Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор лиературы 18
1.1. Исторические аспекты применения полимерных материалов в офтальмохирургии
1.1.1. Полимерные материалы для изготовления интраокулярных имплантов
1.1.2. Современные полимерные материалы, как основа для изготовления итрастромальных имплантов
1.2. Биосовместимость полимерных материалов 21
1.2.1. Модели для определения и оценки биосовместимости полимерных материалов
1.2.2. Способы изменения биосовместимости полимерных материалов
1.3. Современное состояние и перспективы интрастромальной кератопластики с имплантацией роговичных сегментов у пациентов с кератэктазиями различного генеза
Глава 2. Материал и методы собственных исследований
2.1. Характеристика полимерных материалов 55
2.1.1. Образцы для проведения клеточного культивирования выделенных клеток стромы роговицы
2.1.2. Полимерные роговичные сегменты, используемые для изучения биосовместимости при органотипическом культивировании в условиях нормотермии
2.2. Характеристика донорского материала 61
2.3. Исследование биосовместимости полимерных материалов на модели двухмерного культивирования выделенных клеток стромы роговицы человека
2.3.1. Техника выделения первичного клеточного материала 2.3.2. Двухмерное клеточное культивирование выделенных клеток стромы роговицы в присутствии исследуемых полимерных материалов
2.4. Исследование биосовместимости полимерных материалов на модели органотипического культивирования выделенных роговиц кадаверных глаз
2.4.1. Техника имплантации полимерных роговичных сегментов в роговицу кадаверного глаза
2.4.2.Органотипическое культивирование в условиях нормотермии
2.5. Исследование биосовместимости in vivo на модели экспериментальных животных
2.6. Лабораторные методы исследования 83
2.6.1. Флуоресцентная микроскопия 85
2.6.2. Электронно - сканирующая микроскопия 86
2.7. Статистические методы 88
Глава 3. Математическое обоснование и оценка эффективности (ex vivo) новой модели роговичного сегмента для интрастромальной кератопластики
3.1. Обоснование и расчеты параметров роговичного сегмента для интрастромальной кератопластики
3.1.1. Расчет высоты передней поверхности роговичного сегмента 91
3.1.2. Расчеты высоты задней поверхности роговичного сегмента 96
3.1.3. Обоснование и расчет угла наклона продольной оси поперечного сечения роговичного сегмента
3.2. Определение эффективности имплантации разработанной модели роговичного сегмента
3.2.1. Определение положения интрастромальных роговичных сегментов различной модели в роговице кадаверного глаза
3.2.2 Исследование изменений кривизны передней и задней поверхности роговицы кадаверного глаза при имплантации РС разработанной модели по результатам Шаймпфлюг кератотомографии
Глава 4. Результаты собственных исследований 118
4.1. Исследование биосовместимости полимерных материалов на модели двухмерного культивирования выделенных клеток стромы роговицы человека
4.1.1. Определение степени пролиферации выделенных клеток стромы роговицы в присутствии полимерных материалов
4.1.2. Определение индекса пролиферации выделенных клеток стромы роговицы при двухмерном клеточном культивировании в присутствии полимерных материалов
4.2. Исследование биосовместимости полимерных материалов на модели органотипического культивирования выделенных роговиц кадаверных глаз
4.2.1. Оценка клеточной жизнеспособности методом флуоресцентной микроскопии
4.2.2. Определение тканевого ответа методом электронносканирующей микроскопии
4.2.2.1. Разработка методики подготовки тканеобразцов для проведения электронно-сканирующей микроскопии
4.2.2.2. Электронно-сканирующая микроскопия поверхности полимерного роговичного сегмента и роговичного тоннеля
4.3. Морфофункциональные изменения роговицы кролика после интрастромальной кератопластики с имплантацией полимерных роговичных сегментов из ПММА/ГЭМА (содержание воды 18%) и бисГМА
Обсуждение полученных результатов
Заключение
Выводы 182
Список литературы
- Современные полимерные материалы, как основа для изготовления итрастромальных имплантов
- Образцы для проведения клеточного культивирования выделенных клеток стромы роговицы
- Обоснование и расчет угла наклона продольной оси поперечного сечения роговичного сегмента
