Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы (эпидемиология, факторы риска, патогенез, классификация вмд, клиническая картина, диагностика, лечение ВМД) 10
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 27
Глава 3. Клинико-лабораторные и иммунологические особенности начальной и промежуточной стадий ВМД 38
3.1. Клинико - морфофункциональные характеристики начальной и промежуточной стадий ВМД 38
3.2 Особенности лабораторных показателей у пациентов с начальной и промежуточной ВМД 43
3.3. Особенности гемодинамики глаза при начальной и промежуточной стадиях ВМД 43
3.4. Роль иммунологических факторов в патогенезе и прогрессировании ВМД
3.4.1 Состояние неспецифических факторов иммунной защиты 46
3.4.2 Особенности локального и системного цитокинового статуса на начальной и промежуточной стадиях ВМД 47
ГЛАВА 4. Влияние препарата трайкор на клинико морфологические, иммунологические и гемодинамические параметры при начальной и промежуточной стадиях ВМД 55
4.1. Динамика клинико – лабораторных показателей 55
4.2. Динамика клинико – функциональных параметров и показателей регионарной гемодинамики глаза 57
4.3. Динамика иммунологических показателей на фоне приема препарата Трайкор 59 Заключение 78
Выводы 81
Практические рекомедации 83
Список литературы
- Материалы и методы исследования
- Особенности гемодинамики глаза при начальной и промежуточной стадиях ВМД
- Особенности локального и системного цитокинового статуса на начальной и промежуточной стадиях ВМД
- Динамика клинико – функциональных параметров и показателей регионарной гемодинамики глаза
Материалы и методы исследования
Стадии 1-3 были названы «возрастной макулопатией» и ее частота распределялась следующим образом: 1 стадия - 36,5%; 2 стадия - 10,2%; 3 стадия - 2,5%. Таким образом, по оценке этого исследования, 3,3% населения старше 65 лет страдает ВМД, из них женщин на 40% больше, чем мужчин [113, 175, 240].
Популяционное исследование Rotterdam Study с участием 4170 пациентов с наличием крупных друз в макуле также подтвердило эффективность комбинированной схемы лечения AREDS в предупреждении прогрессирования ВМД, снижение риска развития поздней стадии заболевания составило 35% [263].
Исследование Eye Disease Control Study подтвердило высокодостоверную (p=0,0001) взаимосвязь между распространенностью ВМД и уровнем лютеина и зеаксантина в плазме крови. При их низких концентрациях риск развития неоваскулярных поражений возрастал на 70% и выше [81]. Крупное популяционное исследование POLA study, выполненное на 899 испытуемых, выявило высокодостоверную взаимосвязь между высоким содержанием лютеина и зеаксантина в плазме крови и снижением частоты ВМД [119, 120, 121].
В исследовании CAREDS были получены аналогичные данные. Высокое содержание лютеина и зеаксантина в пище (3–6 мг/сут) по сравнению с группой низкого потребления каротиноидов (0,5–0,8 мг/сут) снижало риск развития ВМД на 43–57% [195].
На фоне приема высоких доз лютеина (12 мг) и зеаксантина (0,6 мг) увеличение оптической плотности макулярных пигментов подтверждена в 3-летнем рандомизированном плацебо-контролируемом исследовании с двойным слепым контролем CARMA [202].
Аналогичные результаты представила исследовательская группа LUNA. При добавлении к рациону 12 мг лютеина и 1 мг зеаксантина в виде эфиров, 120 мг витамина С, 17,6 витамина Е, 10 мг цинка и 40 мкг селена приводит к значительному повышению оптической плотности макулярного пигмента в радиусе 0,5 от центра сетчатки [260]. Представлены данные по влиянию зеаксантина и лютеина в виде нутриентов в комбинации с антиоксидантами на концентрации их в сыворотке крови и уровень макулярного пигмента у пациентов с ВМД и без нее [250, 252].
