Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1 Факторы риска развития окклюзии сосудов сетчатки 15
1.2 Особенности патогенеза окклюзии сосудов сетчатки 17
1.3 Генетические предикторы развития окклюзии сосудов сетчатки 22
1.4 Полиморфизм генов, кодирующих компоненты цикла витамина К 29
Глава 2. Материал и методы исследования 37
2.1 Характеристика пациентов 37
2.2 Описание методов исследования 43
2.3 Генетические исследование ассоциации полиморфизмов генов, кодирующих компоненты цикла витамина К (VKORC1, CYP4F2) 48
2.4 Статистическая обработка результатов исследования 50
Глава 3. Результаты собственных исследований 51
3.1 Особенности клинического течения окклюзий сосудов сетчатки и взаимосвязь по полиморфны маркерам G1639A гена витамин К эпоксидредуктазы (VKORC1) и V433M гена цитохром P-450 (CYP4F2) 51
3.2 Оценка наличия и тяжести осложнений окклюзии вен сетчатки в зависимости от различных частот генотипв и их комбинации по полиморфным маркерам генов, кодирующих компоненты цикла витамина К (VKORC1, CYP4F2) 82
3.3 Связь окклюзий сосудов сетчатки с носительством полиморфных маркеров генов, кодирующих компоненты цикла витамина К с полом и возрастом (VKORC1, CYP4F2) 89
3.4 Результаты молекулярно-генетического исследования по определению частот генотипов по полиморфным маркерам G1639A гена VKORC1 и V433M гена CYP4F2 у пациентов с окклюзиями сосудов сетчатки 97
Заключение 109
Выводы 116
Практические рекомендации 117
Список литературы 118
- Генетические предикторы развития окклюзии сосудов сетчатки
- Особенности клинического течения окклюзий сосудов сетчатки и взаимосвязь по полиморфны маркерам G1639A гена витамин К эпоксидредуктазы (VKORC1) и V433M гена цитохром P-450 (CYP4F2)
- Связь окклюзий сосудов сетчатки с носительством полиморфных маркеров генов, кодирующих компоненты цикла витамина К с полом и возрастом (VKORC1, CYP4F2)
- Результаты молекулярно-генетического исследования по определению частот генотипов по полиморфным маркерам G1639A гена VKORC1 и V433M гена CYP4F2 у пациентов с окклюзиями сосудов сетчатки
Введение к работе
Актуальность темы.
Окклюзия сосудов сетчатки (ОСС) относится к актуальным
проблемам медицины в связи с широкой распространенностью
среди населения разных возрастных групп, в том числе молодой
трудоспособной, а также развитием серьезных осложнений вплоть
до слепоты (Chang Y.S., 2015, Lindsell L.B., 2015). Спектр глазных
осложнений ОСС изучен подробно, также как методы их лечения и
меры профилактики. В то же время варианты поражения глаз,
ассоциированные с наследственной предрасположенностью,
изучены в меньшей степени. При этом ОСС, сочетающаяся с
тромбофилиями, может быть как причиной, так и следствием
окклюзионных поражений сетчатки (Тульцева С.Н., Астахов
Ю.С.,2010, Mclntosh R. L., 2010). По современным представлениям,
одним из возможных сопрягающих ОСС и коагуляционных
механизмов тромбозных повреждений являются генетические
поломки в системе гемостаза. В конце XX века были проведены
генетические исследования и выявлена взаимосвязь между
полиморфизмом генов определенных факторов системы гемостаза
и развитием венозных окклюзий сосудов сетчатки, например,
дефекты системы протеина C (A506G), полиморфизм G1691A гена
фактора V, полиморфизм C677T, A1298C гена метилен
тетрагидрофолатредуктазы (MTHFR), полиморфизм G20210A гена
протромбина, полиморфизм 4G-6755G гена тканевого активатора
плазминогена (t-PA) (Козлова Т.В., 2006, Тульцева С.Н., 2008,
Johnson TM., 2001, Trullo M., 2010, Mrad M., 2014). Однако, мало
изучена роль полиморфизмов генов, кодирующих компоненты
цикла витамина К, последний является кофактором факторов
свертывания крови II, VII, IX и X, а также протеина C и S
антикоагулянтной системы, участвующего в активации
протромбиназного комплекса (Oldenburg J., 2006, Ortak H., 2012). Следует отметить, что наиболее полиморфны именно гены VKORC1, CYP4F2. По данным литературы, полиморфизм гена витамина К эпоксидредуктаза субъединица 1 - возможный новый фактор риска в патогенезе развития ретинальных венозных окклюзий (РВО) (Karia N., 2010), однако данных о роли полиморфизмов генов, кодирующих компоненты цикла витамина К в развитии артериальных окклюзий сосудов сетчатки, нет.
Степень разработанности проблемы
Анализ литературы показал, что несмотря на многие
исследования, направленные на изучение окклюзии сосудов
сетчатки, не существует единого мнения по поводу этиологии,
патогенеза, нет единых схем лечения, способов профилактики и
прогноза данной патологии (Тульцева С.Н., Астахов Ю.С., 2010).
