Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1 Особенности структурно-функциональных изменений дренажной зоны на клеточном и тканевом уровне при глаукоме 11
1.2 Химические элементы биологического организма и основные методы их исследования 14
1.3 Анионы электролитов, щелочные катионы электролитов и их аналоги при глаукоме: Cl, K, Na, Rb 18
1.3.1 Содержание электролитов в тканях при глаукоме 18
1.3.2 Роль электролитов в патогенезе глаукомы 18
1.4 Щелочно-земельные элементы при глаукоме: Mg, Sr, Ca 20
1.4.1 Содержание щелочно-земельных элементов в тканях при глаукоме 20
1.4.2 Роль щелочноземельных элементов в патогенезе глаукомы и их участие в процессах минерализации 22
1.5 Халькофильные металлы при глаукоме: Cu, Zn, Cd, Co, Mo, Pb, Hg, Ni 26
1.5.1 Содержание халькофильных металлов в тканях при глаукоме 26
1.5.2 Роль халькофильных металлов в патогенезе глаукомы 31
1.6 Сидерофильные металлы при глаукоме: Fe, Zn, Cr 35
1.6.1 Содержание сидерофильных металлов в тканях при глаукоме 35
1.6.2 Роль сидерофильных металлов в патогенезе глаукомы 37
1.7 Амфотерные инертные металлы и неметаллы при глаукоме: Si, Al 38
1.7.1 Содержание амфотерных инертных элементов в тканях при глаукоме 38
1.7.2 Роль амфотерных инертных элементов в патогенезе глаукомы 39
1.8 Структурообразующие неметаллы и их аналоги: Se, N, As, S 40
1.8.1 Содержание структурообразующих неметаллов и их аналогов в тканях при глаукоме 40
1.8.2 Роль структурообразующих неметаллов и их аналогов в патогенезе глаукомы 42
1.9 Анионы энергозависимых процессов: P 45
1.9.1 Содержание анионов энергозависимых процессов в тканях при глаукоме 45
1.9.2 Роль анионов энергозависимых процессов в патогенезе глаукомы 45
1.10 Проблематика обобщения сведений об изучении биоэлементного дисбаланса при глаукоме 46
Глава 2. Материалы и методы 48
2.1 Характеристика клинического материала 48
2.2 Характеристика экспериментального материала 53
2.3 Химический анализ 54
2.4 Статистическая обработка результатов 55
Глава 3. Клинико-морфологические исследования элементного состава ткани дренажной зоны 58
3.1 Различия в накоплении химических элементов при различных стадиях и формах нестабилизированной ПОУГ 58
3.2 Связь между формой нахождения химических веществ в ткани дренажной зоны и ВГД 61
3.3 Пространственное распределение химических элементов в ткани наружной части трабекулы 65
3.4 Структурно-функциональная оценка трабекулярной ткани на основе данных о распределении химических элементов на ее поверхности 71
Глава 4. Создание модели возникновения ретенции ВГЖ при первичной открытоугольной глаукоме 76
4.1 Экспериментальное изучение химических процессов в дренажной зоне, потенцируемых выщелоченным пигментом радужки 76
4.2 Дополнительные данные для построения бионеорганической и сероорганической моделей ретенции ВГЖ на уровне трабекулярной ткани при ПОУГ 80
4.2.1 Редокс-зависимое накопление сероорганических веществ в передней камере 80
4.2.2 pH-зависимые механизмы биоминерализации дренажной зоны глаза и формирования бионеорганического компонента ретенции ВГЖ 86
4.2.3 Аутокальцификация экстрацеллюлярного пигмента как фактор формирования бионеорганического компонента ретенции ВГЖ при ПОУГ 91
Заключение 94
Выводы 100
Практические рекомендации 102
Список сокращений и условных обозначений 103
Список литературы 105
- Химические элементы биологического организма и основные методы их исследования
- Роль структурообразующих неметаллов и их аналогов в патогенезе глаукомы
- Пространственное распределение химических элементов в ткани наружной части трабекулы
- Аутокальцификация экстрацеллюлярного пигмента как фактор формирования бионеорганического компонента ретенции ВГЖ при ПОУГ
Химические элементы биологического организма и основные методы их исследования
Биоэлементный состав ткани глаза всегда представлял интерес для зарубежных и отечественных исследователей. При этом для получения данных о биоэлементном статусе при глаукоме использовались различные методы химического анализа (Таблица 1).