Известно, что ВМД относится к многофакторным заболеваниям [15, 92, 93]. Помимо главного фактора – возраста [112, 114, 135, 144], существуют дополнительные факторы риска развития этого заболевания [105, 106, 108, 150, 231, 236]. К ним относятся генетическая предрасположенность [254, 271, 272, 277], женский пол [113, 176, 240], алкоголь [104, 107, 136, 198], курение [136, 175, 180, 232, 244, 247, 257]. Показано, что риск развития поздней ВМД у курильщиков возрастает от 2,5 до 4,5 раз. Кроме того, прекращение курения сопровождается снижением риска ВМД. Риск развития ВМД у тех, кто не курил более 20 лет был сравним с риском у некурящих [247]. Воздействие ультрафиолетового излучения [117, 174]. В ряде исследований представлена взаимосвязь между развитием ВМД и низкой концентрацией основных типов питательных веществ в плазме крови, а также в пищевом рационе: антиоксидантов — витаминов С, Е, и цинка, каротиноидов, лютеина, зеаксантина и Омега-3 длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот [73, 103, 106, 109, 111, 120, 157, 194, 202, 232, 248, 260, 263].
Существует определенная генетическая предрасположенность: дети родителей, страдающих ВМД, в последствии имеют высокий риск развития заболевания. Многочисленные исследования последних лет показали семейный, наследственный характер ВМД с аутосомно-доминантным типом наследования. Есть сведения о клинических проявлениях ВМД в больших семьях, отмечающихся у нескольких поколений. Ученые определили, что за развитие ВМД могут отвечать 50 генов [229].
Известно что ген фактора комплемента H регулирует систему комплемента, атаку иммунной системы против различных инфекций и патологических клеток, нормальные клетки при этом не повреждаются Пациенты, гомозиготные по аллели риска Y402H фактора комплемента Н, характеризуются увеличением риска развития ВМД в 7,4 раза, а ген фактора комплемента В - активацию иммунного ответа, у 74% пациентов с ВМД отмечается неблагоприятные генетические варианты несут неблагоприятные генетические варианты [122, 124, 155, 273].
В последние годы активно изучается роль иммунологических факторов в развитии ВМД [7, 44, 49, 54, 55, 56, 57, 61, 210, 225, 231]. Накопленный материал позволяет считать, что наряду с генетической предрасположенностью, иммунологические факторы вносят существенный вклад в развитие ВМД [146, 151, 154, 167, 168, 208, 210].
Определена роль инфекционных факторов в патогенезе ВМД [40, 53, 59]. Фундаментальные экспериментальные исследования [74] свидетельствуют о том, что локальные и системные нарушения иммунитета проявляются уже в начале заболевания и затрагивают на первом этапе преимущественно макрофагальное звено и систему комплемента [40, 98, 141, 150, 260, 276]. Более глубокие нарушения проявляются дисбалансом в системе цитокинов, гиперсекрецией ангиогенных факторов и дефицитом их антагонистов, что во многом определяет переход в позднюю стадию ВМД с развитием тяжелых осложнений, приводящих к потере зрения [216, 217, 218, 234, 236, 245, 259, 265, 270, 276]. Прогрессирование патологического процесса и развитие поздних форм ВМД (неоваскулярная и атрофическая ВМД) сопровождается усугублением локальной ишемии, нарушением тканевой перфузии, что также приводит к гиперпродукции ангиогенных ростовых факторов [80, 81, 84, 90, 127, 147, 159, 243, 278].
Особенности гемодинамики глаза при начальной и промежуточной стадиях ВМД
Ультразвуковое исследование глаза и орбиты проводилось на базе отдела ультразвуковой диагностики (руководитель – д.м.н., проф. Т.Н. Киселева) ФГБУ «МНИИ ГБ им. Гельмгольца» Минздрава России. Ультразвуковое исследование гемодинамики глаза было выполнено в отделе ультразвуковых исследований совместно с к.м.н. Рамазановой К.А. под руководством д.м.н., профессора Киселевой Т.Н.
