Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1 Эпидемиология ДМО 16
1.2 Патогенетические механизмы развития ДМО 19
1.3 Клиническая картина и классификация ДМО 28
1.4 Современные методы диагностики ДМО 31
1.5 Факторы риска и медикаментозное лечение ДМО 39
1.6 Лазерные методы лечения ДМО 42
Глава 2. Материал и методы исследования 51
2.1 Материал и методы экспериментального исследования 51
2.2 Общая характеристика клинического материала 53
2.3 Методы обследования органа зрения 55
2.4 Методы статистической обработки полученных результатов 63
Глава 3. Экспериментальное исследование характера тканевого ответа хориоретинального комплекса кроликов на субпороговое микроимпульсное лазерное воздействие с длиной волны 577 НМ 64
3.1 Сравнительный анализ структурных изменений ХРК при использовании различных сочетаний энергетических параметров СМЛВ 65
3.2 Оценка особенностей тканевого ответа хориоретинального комплекса на СМЛВ 69
Глава 4. Характеристика технологии комбинированного лазерного воздействия для лечения диабетического макулярного отека 73
4.1 Разработка протокола субпорогового микроимпульсного лазерного воздействия с длиной волны 577 нм для лечения ДМО 74
4.2 Разработка технологии комбинированного лазерного лечения ДМО 75
Глава 5. Оценка безопасности и сравнительный анализ клинико-функциональных результатов лазерного лечения пациентов с диабетическим макулярным отеком 78
5.1 Результаты первичного осмотра пациентов 78
5.2 Сравнительная клиническая оценка безопасности технологии комбинированного лазерного воздействия и протокола СМЛВ с традиционной лазеркоагуляцией сетчатки 83
5.3 Анализ клинико-функциональных результатов лечения ДМО в клинических группах 89
5.4 Сравнительная оценка клинико-функциональных результатов лечения пациентов в клинических группах 92
Заключение 103
Выводы 120
Практические рекомендации 122
Список сокращений 124
Список литературы
- Современные методы диагностики ДМО
- Методы обследования органа зрения
- Оценка особенностей тканевого ответа хориоретинального комплекса на СМЛВ
- Разработка технологии комбинированного лазерного лечения ДМО
Введение к работе
Актуальность проблемы
Диабетический макулярный отек (ДМО) является ведущей причиной снижения центрального зрения и инвалидизации лиц трудоспособного возраста, страдающих сахарным диабетом. Частота ДМО зависит от типа сахарного диабета и длительности заболевания и варьирует, по данным разных авторов, от 3% до 57% (Klein R. et al, 1984, 1991, Экгардт В.Ф ., Олевская Е.А. 2005). Патогенез данного заболевания крайне сложен, и на сегодняшний день до конца не изучен. Главными звеньями патологического процесса принято считать нарушение проницаемости ретинальных сосудов и ретинальную ишемию в результате капиллярной и артериолярной неперфузии (Bresnick G.H., 1983, Балашевич Л.И., Измайлов А.С., 2012). В настоящее время доказана роль ряда цитокинов и факторов роста в патогенезе диабетической макулопатии (Simo R. et al. 2006, Douros S., 1995). Важную роль в развитии макулопатии играет нарушение функции ретинального пигментного эпителия (РПЭ), который обеспечивает барьерную функцию, способствует резорбции жидкости из ткани сетчатки, а также является источником естественных антипролиферативных и трофических факторов, таких как пигментный эндотелиальный фактор роста (PEDF) (Ogata N., et al. 2002).
«Золотым стандартом» лечения диабетического макулярного отека на
сегодняшний день остается лазеркоагуляция макулярной зоны сетчатки (Bhagat
N. и соавт., 2009). В рамках крупного многоцентрового рандомизированного
исследования Early Treatment Diabetic Retinopathy Study (ETDRS, 1985), была
доказана эффективность лазеркоагуляции, а также определены показания к ее
проведению - наличие клинически значимого макулярного отека (КЗМО). Тем
не менее, пороговая лазеркоагуляция имеет и негативные последствия,
связанные с термическим необратимым повреждением структур сетчатки, что
может приводить к снижению контрастной чувствительности, ухудшению
цветового зрения, появлению скотом в центральном поле зрения и т.д. (Laey J.J.,
1993), а также к увеличению концентрации провоспалительных цитокинов
(Ходжаев Н.С. с соавт., 2011). Стоит отметить, что многократное повторение сеансов лазерного лечения не представляется возможным.