- Определение индекса пролиферации выделенных клеток стромы роговицы при двухмерном клеточном культивировании в присутствии полимерных материалов
Современные полимерные материалы, как основа для изготовления итрастромальных имплантов
Для уменьшения токсичности силикона было предложено несколько методик поверхностной обработки готового изделия, в результате которых изменяются адгезивные свойства поверхности импланта. Одной из них является обработка поверхности низкотемпературной плазмой в присутствии ряда химических веществ (нитрита титана, кислорода, 2 метиакрилоксиетилфосфорилхолин и т.д.) [120; 197; 203]. В 1960 году чешские химики Wichterle O. и Lim D. синтезировали ГЭМА. Начиная с этого времени многие исследователи по всему миру проводили работы, посвященные эффективности и безопасности использования данного материала в офтальмологии [199]. Одним из первых хорошую совместимость гидрогеля с тканями роговицы отметил Dohlman C. (1967) в экспериментах, проводимых на кроликах [97]. Далее на протяжении почти 20 лет ученые предпринимали попытки определить наиболее подходящее процентное содержание воды в гидрогеле для его ареактивного нахождения в строме роговицы. В проведенных исследованиях было доказано отсутствие тканевой реакции со стороны роговицы на присутствие имплантов, выполненных из Лидофилкона А (содержание воды 68%), Лидофилкона В (содержание воды 79%), Пермаленса (содержание воды 71%) [70; 71; 158].
Опираясь на мировой опыт использования различных полимеров и полимерных композиций для производства офтальмологических имплантов можно заключить, что наиболее часто используемыми являются ПММА и ГЭМА, как в чистом виде, так и в форме смесей.
Основным качеством, которым должны обладать полимеры, выбранные для медицинских изделий, является биосовместимость, которая характеризуется отсутствием токсичности и эффективным функционированием на протяжении использования. Токсичность является комплексом явлений, имеющих место in vivo, среди которых могут быть: прямое повреждение клеток (цитотоксического действия противораковых препаратов) и физиологические эффекты (воспалительные и аллергические реакции и пр.). Провести исследования этих свойств в системе достаточно сложно, поэтому большинство исследователей проводят определение токсичности на примере клеточных культур [38]. Изучение цитотоксичности различных материалов сводятся к анализу таких параметров культуры клеток как выживаемость и клеточный рост: определение метаболической активности или регенеративного потенциала клеток и клеточной массы. Для этого необходимо ориентироваться на кривую роста культуры клеток в присутствии исследуемого материала или вещества, построение которой индивидуально в каждом конкретном случае.
Согласно проведенным ранее работам [25; 31; 37; 44], имплантация любого чужеродного материала, в том числе биологических тканей, в ткани организма, вызывает воспалительно - репаративную реакцию, приводящую к активации пролиферации фибробластов, образованию новых коллагеновых волокон и других компонентов внеклеточного матрикса, и, как результат формирование соединительнотканной капсулы вокруг импланта. Когда инородный материал вводится в толщу биологической ткани, происходит немедленная адсорбция тонкого слоя белков на его поверхности. Имплантированный полимер ввиду первоначального притяжения полиморфонуклеарных клеток и моноцитов становится основным объектом для реакции на границе «полимер – ткань». В ходе проведения спектрального анализа состава белкового слоя на поверхности импланта, было определено, что этот слой состоит из 6 основных белков: альбумин, фибронектин, трансферрин, фибрин/фибриноген, иммуноглобулин и фракция С3. Наличие этих компонентов на поверхности импланта изменяет его адгезивные свойства и приводит к появлению большей адгезии клеток [181]. Активация клеточной адгезии к материалу, находящемуся в толще стромы, приводит к образованию капсулы вокруг него. В исследованиях Zavala E. с соавторами (1984) было установлено, что величина толщины капсулы, образованной вокруг инородного тела, является относительным показателем биосовместимости [207].