В последние годы, благодаря развитию новых неинвазивных ультразвуковых методов исследования, появилась возможность более детально изучать состояние кровотока в сосудах глазного яблока и магистральных артериях головы.
Для оценки регионарной гемодинамики применяли методы диагностики сосудистой патологии глаза: ультразвуковое дуплексное сканирование в режимах цветового допплеровского картирования (ЦДК) и импульсной допплерографии, позволяющих провести качественную и количественную оценку кровотока в сосудах малого диаметра. Исследование проводили на многофункциональном ультразвуковом диагностическом приборе VOLUSON 730 Proфирмы «General Electric Healthcare» с использование линейного датчика частотой от 10 до 16 МГц контактным транспальпебральным методом в положении больного лежа на спине.
При ЦДК сосуды идентифицировали по отношению к анатомическим образованиям орбиты (топографическая идентификация), по цветовому коду и в зависимости от направления движения крови относительно датчика- кровоток в артериях кодировался красным цветом, в венах- синим. Цвета становились более светлыми при увеличении скорости, низкие скорости кодировались темными тонами красного и синего.
Кровоток в глазной артерии (ГА) определяли от места изгиба сосуда вокруг зрительного нерва до верхнего угла орбиты (в среднем на глубине 20мм). Для спектра ГА характерно наличие заостренной систолической волны, узкой зоны спектра с концентрацией частот в систолу вблизи их максимального значения и высокой пологой диастолической составляющей. В норме спектры кровотока, полученные в ГА, были симметричны с обоих сторон. Центральную артерию сетчатки (ЦАС) и центральную вену сетчатки (ЦВС) лоцировали в толще ствола зрительного нерва на расстоянии 2 ммот заднего полюса глаза. Задние короткие цилиарные артерии (ЗКЦА) - медиальные и латеральные, идентифицировали параллельно стволу зрительного нерва его ретробульбарной части на расстоянии 1,5-2,5 мм от зоны проекции ЦАС. Поток крови в них направлен строго в сторону глазного яблока. ЗКЦА заканчивались сосудистыми сплетениями в проекции угла, образованного стволом зрительного нерва и склерой.
После проведения идентификации орбитальных сосудов, переходили к выполнению импульсной допплерографии с количественной оценкой допплеровского спектра кровотока по следующим показателям: максимальной систолической скорости (Vsyst), конечной диастолической скорости (Vdiast), индекса резистентности или периферического сопротивления Pourselot (RI).
Vsyst – наибольшая линейная скорость движения отдельных частиц крови в потоке в момент его максимального ускорения в систолу, отражается в самом большом по величине отклонении допплеровской кривой. Vdiast – зависит от сопротивления кровотоку дистальнее точки измерения: чем больше это сопротивление, тем меньше диастолическая скорость. RI – рассчитывается как соотношение разности максимальной систолической и конечной диастолической скоростей к максимальной систолической скорости. RI = (Vsyst – Vdiast)/Vsyst. Определение его необходимо для оценки состояния сосудистой системы проксимальнее и дистальнее исследуемого сосуда.
В ранее опубликованных работах представлены результаты исследования глазного кровотока, а также состояния брахиоцефальных артерий у больных с «сухой» ВМД [7, 8]. Авторами определено наличие S-образной патологической извитости внутренней сонной артерии (ВСА) у 45,8% пациентов и С-образной извитости ВСА у 42,5 % пациентов и установлено снижение максимальной систолической и конечной диастолической скорости кровотока в ГА, ЦАС и ЗКЦА. В литературе представлены сведения о целесообразности использования ЦДК и допплерографии сосудов глаза и орбиты для оценки эффективности медикаментозной терапии ВМД [42,274].
Иммунологические исследования проводились на базе лаборатории иммунологии и вирусологии МНИИ ГБ им. Гельмгольца (руководитель – д.б.н., профессор О.С. Слепова) совместно с к.б.н. Н.В. Балацкой.