Еще в 1943 году был исследован минеральный состав различных тканей глаз крупного рогатого скота, где обнаружены такие элементы, как Fe, Cu, Mg, Zn [146]. В 1965 г. проведены попытки определить соотношение Na, K, Mg, Ca, P и Cu в склере, конъюнктиве, роговице, хрусталике, сосудистой оболочке, сетчатке, стекловидном теле, зрительном нерве, а также в экстраокулярных мышцах и орбитальном жировой клетчатке человеческого глаза при помощи различных методов химического анализа: спектрофотометрии, пламенной фотометрии, титриметрического анализа. Получены данные об отсутствии различий в распределении K, Mg, и Ca в склере и роговице, определена более низкая концентрация Na и более высокое содержание P в склере по сравнению с тканью роговицы [51].
При исследовании химического состава животных тканей глаза в образцах склеры обнаружена более высокая концентрация S по сравнению с сетчаткой и хориоидеей, что связывается с присутствием в данной ткани большого количества сульфатированных гликозаминогликанов (ГАГ). Показано, что концентрация Na в склере также превышает концентрацию данного химического элемента в сосудистой оболочке, возможно, за счет связи с сульфатированными ГАГ [107].
При изучении одной из методик МС анализа получены изображения, демонстрирующие пространственное расположение трабекулярной сети по отношению к соседним структурам: радужке, роговице, цилиарному телу, продемонстрировано неодинаковое распределение Cu, Mg и Fe в данных тканях человеческого глаза [88].
Медико-элементологические диагностические исследования также использовались при изучении различной офтальмопатологии. При помощи ЭДС исследован минеральный состав ткани сетчатки при возрастной макулярной дегенерации. В гранулах липофусцина были обнаружены Ca, P, S, Zn, Cl. Показано, что пигментные гранулы фоторецепторов преимущественно содержат S и Cu, в меньшей степени – Zn, Ca и Fe, а кальцифицированные участки мембраны Бруха состоят из большого количества Ca и P и незначительного – Zn, Fe и Cl [154].
ЭДС также использовался для патогенетической оценки динамических изменений минерального состава роговицы после воздействия щелочи [156]. анализе отложений Ca и P при лентовидной дегенерации роговицы [111], изучения пространственного распределения химических элементов роговицы при кератоконусе [1]
Следует отметить неудобство употребления наиболее распространенной классификации химических элементов биологических систем [5], которая не отражает их функциональной роли, в том числе диктующейся определенными физико-химическими свойствами. Для более удобного сравнения биоэлементов, а также для дифференцирования биогенных и абиогенных факторов, вызывающих изменения в их концентрации, дальнейшее описание целесообразно приводить в соответствии с группами, которые сформированы с учётом как биологической роли элементов, так и схожести их физико-химических свойств.
В литературном обзоре данной работы обобщены исследования химического состава тканей при ПОУГ, преглаукоме, а также при неглаукомной патологии, ассоциированной с накоплением ПЭМ – псевдоэксфолиативном синдроме (ПЭС). Результаты представлены в том порядке, который учитывает поступление и распределение веществ в различных тканях человеческого организма и соответствии с указанной классификацией биоэлементов с учетом схожести их физико-химических свойств.
Роль структурообразующих неметаллов и их аналогов в патогенезе глаукомы
Показано, что качественное и количественные нарушения белковых и других структурных молекул сопровождаются дисбалансом N и S в тканях пациентов с патологией. Возможное повышение концентрации N во влаге передней камеры указывает на потенциальное участие азотсодержащих осмотически активных белков в аномальной гиперсекреции ВГЖ.
S входит в состав сульфатированных гликозаминогликанов: гепарансульфата, хондроитинсульфата, дерматансульфата, гиалуронана. Наряду с коллагеном, эластином и другими структурными веществами данные полимеры образуют внеклеточный матрикс трабекулярной сети и внутренней стенки эндотелия шлеммова канала [29, 39, 44, 85, 107, 123, 152, 157]. S также является одним из структурообразующих молекул, чье присутствие связано с возникновением глаукомы: белков ПЭМ и меланина. Гистохимические и иммуногистохимические данные свидетельствуют о том, что фибриллярный ПЭМ, чей точный химический состав остается неизвестным, также представляет собой сложную структуру гликопротеинов и протеогликанов, эластичных волокон (фибриллин-1, эластин, тропоэластин, амилоид Р, витронектин) [125]. Цистеин-содержащий белок фибриллин, являющийся основным компонентом эластичных микрофибрилл, входит, по данным иммуногистохимических исследований, в состав фибрилл ПЭМ [130, 139].