Помещение любого материала в толщу тканей вызывает ответную реакцию со стороны организма. Однако следует отличать развитие ответа тканей на хирургическую травму, который чаще всего идет по типу воспаления, с изменениями, возникающими вследствие присутствия материала. Восстановление целостности ткани после нанесения хирургической травмы происходит в течение двух недель и заканчивается заживлением, проходя все стадии воспаления. Итогом является формирование прочной рубцовой ткани, которое происходит ввиду ответной реакции фибробластов, макрофагов и образования коллагена [200]. Только спустя этот срок можно однозначно говорить, что остаточная воспалительная реакция вызвана непосредственно присутствие материала в ткани [194].
Все биоматериалы можно разделить на токсичные, почти инертные, инертные и биоразрушаемые (Таблица 1) [38; 41]. Идеально биосовместимого материала не существует. Незначительная тканевая реакция так или иначе проявляться будет, при это возникновение клеточной адгезии и, как следствие, капсулообразование будет зависеть от физико-химических свойств самого импланта: пористость, степень заряда поверхности, ее гидратация, качество обработки поверхности [26].
Образцы для проведения клеточного культивирования выделенных клеток стромы роговицы
Для проведения органотипического культивирования и последующей оценки характера взаимодействия тканей роговицы с исследуемыми материалами использовали РС, выполненные на основе ПММА и бисГМА. В соответствии с химическим составом были сформированным опытные группы.
РС, изготовленные из смеси ПММА/ГЭМА (содержание воды 18%), (ООО «НЭП МГ», г. Москва), составили первую опытную группы (Ор-1). Следует отметить, что данный тип РС широко используется в клинической практике офтальмологами РФ, специализирующимися на лечении кератэктазий различного генеза. Данная группа была выбрана контрольной в исследовании изменения кривизны передней и задней поверхностей роговицы при имплантации РС, а так же регистрации тканевой реакции на имплантацию полимерного изделия [14; 15; 19; 20; 21; 28; 35].
Вторую опытную группу (Ор-2) представляли РС (ООО ЭТП «МГ», г. Москва), изготовленные из ПММА, а их параметры соответствовали вычисленным на этапе математического моделирования. Как известно, ПММА достаточно широко распространен в офтальмологической практике как один из наиболее ареактивных материалов для различных имплантов, применяемых в офтальмологии [93; 117; 133; 141; 168; 171; 204].
Третью опытную группу (Ор-3) составили РС производства ООО «Репер-НН» (г. Н.-Новгород). для их изготовления была выбрана полимерная композиция на основе бисГМА. По данным литературы, данный полимер используется в стоматологической практике, где показывает хорошие результаты ареактивного нахождения в ткани организма человека, а так же имеет низкую адгезивную способность в случае соблюдения определенной рецептуры первоначальной смеси мономеров [135; 136; 137; 204].
Используемые РС так же имели различия в своих геометрических параметрах: величине внутреннего и внешнего радиусов, вида поперечного сечения, наличие угла наклона продольной оси поперечного сечения РС относительного горизонтальной плоскости. Более подробно различия используемых РС представлены в таблице 4.