Субпороговое микроимпульсное лазерное воздействие (СМЛВ) является наиболее безопасным для клеток ретинального пигментного эпителия и нейросенсорной сетчатки, что позволяет проводить повторные сеансы лечения, в том числе в фовеальной аваскулярной зоне (ФАЗ) (Luttrull J.K., Sinclair S.H., 2014). Биологическим эффектом данного воздействия является стимулирующее действие на выработку клетками РПЭ собственных противовоспалительных факторов (Yu A. и соавт., 2013).
Тем не менее на сегодняшний день нет единого мнения о том, какие энергетические параметры микроимпульсного излучения являются оптимальными для достижения наилучшего клинического результата, в литературе не описаны методики подбора этих параметров.
В свете вышеизложенного становится ясным, что на сегодняшний день в лечении диабетической макулопатии не существует единственного абсолютно эффективного метода. Разработка технологии эффективного комбинированного лечения ДМО, сочетающая в себе положительные стороны разных методик, возможность неоднократного безопасного повторения курсов лечения является актуальной задачей.
Цель исследования - разработать технологию комбинированного лазерного лечения диабетического макулярного отека и оценить ее эффективность в сравнении с другими лазерными методами.
Задачи исследования
1. Провести сравнительный анализ структурных изменений
хориоретинального комплекса при использовании различных сочетаний энергетических параметров субпорогового микроимпульсного лазерного воздействия с длиной волны 577 нм на основе морфологических исследований в эксперименте.
-
Оценить особенности тканевого ответа хориоретинального комплекса на проведение СМЛВ на основе иммуногистохимических исследований в эксперименте.
-
На основании результатов эксперимента разработать протокол СМЛВ для лечения диабетического макулярного отека и оценить его безопасность с использованием современных методов исследования.
-
На основании результатов эксперимента разработать технологию комбинированного лазерного лечения диабетического макулярного отека, включающую сочетание пороговой лазеркоагуляции сетчатки и СМЛВ, и оценить ее безопасность с использованием современных методов исследования.
-
Провести сравнительный анализ клинико-функциональных результатов лечения пациентов с использованием комбинированной лазерной технологии, СМЛВ и традиционной лазеркоагуляции сетчатки, оценить эффективность данных методик в зависимости от характера исходных структурных изменений сетчатки.
-
Определить показания и противопоказания, а также разработать методические рекомендации к применению разработанной технологии.
Научная новизна результатов исследования
-
Впервые на основе морфологических исследований в эксперименте проведен сравнительный анализ структурно-морфологических изменений хориоретинального комплекса при воздействии лазерного излучения в микроимпульсном режиме с длиной волны 577 нм с различными энергетическими параметрами, определено наиболее оптимальное их сочетание.
-
Впервые на основе экспериментальных исследований установлено, что одним из биологических эффектов СМЛВ с длиной волны 577 нм является экспрессия пигментного фактора эпителиального происхождения.
-
Впервые обоснован выбор сочетания энергетических параметров
лазерного излучения в микроимпульсном режиме и разработан протокол СМЛВ
для лечения ДМО.
-
Впервые разработана технология комбинированного лазерного лечения ДМО, включающая сочетание лазеркоагуляции сетчатки и СМЛВ, доказана ее безопасность и эффективность в сравнении с традиционной лазеркоагуляцией по методике модифицированной "решетки" ETDRS, а также с монотерапией СМЛВ.
-
Впервые проведена сравнительная оценка результатов лечения ДМО с применением комбинированной лазерной технологии и протокола субпорогового микроимпульсного лазерного воздействия при лечении диабетического макулярного отека, в зависимости от исходных структурных изменений ХРК.
Практическая значимость результатов исследования
-
Разработанная технология комбинированного лазерного лечения ДМО является безопасной, в сравнении с традиционной лазеркоагуляцией сетчатки позволяет минимизировать степень лазериндуцированных повреждений структур ХРК за счет использования субпорогового характера воздействия и уменьшения кратности повторения лазеркоагуляции.
-
Показана возможность безопасного проведения четырех последовательных сеансов СМЛВ (в том числе в ФАЗ) при лечении ДМО, как в составе комбинированной лазерной технологии, так и в виде монотерапии.
-
Доказана эффективность комбинированной лазерной технологии при лечении ДМО, которая выражается в сравнимом с традиционной лазеркоагуляцией снижении высоты макулярного отека и повышении остроты зрения, при этом имеет преимущество в части улучшения центральной светочувствительности сетчатки.