Нет работ, посвященных изучению клинического течения окклюзий
сосудов сетчатки и частотного распределения полиморфизмов
генов, кодирующих компоненты цикла витамина K (VKORC1,
CYP4F2) при окклюзии сосудов сетчатки с помощью молекулярно-
генетических методов. Учитывая клиническую и социальную
значимость данной патологии, необходимо выявление
диагностических критериев для ранней диагностики, прогноза течения ОСС, которые будут опираться не только на офтальмологические данные, но и подтверждаться генетическими показателями для эффективной профилактики, прогноза окклюзии сосудов сетчатки и персонализированного подхода лечения для каждого пациента.
В связи с этим, целью настоящего исследования является повышение эффективности диагностики и прогноза клинического течения окклюзий сосудов сетчатки.
Задачи исследования:
-
Изучить особенности клинического течения артериальных и венозных окклюзий сосудов сетчатки в зависимости от различных вариантов полиморфизмов генов, кодирующих компоненты цикла витамина К и их комбинаций.
-
Оценить наличие и тяжесть осложнений окклюзии вен сетчатки в зависимости от различных комбинаций генотипов полиморфных маркеров генов, кодирующих компоненты цикла витамина К.
-
Установить распределения частот генотипов по полиморфным маркерам генов цикла витамина К (VKORC1, CYP4F2) и выявить наиболее значимые комбинации данных генотипов у пациентов с окклюзией сосудов сетчатки.
4. Определить роль данных генетических предикторов
системы гемостаза в развитии и прогнозировании окклюзий сосудов сетчатки по полиморфным маркерам генов, кодирующих компоненты цикла витамина К (VKORC1, CYP4F2).
Научная новизна
-
Определены особенности клинического течения венозной окклюзии сосудов сетчатки в зависимости от результатов генетических предикторов G1639A гена VKORC1, V433M гена CYP4F2, кодирующих компоненты цикла витамина К.
-
Доказано, что при распределении частот генотипов по полиморфному маркеру G1639A гена VKORC1 у пациентов с венозной окклюзией сосудов сетчатки наибольшей значимостью обладает генотип GG данного полиморфного маркера. Доказан вклад выявленного полиморфизма в развитие венозных окклюзий сосудов сетчатки.
Теоретическая и практическая значимость работы
Теоретическая значимость работы обоснована тем, что в ходе
исследования выявлен один из механизмов формирования ОСС,
выражающийся в генетических нарушениях системы гемостаза,
кодирующих компоненты цикла витамина К. Отражением этого
является ассоциация полиморфных генов VKORC1, CYP4F2 в
развитии ОСС у больных с окклюзией центральной вены сетчатки
(ЦВС), окклюзией ветвей ЦВС по сравнению с контрольной
группой, не имеющих сосудистой патологии сетчатки.
Практическая значимость результатов диссертационной работы заключается в том, что установлены генетические предикторы, позволяющие прогнозировать высокий риск формирования окклюзий сосудов сетчатки, выявлять данную патологию на раннем этапе развития, прогнозировать особенности клинического течения патологического состояния и в соответствии с этим определять тактику ведения пациентов, а также в дальнейшем будет способствовать разработке персонализированного подхода к лечению пациентов с данной патологией на основе генетического тестирования.
Методология и методы исследования. Работа выполнена в дизайне когортного исследования с использованием клинических, инструментальных, генетических и статистических методов.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Доказано, что при венозных окклюзиях сосудов сетчатки, ассоциированных с генотипом GG по полиморфному маркеру G1639A гена VKORC1 и генотипом CC по полиморфному маркеру V433M гена CYP4F2, клиническое течение более тяжелое, проявляющееся в большем количестве ишемических форм и увеличением количества осложнений (ишемия макулярной области, макулярный отек) с последующим формированием посттромботической макулопатии.
-
Установлено, при венозных окклюзиях сосудов сетчатки генотип GG по полиморфному маркеру G1639A гена VKORC1, прогнозирует развитие данной патологии. Между особенностью клинического течения и этим показателем существует взаимосвязь, что подтверждает значимость данного полиморфного маркера как критерия ранней диагностики.
Степень достоверности полученных результатов
Степень достоверности результатов диссертационного
исследования оценивалась критериями доказательной медицины с достаточным учетом проведенных исследований и с помощью статистических методов непараметрической статистики (точный двухсторонний критерий Фишера, Хи-квадрат Пирсона), расчет проводился при помощи программы Instat в соответствии с поставленной целью и задачами.
Апробация работы
Апробация диссертации состоялась на расширенном
заседании кафедры офтальмологии ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на XXII международном офтальмологическом конгрессе «Белые ночи» с докладом «Биохимические и генетические предикторы течения и прогноза сосудистых заболеваний глаза», на заседании кафедры офтальмологии ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России и сотрудников Филиала №1 ДЗМ ГБУЗ им. С.П. Боткина Департамента здравоохранения г. Москвы.
Внедрение результатов работы в практику
Результаты диссертационной работы внедрены в клиническую практику офтальмологической клиники в филиале №1 ДЗМ ГБУЗ им. С. П. Боткина. Результаты научных исследований включены в
соответствующие разделы профессиональной образовательной программы ординатуры по специальности «Офтальмология», в учебные планы циклов повышения квалификации врачей-офтальмологов кафедры офтальмологии ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава РФ.