Ввиду отличий химического состава мы предположили различия в адгезивной способности выделенных клеток стромы роговицы и стромальных коллагеновых волокон к поверхности РС, произведенных из различных материалов [85; 108; 168; 190]. Таблица 4 - Параметры исследуемых полимерных роговичных сегментов № Материал Внутренний и Вид Угол Длина п/п основа наружний поперечного наклона дуги РС полимерной диаметры, сечения продоль- смеси мм ной оси поперечного сечения ПММА/ 5,0 Полукруг Ор1 ГЭМА(содержаниеводы 18%) \ 0о 160о
В технологии производства РС, относящихся к группам Ор-1 и Ор-2, есть принципиальные отличия от производства РС группы Ор-3, связанные с процессом получения самого полимера. Как уже говорилось ранее, процесс полимеризации и формирования изделия может быть одно- и двухэтапным. Так РС, выполненные на основе ПММА и ПММА/ГЭМА, относятся к той группе полимерных композиций, для которых характерна двухэтапность: на первом этапе – производство полимера, на втором – промышленная обработка (точение, штампование и т.д.) с целью получения готового изделия. Что же касается изделий группы Ор-3, особенностью производства полимерных изделий из этого материала является возможность одноэтапного производства. Процесс полимеризации фотокомпозиции заканчивается получением готового изделия. Такой одноэтапный подход позволяет уменьшить риск контаминации получаемого продукта, четкого контроля законченности реакции полимеризации, и как следствие уменьшения возможности токсического воздействия «незаблокированных» мономерных остатков, дает возможность реализовывать самые сложные геометрические параметры искомых имплантов [34].
В данной работе донорский материал (кадаверные глаза и выделенные клетки стромы роговицы доноров-трупов) использовали в качестве источника биоматериала для экспериментальных исследований в рамках представленной темы. Все исследования осуществляли в условиях in vitro.
Экспериментальные исследования на кадаверных глазах и клетках, выделенных из роговиц глаз доноров трупов, проводили в соответствии с официально принятыми процедурами и специальным разрешением в рамках законодательства РФ, на основании лицензии Федеральной государственной службы по надзору за Здравоохранением № 99-01-005317 от 30.04.2008 и № ФС-99-01-008251 от 18.02.2013 Глазной тканевой банк Межотраслевого научно-технического комплекса "Микрохирургия глаза" им. акад. С.Н. Федорова, которая позволяет использовать ткани, выделенные из трупных человеческих глаз для целей трансплантации и научных исследований. В связи с установленным режимом работы в Лаборатории клеточных технологий Центра фундаментальной офтальмологии МНТК «Микрохирургия глаза», при работе с донорскими глазными яблоками к ним предъявляют требования инфекционной безопасности [4]. Глазные яблоки доноров-трупов поступают в Глазной тканевой банк МНТК МГ из танатологических отделений Бюро судебно-медицинской экспертизы, согласно действующему договору. Данные о возрасте и поле доноров, а также времени их смерти были предоставлены ответственным сотрудником Бюро судебной экспертизы.
Перед введением глаза донора трупа в эксперимент проводилась серологическая диагностика трупов-доноров на инфицированность вирусами ВИЧ I/II, гепатитов В и С, сифилиса, представляющих потенциальную угрозу для персонала. Клинико-лабораторная диагностика указанных инфекций проводилась в микробиологической лаборатории МНТК МГ по образцам крови, поставляемым вместе с тканями глазных яблок от доноров-трупов. После прохождения проверки на инфекционную безопасность сотрудником Глазного тканевого банка проводилась оценка морфофункционального показателя трансплантабельности по Борзенку С.А. [4].
Для проведения дальнейших экспериментальных исследований отбирались трупные донорские глаза, соответствующие следующим критериям: средний возраст доноров до 56 лет, время от момента смерти донора до начала экспериментальных исследований и консервации не более 12-ти часов, показатели адреналиновой пробы А и В, морфологические показатели 2 и 3 по классификации Борзенка С.А. [4]. Роговицы парных кадаверных глаз составили опытную (правый глаз из пары) и контрольную (левый глаз из пары) группу. Характеристики донора, роговично-склеральный диск которого был использован для получения клеточной культуры, представлены в таблице 5.