-
Установлено, что клинико-функциональные результаты СМЛВ в качестве монотерапии ДМО зависят от характера структурных изменений сетчатки. СМЛВ проявляет наибольшую эффективность при лечении пациентов с диффузным ретинальным утолщением до 400 мкм, что сопровождается повышением средних МКОЗ и СЧ, а также снижением ТС. У пациентов с
кистозной формой ДМО и центральной толщиной сетчатки более 400 мкм монотерапия СМЛВ не является эффективной.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
-
Разработанная технология комбинированного лазерного лечения ДМО является безопасной и эффективной, в сравнении с традиционной лазеркоагуляцией сетчатки имеет преимущество в части улучшения светочувствительности сетчатки за счет применения субпорогового характера воздействия и уменьшения кратности повторения пороговой лазеркоагуляции.
-
Экспрессия пигментного фактора эпителиального происхождения является одним из основных путей биологического ответа ХРК на субпороговое микроимпульсное лазерное воздействие с использованием длины волны 577 нм, скважности 5%, длительности микроимпульса 100 мкс, длительности пакета 100 мс и индивидуальным подбором мощности.
-
СМЛВ с длиной волны 577 нм, скважностью 5%, длительностью микроимпульса 100 мкс, длительностью пакета 100 мс и индивидуальным подбором мощности не приводит к изменениям структурной целостности ХРК, что позволяет проводить неоднократные сеансы лазерного воздействия (в том числе в ФАЗ), как в виде монотерапии ДМО, так и в составе разработанной технологии комбинированного лазерного лечения.
Внедрение в клиническую практику
Разработанные технология комбинированного лазерного лечения и протокол субпорогового микроимпульсного лазерного воздействия с длиной волны 577 нм внедрены и активно применяются в клинической практике отделения лазерной хирургии сетчатки ФГАУ "МНТК "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова" Минздрава России при лечении пациентов в диабетическим макулярным отеком.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены в рамках внутриклинической конференции ФГАУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России (Москва) в 2014, 2015 и 2016 гг.; на XIII научно-практической конференции "Современные технологии лечения витреоретинальной патологии 2015" (Москва); на конференции молодых ученых "Актуальные вопросы офтальмологии 2015" (Москва); на конференции "12th International Symposium of Ocular Pharmacology and Therapeutics" (Берлин, 2015); на конференции "15th EURETINA congress" (Ницца, 2015); на XIV научно-практической конференции "Современные технологии лечения витреоретинальной патологии 2016" (Москва); на научно-практической конференции "Новые технологии в офтальмологии - 2016" (Казань); на VII Всероссийском семинаре — «Макула -2016» (Ростов-на-Дону).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 3 статьи - в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации результатов диссертационного исследования, получен патент РФ на изобретение № 2578371 от 17.03.2015.
Объем и структура диссертации
Современные методы диагностики ДМО
Патогенетические механизмы развития ДМО являются сложными и многофакторными, и на сегодняшний день до конца не изучены. Основой патологического процесса принято считать нарушение функции внутреннего и наружного гематоретинального барьеров (ГРБ) как следствие разобщения нейрональных и сосудистых клеточных взаимодействий в условиях хронической гипергликемии [51]. Нормальная физиология работы данных барьеров заключается в избирательном обмене жидкостью, электролитами, питательными веществами и продуктами обмена между сетчаткой и сосудистым руслом. Главным структурным компонентом наружного ГРБ является монослой клеток ретинального пигментного эпителия, а внутреннего - эндотелиальные клетки ретинальных сосудов, перициты и глия (клетки Мюллера и астроциты) [179]. Основная часть кровоснабжения сетчатки (85%) осуществляется посредством сосудов хориоидеи, тогда как меньшая часть (15%) приходится на ретинальную сосудистую сеть [79]. Несмотря на такое соотношение, ряд авторов считают основной причиной возникновения ДМО нарушение работы именно внутреннего ГРБ. Тем не менее, Tso M.O. с соавторами (1980) показали в эксперименте на крысах наличие просачивания жидкости через слой РПЭ без сопутствующего просачивания из ретинального капиллярного русла [191].
Поддержание механических свойств данных барьеров, а также динамическая регуляция их проницаемости осуществляются посредством белков "плотных контактов" ("tight junction proteins") [54, 104, 191]. Существование таких белков, к которым относятся трансмембранные белки окклюдин, клаудины и молекулы адгезии (JAMs), было подтверждено работами Shakib J.G. и Cunha-Vaz M. еще в 1966 году [49]. Дальнейшее изучение свойств этих белков позволило установить их роль в регуляции работы ГРБ в условиях гипергликемии. В частности, повышение проницаемости барьеров связано со снижением экспрессии окклюдина и клаудинов, их фосфорилированию при участии сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF) [24, 30, 31, 62, 81, 85]. JAMs, в свою очередь, также участвуют во взаимодействии с лейкоцитами и вовлечены в процессы воспалительного ответа.
