигнальных путей апоптоза. Инкубация клеток меланомы с лекарственными формами аранозы и ормустина приводит к повышению процента клеток с активными инициаторными каспазами -8 и -9, что говорит об активации как внешнего, так митохондриального путей апоптоза. Активация всех каспаз увеличивается с возрастанием времени инкубации с препаратами. Обнаружено, что, несмотря на разницу в цитотоксичности, процент клеток с активными каспазами значимо не меняется при сравнении действия «липосомальной» лекарственной формы и «лиофилизата для приготовления раствора для инъекций» препаратов из класса нитрозомочевин.
В клетках линии mel Kor после инкубации с обеими лекарственными формами аранозы и ормустина наблюдали более высокий процент активной каспазы-9, чем каспазы-8, такой же результат получили в клеточной линии mel Is после инкубации с лекарственными формами ормустина.
В клетках линий mel Z, mel Mtp и mel Mtp-X, в которых отсутствовала, или была слабая экспрессия мРНК рецептора внешнего пути индукции апоптоза CD95/Fas, обе лекарственные формы аранозы повышали активность каспаз в меньшей степени, чем на CD95-положительных линиях клеток mel Ibr, mel Kor, mel R и mel Ch. Исключением были клетки линии mel Is, в которых после инкубации с ормустином-лио слабо повышался уровень каспазы-8 и каспазы-3, несмотря на то, что экспрессия мРНК CD95/Fas в необработанных препаратами клетках была высокой. Однако в этих клетках экспрессия мРНК CD95/Fas после инкубации с липосомальной аранозой снижалась, а после инкубации с аранозой-лио совсем исчезала, этим можно объяснять низкий процент активных каспаз в клетках mel Is после инкубации с препаратом.
Таким образом, индукция апоптоза обеими лекарственными формами препаратов из класса нитрозомочевин аранозы и ормустина более выражена в клетках, у которых есть в наличии рецепторы внешнего пути апоптоза.
В данной работе исследовали влияние лекарственных форм препаратов из класса нитрозомочевины на аутофагию, которая представляет собой способ защиты клетки от повреждений. В процессе аутофагии происходит ликвидация поврежденных компартментов клетки, внутриклеточных патогенов, а таже должгоживущих, аномальных или агрегированных белков. Это происходит через формирование аутофагосом – двухмембранных липидных образований, которые захватывают компоненты, подлежащие разрушению, и расщепляют их с помощью гидролитических ферментов в аутолизосомах, образющихся за счет слияния аутофагосом с лизосомами. В некоторых случаях гибель опухолевых клеток, устойчвых к апоптозу, может происходить по пути активации неконтролируемой аутофагии [41].
Известно, что аутофагия является одним из механизмов защиты резистентных клеток меланомы от гибели [73; 113], таким образом, подавление аутофагии может быть актуально для лечения метастатической меланомы. В нашем исследовании, проведенном на пяти клеточных линиях диссеминированной меланомы человека, не обнаружено связи между наличием мутаций в гене B-RAF и индукцией или ингибированием аутофагии лекарственными формами аранозы. Араноза-лио вызывала незначительное снижение экспрессии гена Beclin 1 на двух клеточных линиях – mel Kor и mel Mtp-X, а на линии mel Z подавляла аутофагию вдвое. На клеточных линиях mel Mtp, mel Ibr араноза-лио вызывала статистически не значимую индукцию аутофагии.
Липосомальная араноза подавляла аутофагию на 4 из 5 клеточных линиях меланомы: вдвое снижала экспрессию мРНК Beclin 1 по сравнению с контролем. Только на клетках mel Ibr была отмечена незначительная индукция аутофагии. Таким образом, использование липосомальной аранозы подавляло аутофагию на клеточных линиях меланомы. Снижение экспрессии мРНК Beclin1 под действием аранозы может быть связано с тем, что препарат вызывает гибель клеток по механизму апоптоза, который, в свою очередь, подавляет аутофагию.
Важным механизмом развития лекарственной устойчивости является гиперэксперссия белков семейства АВС-транспортеров, в частности, Р-гликопротеина. В многочисленных исследованиях было показано, что липосомальные препараты, нагруженные доксорубицином, преодолевают лекарственную устойчивость, связанную с гиперэкспрессией Р-гликопротеина [49; 91; 92; 116; 128; 148]. С. Riganti et al. показали, что липосомы, нагруженные доксорубицином, ингибировали множественную лекарственную устойчивость, связывая Р-гликопротеин в 185 позиции глицина [128]. Мы предположили, что более выраженное цитотоксическое действие липосомальных форм аранозы и ормустина может быть связано с тем, что липосомы могут блокировать Р-гликопротеин и снижать выброс химиопрепарата из клетки. Известно, что производные нитрозомочевины не относятся к соединениям из круга МЛУ, связанной с гиперэкспрессией АВС-транспортеров, однако их воздействие на Р-гликопротеин и другие АВС-транспортеры не исследовалось. Для того чтобы изучить влияние аранозы на Р-гликопротеин, мы инкубировали клетки меланомы mel Ibr c аранозой в концентрации ИК30 в течение 6 пассажей, после чего проверили, изменилась ли способность клеток к накоплению и выбросу родамин. В результате оказалось, что инкубация с небольшими концентрациями аранозы повышают функциональную активность Р-гликопротеина.
Также сравнили способность аранозы, липосомальной аранозы и винкристина (контроль) блокировать активность Р-гликопротеина. Обнаружили, что араноза, также, как и винкристин, блокирует выброс родамина 123 на клетках с гиперэкспрессией Р-гликопротеина mel Mtp-X. Механизм, с помощью которого это происходит, еще предстоит исследовать.
Исследовали функциональную активность Р-гликопротеина после 24 ч инкубации клеток с традиционной лекарственной формой аранозы, липосомальной аранозой в ИК50 и пустыми липосомами. Оказалось, что после инкубации с липосомальной аранозой и пустыми липосомами уровень накопления родамина в клетках повышался. Кроме того, в клетках после инкубации с липосомальной аранозой снижался выброс родамина. Таким образом, липосомальная араноза блокировала функциональную активность Р-гликопротеина.