Обоснование и расчет угла наклона продольной оси поперечного сечения роговичного сегмента
Целью данного параграфа стало определение и расчет наиболее важных геометрических параметров РС с учетом геометрического соотношения Баракера. Кератэктазии характеризуются прогрессирующим истончением ткани роговицы, что в свою очередь сопровождается неравномерным распределением напряжения в ее строме, при этом в большей степени это выражено с зоне с наименьшей толщиной. Имплантация РС приводит к уменьшению кривизны центральной зоны роговицы. Это сопровождается перераспределением напряжения в строме, что нарушает биомеханику прогрессирования эктазии. За счет формирования «плюс» - ткани на периферии роговицы при относительном уменьшении толщины ее центральной зоны, имплантация РС в глубокие слои стромы сопровождается изменением рефракционной силы роговой оболочки [14].
Роговица представляет собой выпукло-вогнутую линзу, при этом радиус кривизны передней поверхности, отличается от радиуса кривизны ее задней. При рассмотрении ультраструктуры роговицы человека на гистологическом уровне видно, что имеются различия в строении ее передних и задних слоев: более плотное расположение волокон коллагена в передних слоях, приводит к уменьшению модуля упругости ткани от внешних слоев к внутренним [104].
Интрастромальная кератопластика подразумевает формирование роговичного тоннеля механическим путем или с использованием фемтосекундного лазера, в полость которого имплантируют РС. Нахождение РС в строме приводит в первую очередь к изменению распределения сил натяжения в слоях роговицы [14].
Для выбора наиболее оптимальной формы поперечного сечения РС, было рассмотрено несколько теоретических моделей, отличающихся своими параметрами. Предварительно были рассчитаны эффективные значения величины высоты частей РС, обращенных к передней и задней поверхностям роговицы
В данном парагарафе приведен расчет значения минимальной эффективной высоты передней поверхности РС, возволяющей макисмально эффевтивно выполнять основную функцию РС.
Для расчета рефракционного эффекта имплантации РС разной высоты руководствовались геометрическим соотношением Барракера, на примере нормальной роговицы [65].
Примем некоторые обозначения: Rн - среднее значение радиуса кривизны передней поверхности роговицы в зависимости от стадии кератоконуса до имплантации; Rk - радиус кривизны передней поверхности роговицы после имплантации; d - диаметр роговичного сегмента (расстояние между диаметрально противоположными «боковыми» внутренними поверхностями роговичного сегмента); h - высота роговичного сегмента.
Схема поперченного сечения роговичного сегмента, при вычислении эффективного значения h. Исходя из формулы геометрического соотношения Барракера было вычислено значение h при минимальном значении диоптрийного эффекта в 0,75 дптр [192]: h = АН.Л — Rk; h = 0,1, а h0= 7 = 0,05, где ho - высота задней поверхности сегмента. Таким образом, прибавка к высоте сегмента в 50 мкм при увеличении внутреннего радиуса РС дает прибавку к диоптрийному эффекту 3,0 дптр, а степень выраженности эффекта не зависит от стадии заболевания (Таблица 15).
Итоговый рефракционный эффект при имплантации роговичных сегментов разной высоты при кератоконусе I, II, III стадии Поперечное сечение РС в виде чечевицы приводит к более равномерному распределению сил сопротивления в передних и задних слоях стромы роговицы. Изменение кривизны задней поверхности роговицы незначительно влияет на ее рефракционные параметры, как будет показано ниже, в отличие от изменения кривизны передней поверхности. Таким образом: наиболее эргономичной формой РС можно считать модель РС с поперечным сечением в виде двояковыпуклой линзы, у которой высота части, обращенной к задней поверхности роговицы, соответствует минимальному диоптрийному эффекту и равна 0,05 мкм, и высота части, обращенной к передней поверхности роговицы, изменяется от 150 до 350 мкм (с шагом 50 мкм) и соответствует используемым в хирургической практике (Таблицы 16 - 18).