Нарушение нормального функционирования работы гематоретинальных барьеров ведет к патологическому просачиванию жидкости, превышающему нормальный отток, и ее накоплению в ткани сетчатки [23, 117, 128].
Дальнейшее изучение патогенетических механизмов привело к тому, что в настоящее время ДМО рассматривается как нейроваскулярное заболевание, при котором процессы нейродегенерации и сосудистые изменения тесно взаимосвязаны. Развитие макулярного отека при СД возникает вследствие длительно повышенного уровня глюкозы в крови и обусловлено следующими процессами: патологическими изменениями сосудистой стенки; нарушениями функционирования глиальных клеток; альтерацией РПЭ.
Основными механизмами данных нарушений при ДМО считают накопление так называемых "конечных продуктов гликирования" (AGE), нейрональную дисфункцию вследствие оксидативного стресса и экстрацеллюлярного накопления глутамата, а также процессы воспаления [34].
Повышенный уровень глюкозы внутри клеток обуславливает неферментные биохимические реакции с аминогруппами белков, липидов и нуклеиновых кислот с образованием AGE, что вызывает дисфункцию ретинальных сосудов [91, 170]. Накопление AGE индуцирует апоптоз клеток эндотелия и перицитов [108, 205]. Вкладом в этот процесс также считают утолщение базальной мембраны капилляров, поскольку было показано, что ее повреждение при накоплении AGE препятствует выживаемости перицитов, а ингибирование AGE предотвращает утолщение базальной мембраны [72]. В то же время, накопление продуктов гликирования усиливает сосудистую проницаемость вследствие потери белков плотных контактов (посредством активации протеинкиназа С - зависимого пути) [98].
Глутамат является одним из основных нейротрансмиттеров в сетчатке. В норме глутамат метаболизируется в сетчатке клетками Мюллера. Избыточное его накопление в межклеточном пространстве в результате нарушения функции мюллеровской глии при СД было показано в экспериментах на животных и в ряде клинических исследований [22, 109, 110, 111, 151]. В условиях хронической гипергликемии повышение концентрации глутамата в сетчатке объясняется снижением его метаболизма клетками глии [110, 111]. Повреждающее действие ("эксайтотоксичность") глутамата при его избыточном накоплении в межклеточном пространстве и в синапсах выражается в гибели нейронов сетчатки [132, 159] и усилении процессов оксидативного стресса [46].
Оксидативный стресс, наблюдаемый при развитии ДМО связан с накоплением в сетчатке активных форм кислорода (АФК). Образование АФК необходимо для поддержания нормального функционирования клетки. Тем не менее, при СД, в условиях хронической гипергликемии, происходит избыточное накопление АФК. Это ведет к активации рецептора AGE и протеинкиназа С - зависимого пути, дезорганизации метаболических процессов и, в дальнейшем, к усилению проницаемости сосудов. Наиболее выражены данные изменения в фоторецепторах, ганглиозных и мюллеровских клетках как наиболее энергетически активных. Согласно целого ряда исследований, оксидативный стресс в условиях повышенного уровня глюкозы приводит к нарушению функции монослоя РПЭ и, как следствие, к повреждению наружного ГРБ и повышению его проницаемости [25, 74]. В то же время, по данным авторов, оксидативный стресс также приводит к повреждению нейронов сетчатки (в частности, ганглиозных клеток) [203] и, в свою очередь, способствует накоплению глутамата в межклеточном пространстве [142]. Таким образом, оксидативный стресс, возникающий в условиях хронической гипергликемии, многие авторы считают своего рода связующим звеном между нейродегенерацией и микрососудистыми нарушениями при СД [167].
Потеря перицитов и апоптоз эндотелиальных клеток ретинального сосудистого русла, появление ацеллюлярных капилляров являются стимулом к пролиферации эндотелиоцитов [78]. Данный процесс может приводить как к появлению микроаневризм, так и закрытию просвета сосуда. В первом случае образуется патологическое выпячивание сосудистой стенки с нарушенной барьерной функцией, что в дальнейшем обуславливает просачивание жидкости в ткань сетчатки. Во втором, закрытие капиллярного русла ведет к образованию зон ретинальной ишемии [1]. Процессам ишемизации и патологической проницаемости ГРБ, по мнению некоторых авторов, также способствует адгезия лейкоцитов к эндотелию капилляров [91]. Лейкостаз в просвете ретинальных сосудов был впервые описан Schroder S. с соавторами (1991) в эксперименте на крысах с индуцированным сахарным диабетом [163]. В дальнейшем данные результаты были подтверждены работами Miyamoto K. и соавторов (1999) [123]. Адгезия лейкоцитов в ретинальном микрососудистом русле является одним из начальных механизмов развития воспаления при ДР. Лейкостаз сопровождается потерей эндотелиальных клеток и перицитов повреждению ГРБ и ишемии [45, 209].