Публикации
По теме диссертационной работы опубликовано 4 печатных работы, из них 3 в научных рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования РФ.
Личный вклад автора
Автор принимал непосредственное участие в выполнении
всех этапов научной работы, в формулировании цели и задач, в
дизайне исследования, в формировании базы данных пациентов.
Автором лично производился сбор материала (набор пациентов -
136 человек, разделение пациентов на III группы,
офтальмологические исследования, забор крови для генетического тестирования). Автор лично писал и готовил материалы для публикации по теме диссертационной работы, а также выполнил статистическую обработку результатов диссертационной работы и оформление диссертационной работы.
Соответствие диссертации Паспорту научной специальности
Диссертация соответствует формуле специальности 14.01.07 -«Глазные болезни» медицинские науки и областям исследования: №1«Разработка новых и усовершенствование известных методов обследования органа зрения и его придатков, методов диагностики различных заболеваний» и пункту №2 «Разработка методов профилактики заболеваний глаза и его придатков».
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 35 таблицами, 23 рисунками и 11 диаграммами. Список литературы содержит 161 источников (33 -отечественных, 128 - зарубежных).
Генетические предикторы развития окклюзии сосудов сетчатки
Тромбофилии – состояния, характеризующиеся склонностью к развитию рецидивирующих тромбозов кровеносных сосудов (преимуществено венозных) различной локализации вследствие нарушений состава и свойства крови [6].
Все тромбофилии подразделяются на две большие группы по происхождению:
1. Гемореологические – связанные преимущественно с изменениями реологических свойств и клеточного состава крови.
2. Гематогенные - обусловленные первичными нарушениями в системе гемостаза.
В настоящее время нарушения в системе гемостаза подразделяют на 3 группы: тромбоцитарную, плазмо-коагуляционную и сосудистую.
Тромбоцитарная и сосудистая тромбофилия: причиной образования тромба является нарушение целостности эндотелия, выстилающего сосуд изнутри, а также компрессия сосудов и спазм [2]. Все вышеуказанное приводит к нарушению равновесия между свертывающей и противосвертывающей системами гемостаза, что в конечном итоге приводит к тромбозу [20, 21].
Эндотелий обладает двойным действием: с одной стороны, оказывает антитромботическое действие, а с другой стороны участвует в образовании тромба. Нарушение целостности эндотелия является пусковым фактором в процессе тромбообразования, например, при метаболических расстройствах, антителами и иммунными комплексами, медиаторами воспаления, такими как цитокины, фактор некроза опухоли [11, 140]. Эти факторы приводят к гибели эндотелиальных клеток, что в свою очередь приводит к фиксации и агрегации тромбоцитов на субэндотелии, который содержит коллаген, и тем самым образуется уже первичный тромбоцитарный (белый) тромб. После чего происходит активация плазменных факторов свертывания крови, способствующих образованию коагуляционного (красного) тромба. В то же время имеет значение снижение активности антисвертывающей системы и фибринолиз [23, 28, 102].
В процессе гемостаза тромбоциты активно взаимодействуют с другими факторами свертывания с помощью своих рецепторов. Эти рецепторы расположены на поверхности тромбоцитов и представляют по своему биохимическому составу гликопротеины. При исследованиях Salomon O., Moissiev J., Farnetti E., полностью расшифрована аминокислотная последовательность полипептидных рецепторов тромбоцитов, в том числе и GpIb, GpIa, GpIIIa. Изучены их кодирующие гены. Обнаружена связь полиморфизма генов перечисленных рецепторов с риском развития тромбоэмболических заболеваний. Полиморфизм 434(С/T) гена GpIb и 1565(T/C) гена GpIIIa связан с гиперагрегацией тромбоцитов, и является маркером развития ишемических форм тромбоза ретинальных вен [19, 22, 26].
Основными адгезивными белками считаются коллаген, фактор Вилебранда, тромбоспондин, фибронектин. А в агрегации тромбоцитов ведущими являются тромбин, фибриноген, которые индуцируются на поверхности активированного эндотелия и на поверхности тромбоцитов.
Гомоцистеин повышает агрегационную и адгезивную способнность тромбоцитов, нарушает функцирование тканевого активатора плазминогена, приводит к инактивации естественных антикоагулянтов, таких как антитромбин III и протеин C, S и Z, тем самым способствуя активации тромбина и некоторых факторов свертывающей системы (V, X, XII, XIII) [10, 18].
Плазмо - коагуляционная тромбофилия: данная тромбофилия связана с недостатком или отсутствием антисвертывающей системы гемостаза. На сегодняшний день большой интерес вызывают исследования плазмо-коагуляционного звена системы гемостаза [24, 25]
В конце XX века генетические исследования системы гемостаза позволили выявить взаимосвязь между развитием трмбофилии и полиморфизмом генов определенных факторов системы гемостаза. Например, антитромбин – III, дефекты системы протеина C (A506G), полиморфизм C677T, A1298C, гена метилентетрагидрофолат редуктазы (MTHFR), полиморфизм G20210A гена протромбина и 4G-6755G гена тканевого активатора плазминогена (t-PA) благодаря исследованиям Козлова Т.В., Тульцева С.Н., Johnson TM., Trullo M., Mrad M. [34, 143]. Антитромбин – III (АТ): является естественным антикоагулянтом. Дефицит АТ (III) встречается как при артериальных, так и при венозных тромбозах. Уменьшение АТ - III на 25% приводит к рикошетному тромбозу [27].