Известно, что цвет радужной оболочки определяется соотношением двух типов молекул: S-содержащего феомеланина и беззернистого эумеланина [163]. Считается, что строма радужной оболочки содержит оба пигмента, в то время как в клетках заднего листка радужки содержится эумеланин [121]. Показано высокое содержание (910%) S в феомеланине различных млекопитающих, в том числе человека. По мнению ряда авторов, не существует строгой границы между двумя типами пигмента. Так, для всех выделенных до настоящего времени эумеланинов характерно содержание S в различных соотношениях (от 1% до 5%), что объясняется возможным смешением путей образования эумеланина и феомеланина [78].
На выявленное отечественными исследователями повышение концентрации S ВГЖ при глаукоме, предположительно могут влиять различающиеся методики забора образцов влаги передней камеры. Взятие материала условной нормы проводится при экстракции катаракты, а патологии при проведении антиглаукомного хирургического вмешательства. С помощью лазерной фотометрии показано, что после инстилляции тропикамида, использующегося перед экстракцией катаракты в качестве премедикации, опалесценция, определяемая уровнем макромолекул влаги передней камеры, уменьшается примерно на 30% [120]. Тропикамид является медикаментов, способным снижать кровоток в сосудах радужки, что приведет к меньшему выходу белковых серосодержащих молекул в переднюю камеру. Для понимания роли S необходимы тщательные исследования, позволяющие более точно определить роль этого элемента в патогенезе глаукомы.
Se является биоэлементом, в составе селеноцистеина входящим в состав около 20 различных белков человеческого организма, среди которых такие ферменты, как глутатионпероксидаза, йодтирониндейодиназа, тиоредоксинредуктаза. Наиболее известен Se своей ролью в ферментной системе глутатионпероксидазы, которая считается основной системой антиоксидантной защиты организма.
Значительное превышение поступления Sе в организм увеличивает риск ПОУГ, что подтверждается данными клинических исследований. Возникает кажущийся парадокс, так как Se известен своей ведущей ролью в ферментной системе антиоксидантного фермента глутатионпероксидазы. Однако насыщение пулов ферментной системы приводит к избытку Se в крови и оказывает прямое повреждающие действие на ткани организма. Данный эффект объясняется авторами тем, что концентрации селена в Se, равная 100 нг/мл, полностью насыщают систему глутатионпероксидазы. Средний уровень Se в плазме у пациентов с глаукомой, получающих экзогенный Se, свидетельствует о полном насыщении пулов ферментной системы. Избыток Se в крови, по мнению авторов, оказывает прямое повреждающие действие на ткани организма
Выявлена дозозависимая способность метанселеновой кислоты снижать секрецию и металлопротеиназ, и их ингибиторов в культуре клеток трабекулярной сети человека [46]. Метанселеновая кислота в концентрации, в 10 раз превышающей концентрацию в норме и являющейся эквивалентной для пациентов, получающих высокие дозы селена, ингибирует синтез и секрецию белков в клеточной культуре трабекулярной ткани. Также продемонстрировано подавляющее действие метанселеновой кислоты на адгезивную способность клеток [47].
Вопросам аккумуляции серосодержащих веществ в организме человека посвящен ряд работ, где изучается накопление смешанных дисульфидов в интактных тканях или клетках в культуре при воздействии различных окислителей [18]. В крови при глаукоме, по данным отечественных [2] и иностранных авторов [71, 84] выявлены снижение уровня SH-групп и повышение уровня дисульфидных SS-групп, что потенциально может приводить к аккумуляции серы в виде дисульфидов в тканях.
При детальном рассмотрении механизма формирования дисульфидов становится ясно, что превращение сульфгидрильной группы в тиолат-анион возможно только в случае нахождения серы в депротоинированном состоянии. Таким образом, формирование дисульфидного мостика является рН-зависимым процессом, а при определенном рН соотношение тиолат-аниона к сульфгидрильной группе является постоянной величиной. Значение pH ВГЖ человека сходно с нейтральной сывороточной и, по различным литературным данным, составляет 7,32-7,60 [127]. Наиболее точные измерения, исключающие насыщение ВГЖ эндогенными веществами в процессе пробоподготовки [114, 128] свидетельствуют о более кислой по сравнению с плазмой крови реакции ВГЖ в норме 7,2 [150]. Применение препаратов группы ингибиторов карбоангидразы потенциально уменьшает концентрацию ионов водорода в передней камере человека и может сдвигать реакцию среды в щелочную сторону Таким образом, образование SS-групп и связанное с ним накопление серосодержащего материала при смещении pH при этом должно идти равномерно во всех структурах глаза.