Методы обследования органа зрения
Ультразвуковые методы исследования, эхобиометрия и В-сканирование, выполнялись с помощью ультразвукового офтальмологического сканера "Eye Cubed" (Ellex Inc., Австралия) для измерения длины переднезадней оси глазного яблока, глубины передней камеры глаза и толщины хрусталика, а также оценки состояния стекловидного тела и структур заднего полюса глаза. Биомикроскопия переднего отрезка глаза и стекловидного тела проводилась с использованием щелевой лампы "SL 120" (Carl Zeiss Meditec AG, Германия). При офтальмоскопии дополнительно использовались бесконтактная линза "Ocular MaxField 78D" и контактная линза "Reichel-Mainster 1X" (Ocluar Instruments, США); исследование проводилось в условиях медикаментозного мидриаза.
Для детального изучения патологических изменений структуры ХРК при ДМО и более подробного исследования функционального состояния сетчатки, а также количественного сравнения показателей в динамике применялся мультимодальный подход. Данный подход основан на применении комплекса современных методов исследования заднего полюса глаза, таких как флюоресцеиновая ангиография (ФАГ), аутофлюоресценция (АФ), оптическая когерентная томография (ОКТ), компьютерная микропериметрия (МП), цветное фотографирование глазного дна. ФАГ, АФ и ОКТ проводились на приборе «SPECTRALIS HRA+OCT» (Heidelberg Engineering, Inc., Германия). Данная платформа представляет собой интеграцию ряда технологий, наиболее значимыми из которых являются конфокальная лазерная офтальмоскопия, спектральная ОКТ, система активного слежения за движениями глаза TruTrack и технология AutoRescan для повторных исследований. Принцип сканирующей лазерной офтальмоскопии состоит в высокоскоростном сканировании области сетчатки с последующей регистрацией отраженного лазерного луча. Это даёт возможность значительно уменьшить влияние рассеивания света и помутнения оптических сред глаза на качество снимка, получить изображение с высокой контрастностью и детализацией структур ХРК даже в случаях, когда не удается достичь оптимального мидриаза, что весьма актуально у пациентов, страдающих СД. Использование трех различных длин волн лазерного излучения позволяет регистрировать свечение вводимых внутривенно красителей (флюоресцеина или индоцианина зеленого) и аутофлюоресценцию пигментированных структур ХРК.
Флюоресцеиновая ангиография проводилась пациентам после достижения медикаментозного мидриаза. В локтевую вену болюсно вводили 5 мл 10% раствора флюоресцеина натрия. Регистрацию глазного дна начинали с момента заполнения красителем хориодиального русла. Серии снимков проводили в течение 10 минут в соответствии с различными фазами прохождения флюоресцеина по ретинальным сосудам. Ключевым показателем ФАГ у пациентов с ДМО в рамках настоящего исследования стало выявление очагов гипофлюоресценции в макуле, а также увеличение ФАЗ, что соответствовало зонам неперфузии сетчатки и давало основание отнести данную макулопатию к ишемическому типу. Пациенты с ишемической формой ДМО были исключены из дальнейших исследований. Во всех остальных случаях дополнительно оценивали количество и расположение микроаневризм, зон наибольшего просачивания красителя в ткань сетчатки и/или субретинальное пространство, образование крупных кистозных полостей. Стоит отметить, что, несмотря на высокую чувствительность, данное исследование не позволяет проводить количественную оценку степени утолщения и структурных изменений сетчатки. Также, в силу инвазивного характера, ФАГ имеет ряд побочных эффектов и ограничений в применении, в частности, введение красителя противопоказано при отягощенном аллергологическом анамнезе, наличии бронхиальной астмы, почечной недостаточности и др. Таким образом, данное исследование дополнялось проведением современных неинвазивных методов (АФ, ОКТ).
Аутофлюоресценция глазного дна основана на регистрации свечения естественных флюорофоров ХРК без введения специальных красителей. В настоящее время используются коротковолновый (КВ-АФ) и инфракрасный (ИК-АФ) режимы лазерного сканирования. При КВ-АФ применяется излучение лазера с длиной волны 488 нм, источником флюоресценции является липофусцин, содержащийся в клетках РПЭ. По интенсивности свечения можно судить о метаболизме пигментных клеток и, косвенно, о состоянии фоторецепторного слоя сетчатки. При ИК-АФ используется излучение лазера с длиной волны 787 нм, источником флюоресценции в данном случае служит меланин хориоидеи и РПЭ. Таким образом, ИК-АФ позволяет оценить уровень меланогенеза в глубжележащих слоях ХРК.