Протеин C – сериновая протеаза, зависимая от витамина K. Вырабатывается в печени, в крови, а в организме находится в неактивной форме. Протеин C активируется тромбином, тромбомодулином, фактором Xa и протеином S. Этот дефект ассоцируется с недостаточностью фактора V [9].
Генетический дефект, лежащий в основе резистентности протеина C, обусловлен нуклеотидным полиморфизмом гена, кодирующего фактор V системы свертывания крови. Замена аргинина глутамином в положении 506 (так называемая мутация фактора V Лейдена) приводит к тому, что фактор V становится резистентным к протеину C, сохраняя свои коагуляционные свойства, способствуя повышению синтеза тромбина. Этой патологии характерно гетерозиготное носительство
Греческие исследователи Yioti G., Panagiotou O., исследовали 48 пациентов с РВО, которым было сделано генотипирование по полиморфизмам H1299R гена фактора V, G455A гена - фибриногена, 4G/5G гена PAI-I, G20210A гена протромбина, I/D гена ACE, Val34Leu гена фактора XIII, A1298C и C677T гена MTHFR [155].
По данным авторов полиморфизмы I/D гена ACE (OR, 2.08[95%CI, 1.12-3.85], p=0.02), Val34Leu гена фактора XIII (OR=0.41[95%CI, 0.18-0.95], p=0.037), и C677T гена MTHFR (OR=2.20 [95%CI 1.10-4.40], p=0.026) имеют связь с развитием РВО. Теми же авторами был проведен мета-анализ между развитием РВО и полиморфизмами 4G/5G гена PAI-I, G20210A гена протромбина, H1299R гена фактора V. Согласно обработке, данных мета - анализа, авторы выявили связь между развитием РВО и полиморфизмами 4G/5G гена PAI-I, H1299R гена фактораV (OR=1.27[95% CI, 1.02-1.60, p=0.036], OR=1.40[95%, 1.07 - 1.84, p=0.015]) [12].
По данным исследования, Schockman S., Glueck C., полиморфизмы H1299R гена фактора V и G20210A гена протромбина имеют роль в развитии ОСС. А именно при гетерозиготном носительстве данных полиморфных маркеров [130].
Однако нужно отметить, что в исследованиях по выявлению связи между лейденской мутацией и ЦВС такой зависимости не обнаружено. M. Mrad и соавт. исследовали лейденскую мутацию и полиморфизм G20210A гена, кодирующего протромбин [85, 105]. Согласно этим данным, значимых различий не было обнаружено в частоте генотипов полиморфизма G20210A гена, кодирующего протромбин. Частота генотипов GG по полиморфному маркеру G20210A кодирующего протромбин и G1691A, кодирующего фактор V, у пациентов с РВО было достоверно выше, чем в контрольной группе, что указывает связь между этими полиморфизмами и развитием РВО.
Проведенные исследования показали, что гипергомоцистеинемия (ГГЦ) способствует возникновениию тромбозов (как артериальных, так и венозных). В возникновении ГГЦ участвует генетический дефект, при котором свойственно гетерозиготное носительство и наблюдается у 60% представителей европеоидной расы, а гомозиготное носительство у 15% населения [31].
Гомоцистеин – небелковая сульфгидрильная аминокислота, промежуточный продукт метаболизма аминокислот метионина и цистеина. Во внутриклеточном метаболизме метионина участвует фермент 5,10- метилентетрафолатредуктаза. Процесс транссульфирования гомоцистеина с помощью цистатионсинтетазы и витамина B6 приводит к синтезированию цистеина.
В развитии ГГЦ большую роль имеет генетический дефект. Наиболее изучена мутация, приводящая к развитию ГГЦ – замена C/T в положении 677 в гене MTHFR, которая приводит к образованию термоустойчивой формы метилентетрафолатредуктазы [29]. Вследствие нарушения превращения гомоцистеина в метионин и цистеин в плазме крови увеличивается уровень гомоцистеина. Если гомоцистеин не выводится из организма, тогда начинает накапливаться в межклеточном пространстве, а затем появляется в кровотоке.
Особенности клинического течения окклюзий сосудов сетчатки и взаимосвязь по полиморфны маркерам G1639A гена витамин К эпоксидредуктазы (VKORC1) и V433M гена цитохром P-450 (CYP4F2)
Обследование пациентов проводилось в клинической базе ФГБОУ ДПО РМАНПО Минздрава России в ГБУЗ "Городская клиническая больница им. С.П. Боткина ДЗМ" Филиал №1.
В соответствии с целью и задачами были выделены следующие этапы исследования. Основной раздел состоял из двух частей. В первой части диссертационной работы исследовалась оценка клинического течения и наличия осложнений венозных окклюзий сосудов сетчатки в зависимости от носительства генотипов, а второй раздел посвящен анализу полиморфизмов генов, кодирующих компоненты цикла витамина К (VKORC1, CYP4F2) у пациентов с артериальной и венозной окклюзией сосудов сетчатки.