Материал лабораторных исследований – сыворотка, клетки периферической крови, слезная жидкость (СЖ).
1. Исследование компонентов системы комплемента (белки С3, С3а, компоненты альтернативного пути - H402 и Y402 варианты фактора Н; нативный мембраноатакующий комплекс МАК) регуляторов апоптоза (белки Bcl-2, каспаза-8 и каспаза-9) на местном (СЖ) и системном (СК) уровнях будет проведено методом ИФА с использованием диагностических тест - систем согласно инструкциям, предлагаемым производителями и учетом результатов на микропланшетном фотометре «Multiscan» при длине волны 450 нм.
2. Оценка субпопуляционного состава лимфоцитов периферической крови была проведена при помощи проточной лазерной цитофлуориметрии на цитометре BD FACS Canto II («BectorDickinson», CША), с использованием меченных моноклональных антител Multitest 6-Color TBNK Reagent («BectorDickinson», CША). Относительное и абсолютное содержание популяций и субпопуляций лимфоцитов определялось с помощью программы ВD FACS Canto с выделением анализируемого региона по общей популяции лейкоцитов, экспрессирующих CD45+ антиген и по гранулярности клеток (CD45 Per CP-Cy5,5 /SSC). Применение меченые антител к СD3+(FITC), CD4+(PE-Cy7 ), CD8+(APC-CY7 ), CD16+/56+(PE), CD19+(APC ) позволило дифференцировать клетки: Т-лимфоциты (CD3+), Т-хелперы (CD3+CD4+CD8-), T-цитотоксические (СD3+ CD4- CD8+), T-«двойные позитивы» (СD3+ CD4+ CD8+), NK-клетки – натуральные киллеры (CD16+ СD56+), В-лимфоциты (CD19+), кроме того определить иммунорегуляторный индекс (ИРИ), отражающий баланс T- хелперов и цитотоксических Т-клеток (СD4+/СD8+).
Особенности локального и системного цитокинового статуса на начальной и промежуточной стадиях ВМД
Исследование кровотока в ГА у пациентов с начальной и промежуточной стадиями ВМД (AREDS 2, 3) показало достоверно значимое снижение максимальной систолической скорости кровотока в этом сосуде по сравнению с группой контроля (33,10±0,60 и 31,1±0,11 соответственно, р 0,05). Максимальная систолическая скорость кровотока в пределах нормы (12,36±0,52). Небольшое снижение систолической скорости кровотока в ЗКЦА начальной и промежуточной стадиями ВМД.
Важным критерием оценки состояния гемодинамики в глазных сосудах малого диаметра является индекс периферического сопротивления, или индекс резистентности (RI). У пациентов с ранней и промежуточной стадиями ВМД RI в ЦАС находился в пределах нормы (0,69±0,02). При AREDS 2,3 изменений в ЗКЦА не наблюдалось (0,62±0,02).
Таким образом, анализ результатов наших исследований выявил, что при начальной и промежуточной стадии ВМД имело место нарушение магистрального кровотока (снижение Vsyst и повышение RI в ГА) [45].
Результаты исследования состояния неспецифических факторов иммунной защиты представлены в таблице 6 и на рис. 15. Сравнительный анализ содержания компонентов комплемента показал существенное статистически значимое (p 0,05) снижение концентраций белков С3 (общего, как для классического, так и альтернативного путей; в неактивной С3 форме), С3а (в незначительном количестве постоянно образующегося в результате диссоциации; существенно продуцируемого при активации классического пути) и С5Ь-9 (терминального мембраноатакующего комплекса (МАК)) у больных ВМД (AREDS 2 и AREDS 3; наиболее выраженное при AREDS 3) по сравнению с «возрастным» контролем (Табл. 6). Не исключено, что такой «дефицит» важнейших компонентов системы комплемента в СК отражает «истощение» их содержания в крови, вызванное активным потреблением на местном уровне.