Результаты аутофлюоресценции глазного дна использовались в настоящем исследовании для оценки структур ХРК после проведения лазерного лечения. Изменения АФ-картины, возникающие после порогового воздействия (лазеркоагуляции сетчатки), характеризуются образованием точечных очагов гипераутофлюоресценции при КВ-АФ и гипоаутофлюоресценции при ИК-АФ. Данные признаки свидетельствуют о термическом повреждении РПЭ слоя фоторецепторов в месте нанесения коагулята (Рисунок 2.1). При проведении СМЛВ термического коагуляционного некроза тканей не происходит, поэтому на снимках АФ очаговых лазериндуцированных изменений ХРК определяться не должно.
Оценка особенностей тканевого ответа хориоретинального комплекса на СМЛВ
Целью настоящего экспериментального исследования послужило изучить характер тканевого ответа хориоретинального комплекса на субпороговое микроимпульсное лазерное воздействие с длиной волны 577 нм, оценить безопасность и эффективность повторного сеанса СМЛВ.
Для осуществления поставленной цели требовалось провести сравнительное изучение структурных изменений ХРК кроликов при использовании различных сочетаний энергетических параметров СМЛВ на основе морфологических исследований, изучить особенности тканевого ответа ХРК на однократное и повторное СМЛВ на основе иммуногистохимических исследований, оценить безопасность повторного сеанса СМЛВ посредством морфологических исследований. Экспериментальное исследование состояло из двух этапов. В ходе 1-го этапа проводился подбор наиболее оптимального сочетания энергетических параметров микроимпульсного лазерного излучения, при использовании которого не происходит нарушения целостности структуры ХРК. Полученные параметры в дальнейшем планировалось использовать при проведении 2-го этапа: изучение тканевого ответа ХРК кроликов на СМЛВ с длиной волны 577 нм, а также возможности безопасного и эффективного повторения сеанса лазерного воздействия.
3.1 Сравнительный анализ структурных изменений ХРК при использовании различных сочетаний энергетических параметров СМЛВ
В рамках первого этапа эксперимента СМЛВ с длиной волны 577 нм проводилось на 8 глазах 8 кроликов с использованием одного из четырех вариантов сочетания энергетических параметров излучения (Таблица 2.1)
В каждом случае мощность лазерного излучения подбиралась индивидуально после предварительного тестирования. Тестирование проводилось на расстоянии, соответствующем трем диаметрам диска зрительного нерва от зрительной лучистости (Рисунок 3.1). Подбор мощности излучения начинали после переключения работы лазерной установки в микроимпульсный режим с уровня 100 мВт, постепенно повышая его до появления едва заметного побеления, после чего мощность снижали в 2 раза и использовали для проведения СМЛВ. Лазерные аппликаты наносили в зоне 3 диаметра диска зрительного нерва от зрительной лучистости в виде решетки с расстоянием не более одного диаметра лазерного пятна между аппликатами. Животных выводили из эксперимента в сроки 1 сутки (4 кролика) и 1 месяц (4 кролика). а. б. Стрелками отмечена линия, по которой проводилось тестирование мощности лазерного излучения. В зоне СМЛВ видимых следов лазерного воздействия не выявляется Рисунок 3.1 - Фотография глазного дна кролика (а) сразу после окончания СМЛВ и макропрепарат ХРК (б) того же животного спустя 1 сутки после воздействия Полученные в ходе 1-го этапа экспериментального исследования данные показали, что при использовании энергетических параметров 1 варианта СМЛВ не происходит лазериндуцированного повреждения структур ХРК на обоих сроках наблюдения (Рисунок 3.2 а, б). Целостность монослоя клеток РПЭ, а также структура нейросенсорной сетчатки не претерпевали изменений.