При анализе результатов по полиморфному маркеру G1639A гена VKORC1 было установлено, что среди пациентов с ВОСС 26 пациентов имели генотип GG (42,6%), 29 пациентов - GA (47,5%), 6 пациентов - AA (9,8%). Среди пациентов с АОСС 14 имели генотип GG (56%), 8 пациентов - GA (32%), 3 пациента - AA (12%). А при анализе результатов по полиморфному маркеру V433M гена CYP4F2 было установлено, что среди пациентов с ВОСС у 37 - генотип CC (60,65%), у 22 пациентов – CT (36,06%), у 2 пациентов – TT (3,27%). Среди пациентов с АОСС 13 имели генотип CC (52%), 9 пациентов - CT (36%), 3 пациента – TT (12%).
Возраст пациентов составлял от 25 до 90 лет, в среднем 65,8±5,14 лет. Группы сопоставимы по полу и возрасту. Распределение пациентов в зависимости от возраста (согласно данными ВОЗ, 2016г.) было следующим образом (таблица №5).
Сроки обращения пациентов в стационар варьировали от 1 дня до 6 месяцев. Пациенты находились под наблюдением от 1 до 24 месяцев.
Давность тромбоза варьировала от 1 дня до 7 дней у 23 (37,7%) пациентов, от 8 дней до 3 месяцев у 12 (19,6%) пациентов, с 3 месяцев до 6 месяца у 9 (14,7%) пациентов и от 6 месяца и более у 14 (22,9%) пациентов (таблица №6).
Распределение пациентов с венозной окклюзией сосудов сетчатки по локализации проводилось согласно классификации Hayreh S.S. (1990г.) и было следующим образом: пациенты с окклюзием основного ствола ЦВС, пациенты с окклюзией ветвей ЦВС, ишемический и неишемический тип (таблица №7).
В I группе с ВОСС 40 пациентам (65,57%), была проведена флюоресцентная ангиография (ФАГ). При ишемическом типе ВОСС отмечаются обширные области неперфузируемых капилляров, прокрашивание стенок сосудов и экранирование фоновой флюоресценции кровоизлияниями. ФАГ при неишемическом типе – отмечается замедленное заполнение вен, сохраненая перфузия капилляров и диффузное просачивание красителя в поздних фазах (рисунок 2).
При обнаружении зон отсутствия капиллярной перфузии по данным ФАГ более 10 диаметров ДЗН для окклюзии ЦВС классифицировался как ишемический тип, а для окклюзии ветви ЦВС более 5 диаметров ДЗН - ишемический тип.
Пациенты с острым нарушением кровообращения центральной вены сетчатки и ее ветвей получали медикаментозное лечение. В остром периоде получали антикоагулянтные препараты – Сулодексид внутримышечные инъекции по 600 ЛЕ (липопротеинлипазная единица) в день в течение 15-20 суток. Затем переходили на таблетированную форму препарата по 250 ЛЕ дважды в день с продолжительностью в 1 месяц и фибринолитические препараты - Проурокиназа парабульбарно 5000 МЕ (0,5 мл) (таблица №10).
Если по результатам ФАГ определяли ишемические зоны, то пациентам с окклюзией ветвей ЦВС выполняли секторальную ЛК, а при окклюзии основного ствола ЦВС - панретинальную. При налиичии макулярного отека проводилось интравитреальное введение ингибитора ангиогенеза (Ранибизумаб - регистрационный номер: ЛСР-004567).
Взаимосвязь клинического течения венозной окклюзии сосудов сетчатки с различными вариантами генотипов и их комбинации по полиморфным маркерам G1639A гена VKORC1 и V433M гена CYP4F2, кодирующих компоненты цикла витамина К
У пациентов с венозной, артериальной окклюзией сосудов сетчатки острота зрения разделялась ниже 0,1, от 0,1 до 0,5, 0,5 и выше и распределялась в зависимости от генотипов и их комбинаций по полиморфным маркерам G1639A гена VKORC1 и V433M гена CYP4F2 (таблица №11).
Данная таблица демонстрирует, что острота зрения ниже 0,1 преобладала у пациентов с генотипами GG, GA, CC, CT, и с комбинациями генотипов GG/CC, GA/CT, GA/CC, GG/CT.
Локализация венозной окклюзии в зависимости от распределения частот генотипов по полиморфным маркерам G1639A гена VKORC1 и V433M гена CYP4F2 представлены в таблице №12.
В зависимости от локализации ВОСС распределение частот генотипов было следующим: по полиморфному маркеру G1639A гена VKORC1 у 35 (57,3%) пациентов была окклюзия ЦВС, из них у 16 (26,22%) наблюдался GG генотип, у 17 (27,8%) человек -GA генотип, у 2 (3,27%) – AA генотип. У 26 (42,6%) пациентов была окклюзия основной ветви ЦВС, из них у 10 (16,3%) выявлена GG генотип, у 12 (19,6%) – GA генотип, у 4 (6,55%) – AA генотип.