Функциональный показатель альтернативного пути активации комплемента у пациентов I и II групп до лечения был выше нормы, достоверно нарастал при переходе от AREDS 2 к AREDS 3 [7, 58].
При исследовании содержания уровня С - реактивного белка (одного из ключевых белков острофазного ответа) в СК у больных ВМД и здоровых лиц пожилого возраста наблюдалась аналогичная динамика: выявлено достоверное повышение его уровня пациентов групп AREDS 2 и AREDS 3 (Табл. 6) [58].
Таким образом, представленные данные доказывают, что возникновение и развитие ВМД ассоциируется со сдвигами факторов неспецифического иммунитета: разбалансировкой в системе комплемента - снижением содержания основных компонентов С3, С3а, комплекса С5Ь-9, активацией альтернативного пути и повышением уровня СРБ (подключением острофазного ответа).
Скрининг частоты выявления цитокинов в СК и СЖ у пациентов с ВМД в сравнении с возрастным контролем представлен на рисунке 16 (А, Б, В). Исследование СК в группе здоровых лиц пожилого возраста показало, что факторы роста VEGF-А, TGF1, IL18 обнаруживались в 100% проб, в 60-80 % случаев были выявлены IL6, IL8 [52].
Скрининг (по частоте выявления) цитокинов в СК и СЖ у пациентов с начальной и промежуточной стадиями ВМД в сравнении с AREDS 1 Примечание: достоверное отличие от контроля (AREDS 1); достоверное различие между группами AREDS 2 и AREDS 3. Приблизительно в половине случаев в невысоких концентрациях обнаруживались IL2 (продуцируемый активированными Т-хелперами), провоспалительный ТNF и противовоспалительный цитокин IL10 (Рис.16) [52].
При исследовании проб СК пациентов с ВМД было обнаружено, что в обеих клинических группах (AREDS 2 и AREDS 3) имели место значительные сдвиги от «нормы» в частоте выявления и/или концентрации 6 из 16 цитокинов: увеличение содержания таких медиаторов воспаления как IL1, IL 5, IL8, при уменьшении IL6 и противоспалительного IL10, а также снижении уровня TGF1 (важнейшего иммунорегуляторного фактора) [56].
Усугубление изменений на глазном дне (AREDS3) ассоциировалось с нарастанием сдвигов в системном цитокиновом статусе уже 9 из 16 цитокинов [55].
Дифференцированный сравнительный анализ данных выявил существенные различия между пациентами с начальной и промежуточной стадиями ВМД и возрастным контролем (табл. 7). Это проявилось, прежде всего, статистически значимой разницей уровней IL1, IL6, IL8, ростовых факторов VEGF-А и TGF 1 в СК при 70-100% частоте выявления указанных цитокинов. Выявлено, что у пациентов с начальной стадией ВМД (AREDS 2) содержание в СК IL1 (провоспалительного), IL8 (ключевого хемотаксического) было достоверно выше (19,2±4,1 пг/мл и 560±76 пг/мл, соответственно, против 3,9±1,2 пг/мл и 44,3±10,5 пг/мл в контроле), при существенном статистически значимом снижении уровней IL6 и трансформирующего фактора роста TGF1 (Табл.7).
Динамика клинико – функциональных параметров и показателей регионарной гемодинамики глаза
Возрастная макулярная дегенерация (ВМД) – тяжелое прогрессирующее заболевание, характеризующееся поражением центральной зоны сетчатки, является одной из основных причин потери зрения. Несмотря на то, что главным фактором риска является возраст, в последние годы заболевание имеет тенденцию к омоложению. В настоящее время основные усилия офтальмологов направлены на лечение влажной ВМД, являющейся причиной значительного и часто необратимого снижения центрального зрения. Поэтому разработка подходов к ранней диагностике даст возможность своевременного лечения заболевания именно на начальной и промежуточной стадиях.