После СМЛВ по 3 и 4 вариантам (рисунок 3.4) на обоих сроках наблюдения отмечалось разрушение фотосенсорного слоя (1), нарушение связей между клетками в наружном ядерном слое (2), увеличение межклеточных промежутков, визуализировались остатки ядер некротизировавшихся, либо подвергшихся апоптозу клеток (3). Также было отмечено уменьшение толщины слоя нервных волокон (4). Степень указанных изменений была больше в глазах с 4 вариантом СМЛВ. Сходные изменения структуры ХРК (1-3) также наблюдались в глазах кроликов после СМЛВ по 2 варианту в срок 1 месяц (рисунок 3.3 б), однако их выраженность была существенно меньше. в. г. Окраска гематоксилином-эозином, увеличение х400. Пояснения в тексте Рисунок 3.4 - Гистологические препараты ХРК после СМЛВ по 3 варианту в срок 1 сутки (а) и 1 месяц (б), по 4 варианту в срок 1 сутки (в) и 1 месяц (г) Таким образом, согласно результатам морфологического исследования, наиболее оптимальными с точки зрения безопасности для структурной целостности ХРК оказались энергетические параметры СМЛВ с минимальной интенсивностью лазерного излучения, а именно скважность 5% и длительность пакета 100 мс. Поэтому для проведения второго этапа эксперимента было принято решение использовать энергетические параметры 1-го варианта СМЛВ. 3.2 Оценка особенностей тканевого ответа хориоретинального комплекса на СМЛВ
На втором этапе эксперимента осуществлялось иммуногистохимическое исследование с целью определения экспрессии PEDF после СМЛВ с длиной волны 577 нм, а также оценка безопасности и эффективности повторного сеанса лазерного воздействия. Энергетические параметры лазерного излучения, определенные в ходе 1-го этапа исследования: длительность микроимпульса 100 мкс, длительность пакета 100 мс, диаметр пятна 100 мкм, скважность 5%, подбор мощности -индивидуально. Воздействию подвергались 6 глаз 6 кроликов, животных выводили из эксперимента спустя 1 сутки (2 кролика) и 1 месяц (4 кролика) после СМЛВ. Лазерные аппликаты наносились по всей сетчатке в зоне 3 диаметра диска зрительного нерва кверху и книзу от зрительной лучистости с расстоянием не более одного диаметра пятна друг от друга. Повторное лазерное воздействие было проведено на двух глазах двух кроликов с прежними энергетическими параметрами в срок 2 недели после первого сеанса. На глазах с повторным СМЛВ дополнительно проводилось морфологическое исследование для оценки структурных изменений ХРК.
Иммуногистохимическое исследование в первые сутки после лазерного воздействия продемонстрировало более интенсивное прокрашивание препарата (рисунок 3.5 а) по сравнению с интактным глазом (рисунок 3.5 б), что доказывает более высокое содержание PEDF в тканях ХРК. а. б.
Разработка технологии комбинированного лазерного лечения ДМО
В ходе сравнительного анализа динамики МКОЗ между пациентами клинических групп статистически значимой разницы выявлено не было. Между тем, наибольшее повышение среднего значения МКОЗ в течение периода наблюдения наблюдалось в основной группе и составило 0,10±0,08, а наименьшее - в контрольной группе (0,04±0,07).
Положительная динамика резорбции макулярного отека, по данным ОКТ, также не имела статистически значимых различий среди пациентов всех трех клинических групп. Среднее уменьшение ТС в основной группе составило 65,6±61,4 мкм, в контрольной группе средняя ТС снизилась на 46,8±49,2 мкм. Наименьшая динамика средней ТС зарегистрирована в группе сравнения -36,5±40,0 мкм.
Анализ средней светочувствительности сетчатки показал достоверное снижение СЧ в контрольной группе по сравнению с основной и группой сравнения в срок наблюдения 3, 6 и 12 месяцев. Среднее повышение СЧ в 1-й группе, таким образом, составило 1,6±1,0 дБ, во 2-й группе 1,1±1,4 дБ. СЧ в контрольной группе, напротив, снизилось на 1,5±0,7 дБ.
Таким образом, в ходе сравнительного анализа клинико-функциональных результатов лечения ДМО, статистически значимые различия между показателями в клинических группах были получены только в части изменения центральной светочувствительности сетчатки. Снижение средней СЧ в группе контроля было вполне прогнозируемым с учетом того, что в данным пациентам проводилось только пороговое ("повреждающее") лазерное воздействие, в большинстве случаев (72%) - двукратное.
Отсутствие же достоверной разницы уменьшения средней ТС, равно как и довольно неубедительная динамика МКОЗ в группе сравнения, требовала дальнейшего изучения. С целью оценки влияния исходного структурного состояния сетчатки на результаты лечения, было принято решение о более подробном анализе клинико-функциональных показателей пациентов.