В группе с ВОСС по полиморфному маркеру V433M гена CYP4F2 у 35 (57,3%) пациентов была окклюзия ЦВС, из них у 21 (34,4%) наблюдался CC генотип, у 13 (21,3%) человек - CT генотип, у 1 (1,63%) – TT генотип. У 26 (42,6%) пациентов была окклюзия основной ветви ЦВС, из них у 18 (29,5%) выявлен CC генотип, у 7 (11,4%) – CT генотип, у 1 (1,63%) – TT генотип.
У пациентов с ВОСС в зависимости от локализации окклюзии при сравнении распределения генотипов по полиморфному маркеру G1639A гена VKORC1 не выявлено статистически значимых различий между окклюзией основного ствола ЦВС и окклюзией ветвей ЦВС, p=0,6. Аналогичные данные были получены при распределении генотипов по полиморфному маркеру V433M гена CYP4F2 у пациентов с ВОСС (p=0,7). Однако, в зависимости от локализации у пациентов с венозной окклюзией при сравнении распределения комбинации генотипов выявлена статистически значимые различие между комбинациями GG/CC по сравнению с GG/CT с развитием тромбоза ветви основного ствола (p=0,0078). Также выявлена статистически значимые различие в развитии тромбоза ветви основного ствола при комбинации GA/CT по сравнению с GG/CT и наблюдается статистически значимое тенденция развития венозной окклюзии ветви ЦВС при комбинации GA/CC по сравнению с GG/CT (p=0,0186, p=0,057, соответственно). Нужно отметить, что у пациентов с венозной окклюзией сосудов сетчатки ни у кого не выявлена AA/TT комбинация. Исходя из этого пациенты с ВОСС имеют зависимость от локализации окклюзии при распределении комбинации генотипов по полиморфным маркерам G1639A гена VKORC1 и V433M гена CYP4F2.
В зависимости от типа окклюзии распределение частот генотипов по полиморфным маркерам G1639A гена VKORC1 и V433M гена CYP4F2 представлены в таблице №13.
При сравнении типа венозной окклюзии с распределением частот генотипов у пациентов выявлено, что генотип GG по сравнению с генотипами GA+AA статистически значимо чаще выявляется у пациентов с ишемическим типом окклюзий ЦВС по сравнению с неишемическим p=0,021, RR=1,46, 95% CI=1,077-1,984.
Статистически значимых различий встречаемости генотипа GG по сравнению с генотипами GA+AA у пациентов с окклюзией ветвей ЦВС, имеющих как ишемический, так и неишемический тип, получено не было, p=0,564.
Также в группе с ишемическим типом окклюзий ЦВС по сравнению c ишемическим типом окклюзий ветвей ЦВС, при распределении частот генотипов обнаружена тенденция к тому, что генотип GG по сравнению с генотипом GA+AA встречался чаще у пациентов с ишемическим типом окклюзий ЦВС по сравнению с ишемическим типом окклюзий ветвей ЦВС, p=0,0796, 95% CI.0,9689-2,396.
У пациентов с ишемическом типом и неишемическом типом основного ствола ЦВС и ее ветвей по полиморфному маркеру V433M гена CYP4F2 не выявлено статистически значимых различий при распределении частот генотипа CC по сравнению с генотипом CT+TT, p 0,05.
Нужно отметить что не было выявлено статистически значимых различий между комбинациями генотипов по полиморфным маркерам G1639A гена VKORC1, V433M гена CYP4F2 и типом тромбоза.
Связь окклюзий сосудов сетчатки с носительством полиморфных маркеров генов, кодирующих компоненты цикла витамина К с полом и возрастом (VKORC1, CYP4F2)
В группе с венозной окклюзией сосудов сетчатки распределение генотипов по полиморфному маркеру G1639A гена VKORC1 среди женщин составили: GG генотип – 12 (19,6%), GA – 15 (24,5%), AA генотип у 5 (8,19%). Среди мужчин в группе с ВОСС у 28 (45,9%) наблюдался GG+GA генотипы и у 1 (1,63%) - AA генотип. А среди женщин в группе с ВОСС распределение генотипов по полиморфному маркеру V433M гена CYP4F2 составило: CC генотип - 23 (37,7%), CT – 9 (14,7%), TT генотип не было выявлено. Среди мужчин в группе с ВОСС у 27 (44,2%) наблюдался CC+CT генотипы и у 2 (3,27%) - TT генотип (таблица №22).
В группе с АОСС среди женщин распределение генотипов составили: GG генотип -5 (20%), GA – 2 (8%), AA - генотип не выявлен ни у кого. Среди мужчин у 4 (16%) наблюдался GG генотип, у 3 (12%) - GA генотип и у 1(4%) - AA генотип.
У пациентов в группе с АОСС среди женщин распределение генотипов по полиморфному маркеру V433M гена CYP4F2 составило: CC генотип – 6 (24%), CT – 7 (28%), TT генотип не выявлен ни у кого. Среди мужчин у 7 (28%) наблюдался CC генотип, у 2 (8%) CT генотип и у 3 (12%) TT генотип (таблица №23).