Пространственное распределение химических элементов в ткани наружной части трабекулы
В ткани трабекулы, полученной при проведении НГСЭ, в 22 образцах из 30 по данным визуализации в обратно рассеянных электронах (BSE) между пластинами трабекулярной ткани систематически обнаруживались значительные агрегаты пигментных гранул (Рисунок 7а, желтые стрелки, желтая врезка). При этом, по данным химического микрокартирования, в совпадающей с пигментными агрегатами позиции обнаруживалась значимая по площади аккумуляция высокосернистых веществ (Рисунок 7б, белые стрелки), располагающихся между клетками трабекулы (Рисунок 7а, красные стрелки). На клетки трабекулы в свою очередь указывали локальные максимумы концентрации P (Рисунок 7в, белые стрелки), соответствующие позиции их ядер.
Нередко между клетками трабекулы также визуализировались рассеянные кальцификаты, на которые указывают локальные скопления Ca (Рисунок 7г, пунктирная стрелка), соответствующие электронно-плотным участкам, обнаруживаемым на детекторе BSE (рис 7а, пунктирная стрелка).
В образце с отсутствием пигментных гранул на поверхности трабекулы (врождённая глаукома, сочетанная с аниридией) скоплений серосодержащих веществ не наблюдалось (Рисунок 8). Отсутствие локальных максимумов концентрации S у пациента с аниридией дополнительно указывает на связь S с выщелачиваемым из ткани радужки пигментом
При подготовке к визуализации в СЭМ образцов ткани трабекулы, при которой использовалась щадящая методика по отношению к минеральному веществу, в 7 образцах из 30 была выявлена облитерация ткани трабекулы минеральными депозитами (Таблица 5). Извлекаемое минеральное вещество представляло собой микроскопические блоки однородной рассыпчатой массы светло-бежевого цвета. На основании соответствия данных химического состава материала, извлекаемого из трабекулярной ткани, с данными последующего микрокартирования трабекулы был сделан вывод о субтотальной минерализации дренажной зоны: силицитизации и кальцификации.
В 3 образцах с выраженной минерализацией на ЭДС обнаружено увеличение доли Si (Таблица 5, Рисунок 9). В 4 образцах с выраженной минерализацией обнаружено аномально высокое по отношению к другим образцам содержание P и Ca (Таблица 5, Рисунок 10).
В образцах с увеличением доли Si (Таблица 5, Рисунок 9) микрокартирование поверхности трабекулярной ткани, освобожденной от сплошной массы кремнистого минерального вещества, выявило очаги совместной импрегнации трабекулярных пластин гранулами пигмента и аморфным кремнеземом. Отмечалась пространственная связь между участками с повышенным содержанием кремния и областями у трабекулярных пластин, через которые в норме осуществляется пассивная фильтрация влаги (Рисунок 9а, голубые стрелки, Рисунок 9г, белые стрелки).
В образцах с с аномально высоким по отношению к другим образцам содержание P и Ca (Таблица 5, Рисунок 10) отчетливой пространственной связи между импрегнирующими ткань остаточными микросферами фосфата кальция (Рисунок 10a, желтые стрелки; Рисунок 10в, белые стрелки; Рисунок 10г, белые стрелки) и областями у трабекулярных пластин, через которые в норме осуществляется пассивная фильтрация влаги (Рисунок 10а, белые стрелки), установлено не было.
С позиции гидродинамики, и сероорганические, и минеральные вещества могут вызывать ретенцию, которая определяется занимаемой ими площадью в сечении фильтрующих зон. Поэтому были сформированы следующие группы:
1) «Типичная» глаукома с накоплением сероорганических веществ (Рисунок 11а, Рисунок 11б) - 22 случая из 30;
2) «Минеральная глаукома» с силицитизацией трабекулы (Рисунок 11 в, Рисунок 11 г) - 3 случая из 30;
3) «Минеральная глаукома» с кальцификацией трабекулы (Рисунок 11д, Рисунок 11 г) - 4 случая из 30
Аутокальцификация экстрацеллюлярного пигмента как фактор формирования бионеорганического компонента ретенции ВГЖ при ПОУГ
Следует отметить, что термодинамически при значениях pH 4,0 гидроаксиапатит является более стабильной и термодинамически предпочтительной фазой, чем октакальция фосфат (ОКФ) или ДКФД. Однако образование гидроксиапатита происходит намного медленнее, чем ДКФД, а во время одновременного образования нескольких фаз доминирующей может долгое время может оставаться кинетически предпочтительная фаза, даже если она имеет гораздо меньшую термодинамическую движущую силу [158]. Кинетические факторы иллюстрируются экспериментом, в котором авторы продемонстрировали переход ДКФД в ОКФ в ростовой среде при 36,5C, происходящий по истечению времени, превышающего сутки [106]. Результаты эксперимента сопоставимы с результатами данного исследования, полученными при «культивировании» пигментных гранул в ростовой среде в течение времени, не превышающего 24 часа.