Таким образом, при значении высоты сегмента равному 0,05 и 0,1 мм диоптрийный эффект после имплантации РС менее 1,0 дптр (0,75 дптр), что является физиологической нормой колебания рефракции. Следовательно, можно считать, что при высоте РС 0,05 и 0,1 мкм достаточного рефракционного эффекта не будет или он будет настолько мал, что им можно пренебречь, а значит, наименьшей эффективной высотой РС является h=0,15 мм, что справедливо для всех трех рассмотренных стадий кератоконуса.
В параграфе 3.1.2. проведен рассчет минимально и максимально эффективной высоты задней поверхности РС с учетом строения задних слоев роговицы и их оптических характеристик, а именно того фактка, что задняя поверхность роговицы является рассеивающей линзой в системе оптически центрированных систем.
В силу того, что РС влияет на переднюю и заднюю поверхности роговицы, а так же учитывая тот факт, что коэффициент упругости роговицы уменьшается от внешних слоев стромы к внутренним, то имплантация РС с симметричными передней и задней поверхностями приводит к более сильной деформации задних слоев роговицы. Учитывая формулу геометрического соотношения Барракера (1) деформация передней и задней поверхности приводит к разным знакам оптической силы роговицы. Вопрос в том, насколько значимы деформации передних и задних поверхностей роговицы для конечного знака оптической силы роговицы.
Для роговицы, являющейся вогнуто-выпуклой линзой, преломляющая способность может быть рассчитана в модели, где оптически однородные среды с различными коэффициентами преломления n и n отделены друг от друга сферическими поверхностями. Оптически однородные отражающие или преломляющие среды, отделенные друг от друга сферическими поверхностями, центры кривизны которых расположены на одной оптической прямой, являются оптически центрированными системами, а для них характерна следующая закономерность (рисунок. 12, 13)[32].
Определение индекса пролиферации выделенных клеток стромы роговицы при двухмерном клеточном культивировании в присутствии полимерных материалов
На модели органотипического культивирования выделенных кадаверных роговиц было проведено моделирование течения раннего послеоперационного периода, исследована биосовместимость выбранного в ходе проведения двухмерного клеточного культивирования полимерного материала, а так же изучено влияние разработанного имплантированного РС на ткани роговицы.
Исследование биосовместимости и моделирование влияния имплантированных полимерных РС различных моделей на ткани роговицы проводили в два этапа: исследование влияния имплантированного РС на ткани роговицы (изменение кривизны передней и задней поверхностей, центральной зоны). Последующее определение тканевого ответа после имплантации РС и проведение органотипического культивирования в условиях нормотермии (клеточная миграции в просвете роговичного тоннеля, на поверхности РС, неоколлагеногенез).
Для определения процента живых и апоптотически поврежденных клеток в просвете роговичного тоннеля, куда был имплантирован полимерный РС, проводили флуоресцентную микроскопию поверхностей верхней и нижней стенок роговичного тоннеля и полимерного РС с окрашиванием флуоресцирующими красителями.
Группы исследования были представлены двумя экспериментальными группами и группой контроля. В экспериментальные группы Ор-1 и Ор-2 включили роговицы кадаверных глаз со сформированными роговичными тоннелями и имплантированными РС основе различных полимерных смесей ПММА/ГЭМА (содержание воды 18%) и ПММА, соответственно. К группе Ор-3 отнесли РС из полимера на основе полимерного материала, выбранного при проведении клеточного культивирования – бисГМА (материал группы Кл-4). Контрольную группу составили выделенные роговицы кадаверных глаз с выполненным роговичным тоннелем, но без имплантированных в его полость полимерных РС. Для определения наличия живых КСР на поверхности РС и роговичного тоннеля использовали окраску йодидом пропидия, имеющим длину волны возбуждения в зеленом диапазоне (=536 нм) и длину волны испускания в красном (=617 нм). Ядра живых клеток докрашивали флуоресцентным красителем бисбензимид – Hoechst 33258, с длиной волны возбуждения и испускания =345 нм и =478 нм, соответственно (рисунок 28).