Среди женщин в контрольной группе распределение генотипов составило: GG генотип - 8 (16%), GA – 11 (22%), AA – 8 (16%). Среди мужчин у 8 (16%) наблюдался GG генотип, у 9 (18%) - GA генотип и у 6 (12%) - AA генотип. А среди женщин распределение по полиморфному маркеру V433M гена CYP4F2 составило: генотип CC -14 (28%), CT – 10 (20%), TT – 3 (6%). Среди мужчин CC - 14 (28%), CT – 9 (18%), TT генотип не выявлен ни у кого среди мужчин (таблица № 24).
У пациентов с ВОСС и АОСС среди мужчин и женщин при сравнении распределения генотипов по полиморфному маркеру G1639A гена VKORC1 не выявлено статистически значимых различий в частотах генотипов, p=0,7. Аналогичные данные были получены у пациентов с ВОСС и АОСС среди мужчин и женщин по сравнению с контрольной группой при сравнении распределения генотипов по полиморфному маркеру G1639A гена VKORC1, p=0,851.
У пациентов с ВОСС среди мужчин и женщин при сравнении распределения генотипов по полиморфному маркеру V433M гена CYP4F2 не выявлено статистически значимых различий в частотах генотипов, p=0,1. Исходя из вышесказанного пациенты с ВОСС и АОСС по сравнению с участниками контрольной группы, не имеют зависимости от пола при распределении частот генотипов по полиморфному маркеру G1639A гена VKORC1.
Однако, несмотря на то, что у пациентов с ВОСС не обнаружено статистически значимых различий, у пациентов с АОСС выявлена тенденция в зависимости от пола при наличии CC генотипа по полиморфному маркеру V433M гена CYP4F2. У женщин риск развития окклюзии артерий сетчатки выше, чем у мужчин с имеющимся CC генотипом по полиморфному маркеру V433M гена CYP4F2, p=0,05.
Распределение пациентов на возрастные группы с венозной, артериальной окклюзией сосудов сетчатки по сравнению с контрольной группой в зависимости от генотипов по полиморфным маркерам G1639A гена VKORC1 и V433M гена CYP4F2 представлено в таблице №25.
Однако, не было найдено статистически значимых различий в возрастных группах с окклюзиями ЦАС и ее ветвей, ЦВС и ее ветвей и в контрольной группе (p 0,05). Нужно отметить, что в избранных нами группах пациенты были идентичны по возрасту и полу.
Таким образом, окклюзии сосудов сетчатки не зависят от возраста и могут манифестировать в любом возрасте, а не только в пожилом возрасте. Не обнаружена ассоциация с полом у пациентов с венозной, артериальной окклюзией сосудов сетчатки по сравнению с лицами без патологии сосудов сетчатки по полиморфному маркеру G1639A гена VKORC1 (p=0,851). У больных с артериальной окклюзией сосудов сетчатки обнаружена тенденция в зависимости от пола при сравнении распределения генотипов по полиморфному маркеру V433M гена CYP4F2 (p=0,05). И не выявлена связь с развитием венозной окклюзии в зависимости от пола по полиморфному маркеру V433M гена CYP4F2 (p=0,1).
Результаты молекулярно-генетического исследования по определению частот генотипов по полиморфным маркерам G1639A гена VKORC1 и V433M гена CYP4F2 у пациентов с окклюзиями сосудов сетчатки
В исследуемых нами группах распределение частот генотипов и аллелей по полиморфному маркеру G1639A гена витамин К эпоксидредуктазы (VKORC1) и V433M гена цитохром P450 (CYP4F2), соответствовало закону Харди – Вайнберга. Согласно этому закону нет ошибок в выборке, нет ошибок генотипирования или других факторов, нарушающих проведению генотипирования или анализу корреляции.
При анализе результатов по полиморфному маркеру G1639A гена VKORC1 было установлено, что среди пациентов с ВОСС 26 пациентов имели генотип GG (42,6%), 29 пациентов - GA (47,5%), 6 пациентов - AA (9,8%). В контрольной группе 16 человек имели генотип GG (32%), 20 человек - GA (40%), 14 человек - AA (28%) (Таблица №26, диаграмма №6).
При анализе результатов по полиморфному маркеру G1639A гена VKORC1 установлено, что среди пациентов с ВОСС частота носительства аллельного варианта G составляет 84 (0,69%), а аллель A - 38 (0,31%). В контрольной группе частота носительства аллельного варианта G составляет 52 (0,52%), а аллель A - 48 (0,48%) (Таблица №27).
Среди пациентов с АОСС 14 пациентов имели генотип GG (56%), 8 пациентов - GA (32%), 3 пациента - AA (12%). Распределение частот генотипов во всех группах соответствует закону Харди - Вайнберга (p 0,05) (таблица №28, диаграмма №7).
При анализе результатов по полиморфному маркеру G1639A гена VKORC1 частота носительства аллельного варианта G - 33 (0,66%), а аллель A - 17 (0,34%) среди пациентов с АОСС (Таблица №28).
При сравнении распределения генотипов по полиморфному маркеру G1639A гена VKORC1 у пациентов с ВОСС и АОСС с группой контроля оказалось, что генотип GG встречался статистически значимо чаще у пациентов с ВОСС по сравнению с лицами без патологии сосудов сетчатки, 42,6% vs 32%, р=0,0449 (рисунок 22).