Целью настоящей работы явилось определение клинико иммунологических критериев прогнозирования и лечения начальной и промежуточной стадий ВМД. Работа основана на результатах собственного офтальмологического обследования 120 пациентов (240 глаз). Из 120 пациентов (240 глаз) у 90 пациентов (180 глаз) диагностирована сухая ВМД (82 глаза начальная стадия, 98 глаз промежуточная). Таким образом, изучение клинических проявлений проводилось на 180 глазах. По данным проведенных биохимических исследований у 73% обследованных пациентов выявились нарушения показателей липидного профиля. Однако, статистически значимые отклонения были определены у 45 пациентов (90 глаз). Группу сравнения составили 45 пациентов (90 глаз) без нарушений или с небольшими отклонениями от нормы показателей липидного обмена.
Для коррекции дислипидемии был назначен фенофибрат (препарат Трайкор) в дозе 145 мг 1 раз в день в течение 9 месяцев (часть больных продолжила прием препарата в течение 3 лет). В группе пациентов, принимавших Трайкор, несмотря на непродолжительный срок лечения (9 месяцев) было выявлено влияние данного препарата на биохимические показатели крови (ХС, ЛПНП, ТГ, ИА).
Иммунологическое исследование было проведено до и после лечения (9 месяцев). Офтальмологическое наблюдение продолжалось в течение 3 лет. В группе пациентов с начальной стадией ВМД (AREDS 2) на фоне приема препарата Трайкор стабилизация зрительных функций и клинической картины наблюдалась на 36 глазах (92%). Прогрессирование процесса с переходом из начальной в промежуточную стадию было зафиксировано на 3 глазах (8 %). В группе с AREDS 3 стабилизация зрительных функций была выявлена на 50 глазах. В одном случае отмечался переход заболевания во влажную форму (AREDS 4).
После курса медикаментозного лечения фенофибратом у всех пациентов с ВМД отмечалось достоверное снижение RI в ГА и ЗКЦА и нормализация показателей максимальной систолической и конечной диастолической скорости кровотока в ЗКЦА как при начальной, так и при промежуточной стадиях ВМД.
Применение препарата в течение 9 месяцев оказывало положительное влияние на состояние гемодинамики глаза и показатели липидного обмена у пациентов с AREDS 2 и AREDS 3.
В группе пациентов, принимавших Трайкор, несмотря на непродолжительный срок лечения (9 месяцев) было выявлено положительное влияние данного препарата. Иммунологическое исследование было проведено до и после лечения (9 месяцев). Офтальмологическое наблюдение продолжалось в течение 3 лет.
При исследовании динамики функционального показателя активации альтернативного пути системы комплемента в СК выявлена тенденция к нормализации его активности в обеих группах, при этом статистически значимое снижение среднего функционального показателя с 98±10% до 85,7± 16% (р 0,05) обнаружено в СК пациентов с промежуточной стадией ВМД (AREDS 3). Через 9 месяцев от начала лечения выявлено достоверное уменьшение СРБ в СК пациентов обеих групп, наиболее выраженное в группе пациентов с начальной ВМД.
Данные исследования цитокинов в СК пациентов с начальной и промежуточной стадиями ВМД не выявили отрицательной динамики провоспалительных цитокинов IL1, IL6, IL8, ангиогенного VEGF-A и трансформирующего TGF1 факторов роста.
В ходе лечения в обеих группах отмечалась положительная тенденция к восстановлению баланса системы комплемента – статистически значимые сдвиги компонентов С3а, С5b-9, значения которых, однако, не достигли границы нормы.
Результаты иммунологического исследования показали, что применение фенофибрата Трайкор сопровождается противовоспалительным, стабилизирующим эффектом, который подтверждается тенденцией к нормализации изученных иммунологических параметров. Это является важным исходя из патогенетической значимости «неспецифического» воспаления в возникновении и развитии ВМД.
Таким образом, критериями эффективности применения препарата у пациентов с начальной и промежуточной стадиями ВМД могут считаться: нормализация показателей липидного профиля, нормализация показателей гемодинамики глаз, стабилизация системных иммунологических параметров.