Каждый препарат исследовали методом световой микроскопии и в ультрафиолетовом, световом диапазонах с использованием различных фильтров, акцентируя внимание на наличие КСР на поверхностях полимерных РС, выполненных на основе химически различающихся полимеров, верхней и нижней стенок роговичного тоннеля. Подготовку тканевых препаратов проводили по схеме, описанной в главе 3. А - Световая микроскопия после окрашивания флуоресцеиновыми красителями (йодид пропидия, Hoechst 33258), Б – Схема положения роговичного тоннеля; а – нижняя стенка роговичного тоннеля; б – интактная ткань роговицы; в – проекция роговичного разреза (контрольная группа, увеличение х20) Рисунок 28 - Поверхность проксимальной части нижней стенки роговичного тоннеля
При рассмотрении тканевых образцов группы контроля на поверхности стенок роговичного тоннеля были обнаружены единичные скопления клеток стромы роговицы (рисунок 29), в отличие от поверхности интактной части стромы, не имевшей длительного контакта с поверхностью РС в условиях нормотермического культивирования. Присутствие клеток в просвете роговичного тоннеля свидетельствует о наличие клеточной реакции на травму, производимую при формировании тоннеля, и активацию клеточных процессов регенерации. А – окраска йодид пропидием, длина волны возбуждения 536 нм, длина волны испускания – 617 нм, увеличение х40; Б – окраска Hoechst 33258, длина волны возбуждения 345 нм, длина волны испускания – 478 нм, увеличение х40 Рисунок 29 - Флуоресцентная микроскопия: наличие клеток стромы роговицы на поверхности роговичного тоннеля, группа Ор-контроль (стрелками указаны места скопления КСР, аморфного тканевого вещества на поверхности тоннеля) Исследование культивированных роговиц кадаверных глаз с имплантированными РС, выполненными из различных полимерных материалов (экспериментальные группы Ор-1, Ор-2, Ор-3), осуществляли по следующему алгоритму: световая микроскопия поверхности РС, верхней и нижней стенок роговичного тоннеля, микроскопии в ультрафиолетовом свете с использованием соответствующих светофильтров (синий при использовании красителя Hoechst 33258, зеленый в случаях йодид пропидия).
На снимках, полученных при световой микроскопии РС группы Ор-1 (ПММА/ГЭМА (содержание воды 18%)) во всех случаях отмечали адгезию клеток на поверхности РС и в просвете сквозных манипуляционных отверстий (рисунок 30 - А), что подтверждалось данными при проведении флуоресцентной микроскопии (рисунок 30 - Б).
А – световая микроскопия, увеличение х4; Б – ультрафиолетовый световой диапазон, увеличение х4 Рисунок 30 - Наличие клеток стромы роговицы на поверхности роговичного сегмента группа Ор-1 (ПММА/ГЭМА (содержание воды 18)) (красным указаны области наличия клеточной адгезии)
При использовании синего фильтра, получили ясную картину адгезии КСР к поверхности РС (рисунок 31 - А). При использовании зеленого фильтра в случаях использования красителя Hoechst 33258 было отмечено слабое свечение ядер клеток, фиксированных у поверхности РС (рисунок 31 - Б). А – окраска йодид пропидием, длина волны возбуждения 536 нм, длина волны испускания – 617 нм, увеличение х20; Б – окраска Hoechst 33258, длина волны возбуждения 345 нм, длина волны испускания – 478 нм, увеличение х20
Флуоресцентная микроскопия: наличие клеток стромы роговицы на поверхности роговичного сегмента, группа Ор-1 (ПММА/ГЭМА (содержание воды 18%)) (стрелкой указаны места адгезии КСР) При рассмотрении снимков, полученных при проведении флуоресцентной микроскопии поверхностей роговичного тоннеля, так же отмечали наличие КСР на всем его протяжении, без статистически значимой разницы с группой контроля (p 0,05) (рисунок 32).