Так, пациенты в каждой из клинических групп были разделены на 2 подгруппы в зависимости от исходной ТС: в подгруппах I A, II A и III A данное значение составило 400 мкм, в подгруппах I B, II B и III B, соответственно, 400 мкм и более (Таблица 5.4). При этом величина ТС в большинстве случаев отражала характер структурных изменений сетчатки: при "плоских" отеках чаще наблюдался 1-й ОКТ-паттерн (ДРУ, 91,5%), а при "высоких" отеках - 2-й и 3-й ОКТ-паттерны (кистозный ДМО, в том числе с отслойкой НЭ, 92,7%). Таблица 5.4 - Распределение пациентов в подгруппы в зависимости от исходной ТС
При анализе динамики средней МКОЗ среди пациентов с толщиной сетчатки 400 мкм (Таблица 5.5) установлено, что к концу срока наблюдения происходило достоверное повышение остроты зрения во всех трех подгруппах. При этом в подгруппе комбинированного лазерного лечения (I A) постепенное увеличение средней МКОЗ прослеживалось с 1-го по 6-й месяцы, после чего данный показатель оставался стабильным до окончания срока наблюдения. В подгруппе II A (СМЛВ) достоверное увеличение средней МКОЗ происходило в срок 6 месяцев от начала лечения, достигнув максимума к 12-му месяцу наблюдения. У пациентов подгруппы III A (mETDRS) наиболее высокое значение средней МКОЗ достигнуто к сроку 3 месяца от начала лечения, после чего данный показатель несколько снизился к концу наблюдения. Тем не менее, в данной подгруппе полученные результаты в 3, 6 и 12 месяцев оказались достоверно выше исходного значения (p 0,05).
При сравнении средней МКОЗ среди пациентов I-III A подгрупп статистически значимых различий после операции выявлено не было. Кроме того, исходная средняя МКОЗ пациентов II A подгруппы оказалась достоверно выше по сравнению с подгруппами I A и III A.
При оценке динамики средней центральной толщины сетчатки в исследуемых подгруппах (Таблица 5.6) установлено, что в целом положительная динамика резорбции макулярного отека сопровождалась постепенным снижением ТС в течение всего периода наблюдения в подгруппах I A и II A. Стоит отметить, что в III A подгруппе к 6-му месяцу от начала лечения наблюдалось повышение средней ТС, которое, тем не менее, к концу наблюдения достоверно снизилось. При сравнительном анализе средней ТС в I и II A подгруппах достигнуто более быстрое снижение данного показателя в первый месяц от начала лечения по сравнению с III A подгруппой. В сроки наблюдения 3, 6 и 12 месяцев средняя ТС была достоверно выше в подгруппе mETDRS. К 6-му месяцу наблюдения средняя ТС в данной подгруппе повысилась относительно показателя, достигнутого в срок 3 месяца (соответственно, с 321,0±28,6 мкм до 331,2±63,6 мкм) на фоне постепенного снижения ТС в I и II A подгруппах.
Результаты исследования центральной светочувствительности (Таблица 5.7) показали, что в подгруппах комбинированного лазерного лечения и СМЛВ (I A и II A, соответственно) достигнуто статистически значимое повышение средней СЧ к концу срока наблюдения. В подгруппе III A (mETDRS), напротив, данный показатель достоверно снижался с 1-го по 12-й месяц наблюдения. Таким образом, при сравнении средней СЧ между подгруппами данный показатель оказался достоверно ниже в III A подгруппе в сроки 3, 6 и 12 месяцев наблюдения при одновременном повышении данного показателя в подгруппах комбинированного лазерного лечения и СМЛВ.
При анализе динамики остроты зрения в исследуемых подгруппах было установлено, что достоверное повышение МКОЗ было достигнуто только в подгруппе комбинированного лечения в сроки 6 и 12 месяцев от начала лечения (Таблица 5.8). В подгруппах СМЛВ и mETDRS статистически значимых различий не отмечено ни на одном из сроков наблюдения. Статистически значимой разницы средней МКОЗ между подгруппами I-III B выявлено не было. Тем не менее, в подгруппе комбинированного лазерного лечения данный показатель имел тенденцию к плавному повышению, в то время как в подгруппах СМЛВ и mETDRS динамика была менее стабильной. Так во II B подгруппе максимальное повышение средней МКОЗ с 0,39±0,28 до 0,42±0,27 достигнуто только спустя 1 месяц от начала лечения, затем наблюдалось снижение остроты зрения к сроку 6 месяцев до 0,37±0,23, и к концу наблюдения средняя МКОЗ практически не отличался от исходных значений (0,39±0,24). В подгруппе III B также отмечалась волнообразная динамика средней МКОЗ с максимумом в 3 месяца наблюдения и снижением к 6-му месяцу, соответственно, с 0,30±0,17 до 0,35±0,17 и 0,31±0,16.