Осаждение минерального вещества на пигментных гранулах должно свидетельствовать о создаваемых на их поверхности условиях, благоприятных этому процессу. Такие условия могут быть достигнуты несколькими путями: резким повышением концентрации одного из субстратов (локальным перенасыщением раствора), локальным изменением кислотно-основного равновесия в щелочную сторону, или дисбалансом системы активаторов и ингибиторов механизмов кальцификации.
Первый путь (перенасыщение раствора у поверхности гранул пигмента субстратом), в частности, предполагает локальное высвобождение избытка Pi из разрушающейся органеллы, в результате чего образуется минерального вещество. При этом ожидается, что визуально пигментные гранулы должны иметь признаки деградации: неправильную форму, неровные, иррегулярные края. Однако по нашим данным, данным, при визуализации в СЭМ обнаруживается, что кальцифицированные пигментные гранулы в преобладающем большинстве сохраняют нативную округлую или эллипсовидную формы.
Второй рассматриваемый путь предполагает довольно длительное локальное изменение pH на поверхности гранул, достаточное для образования минерального вещества, как по величине изменения кислотно-основного баланса, так и по продолжительности этого изменения во времени. Допустимо предположить, что способностью поддерживать определенное значение pH на своей поверхности может обладать только относительно функционирующая органелла, при этом кислотно-основное постоянство достигается работой протонных насосов, встроенных в ее билипидную мембрану. Действительно, доказано, что на поверхности выделенной из клетки меланосомы довольно длительное время идет энергетический процесс расщепления АТФ до АДФ и Pi, обеспечивающий работой мембраннный белок Vype H+ATPase [119]. При работе Vype H+ATPase протоны с поверхности мембраны попадают внутрь меланосомы, закисляя внутриорганелльное содержимое, а снаружи при этом достигается относительно щелочная среда. Таким образом, в результате работы Vype H+ATPase на поверхности меланосомы происходит как накопление Pi субстрата, так и образование относительно щелочной реакции среды, способствующей осаждению из раствора минерального фосфата кальция.
Фосфолипиды, входящие в состав органелльных и клеточных мембран, способны аккумулировать катионы Ca2+. Следует отметить, что данная связь осуществляется посредством слабых межмолекулярных ван-дер-ваальсовых взаимодействий [110]. Тем не менее, показано, что само присутствие в тканях комплекса липид-Ca-фосфат значительно ускоряет процессы биоминерализации [164]. Особо стоит отметить и то, что сам процесс гидролиза АТФ может непосредственно инициировать кальцификацию [76].
Cтоит отметить, что изменения в меланине, приводящие к его окислению, сопровождаются высвобождением ионов Ca2+ [37], которые сам полимер меланин способен непосредственно накапливать. Таким образом, сопутствующее увеличение окислительного потенциала среды, возникающее вследствие ухудшения гидродинамики, способствует увеличению околомеланосомальной концентрации катионов Ca2+, способных непосредственно связываться с неорганическим фосфатом с образованием минерального вещества
При этом допустимо, что in vivo наличие или отсутствие некой комбинации веществ ВГЖ предотвращает кальцификацию в норме (в том числе посредством возможного ингибирования Vype H+ATPase). Таким образом, допустимо рассмотерть третий механизм в гипотезу о минерализации гранул и предположить, что кальцификация в углу передней камеры опосредована не только кислотно-основным дисбалансом, но и нарушением в системе биологических активаторов и ингибиторов минерализации.
На основании изложенных литературных данных в совокупности с полученными при проведении собственных исследований результатами можно утверждать (см. Заключение) о потенциальной аутокальцификации экстрацеллюлярного пигмента как отдельного фактора формирования бионеорганического компонента ретенции ВГЖ при ПОУГ.