Обнаружена тенденция к большей частоте генотипа GG у пациентов с АОСС по сравнению с лицами без патологии сосудов сетчатки, 56% vs 32%, р=0,07. Различий в частотах генотипов у пациентов с ВОСС и АОСС не выявлено, р=0,415.
Среди пациентов с ВОСС 6 пациентов имели генотип AA (9,8%) и 55 пациентов имели другие генотипы (не-АА) (90,2%): 26 пациентов - GG, 29 пациентов - GA. Среди пациентов с АОСС 3 пациента имели генотип AA (12%) и 22 пациента имели другие генотипы (не-АА) (88%): 14 пациентов - GG, 8 пациентов - GA. Распределение частот генотипов во всех группах соответствует закону Харди - Вайнберга (p 0,05) (таблица №29, диаграмма № 8).
Оказалось, что генотип АА по полиморфному маркеру G1639A гена VKORC1 статистически значимо реже встречался у пациентов с венозными ОСС по сравнению с лицами без сосудистой патологии сетчатки (9,8% vs 28%, р=0,0238, RR 2,015, ID95% 1,011 -4,16). Обнаружена тенденция к более низкой частоте генотипа АА у пациентов с артериальными ОСС по сравнению с группой контроля (12% vs 28%, р=0,150). Не обнаружено статистически значимых различий в частотах генотипа АА у пациентов с венозными и артериальными ОСС, 9,8% vs 12%, р=0,715.
При анализе результатов по полиморфному маркеру V433M гена CYP4F2 было установлено, что среди пациентов с ВОСС 37 пациентов имели генотип CC (60,65%), 22 пациента – CT (36,06%), 2 пациента – TT (3,27%). В контрольной группе 28 человек имели генотип CC (56%), 19 человек – CT (38%), 3 человека - TT (6%) (таблица №30, диаграмма №9).
При анализе результатов по полиморфному маркеру V433M гена CYP4F2 было установлено, что среди пациентов с ВОСС частота носительства аллельного варианта C составляет - 96 (0,79%), а аллель T - 26 (0,21%). В контрольной группе частота носительства аллельного варианта C составляет - 75 (0,75%), а аллель T - 25 (0,25%) (Таблица №31).
При анализе результатов по полиморфному маркеру V433M гена CYP4F2 частота носительства аллельного варианта C составляет - 35 (0,70%), а аллель T - 15 (0,30%) среди пациентов с АОСС (Таблица №33).
При сравнении распределения генотипов по полиморфному маркеру V433M гена CYP4F2 у пациентов с ВОСС и АОСС с группой контроля оказалось, что генотип СС встречался статистически не значимо у пациентов с ВОСС по сравнению с лицами без патологии сосудов сетчатки, 60,65% vs 56%, p=0,6 (рисунок 23).
Не обнаружено статистически значимого различия в частоте генотипа CC у пациентов с АОСС по сравнению с лицами без патологии сосудов сетчатки, 52% vs 56%, p=0,5. Различий в частотах генотипов у пациентов с ВОСС и АОСС не выявлено, р = 0,2.
Среди пациентов с ВОСС 2 пациента имели генотип TT (3,27%) и 59 пациентов имели другие генотипы (не - TT) (97,25%): 37 пациентов – CC, 22 пациентов – CT. Среди пациентов с АОСС 3 пациента имели генотип TT (12%) и 22 пациента имели другие генотипы (не - TT) (88%): 13 пациентов – CC, 9 пациентов – CT. Распределение частот генотипов во всех группах пациентов соответствует закону Харди - Вайнберга (p 0,05) (таблица №34, диаграмма №11).
Оказалось, что генотип TT по полиморфному маркеру V433M гена CYP4F2 статистически не значимо встречался у пациентов с венозными ОСС по сравнению с лицами без сосудистой патологии сетчатки (3,27% vs 6%, p=0,6, RR 0,7, ID95% 0,24-2,13). Не обнаружено статистически значимых различий в частотах генотипа TT у пациентов с артериальными ОСС по сравнению с группой контроля (12% vs 6%, p= 0,3). Обнаружена тенденция к более низкой частоте генотипа TT у пациентов с венозными и артериальными ОСС, 60,65% vs 56%, p=0,1.
Комбинация генотипов полиморфных маркеров G1639A гена VKORC1, V433M гена CYP4F2 распределилась следующим образом (таблица №35).
Больше всего выявлялись GG/CC, GA/CC и GA/CT комбинации генотипов, это доказывает, что гомозиготные мутации приводят к развитию ВОСС.
Таким образом, генотип GG по полиморфному маркеру G1639A гена VKORC1 ассоциирован с развитием ВОСС, обладает большим тромбогенным потенциалом плазмы крови и является генетическим фактором риска развития ВОСС. Но данный генотип не ассоцирован с развитием АОСС, что может быть связано с небольшим количеством наблюдений. При этом есть основания полагать, что различия в частотах генотипов по сравнению с контрольной группой будут статистически значимы при увеличении количества пациентов в группе с АОСС.