Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1 Роль воспаления в развитии пролиферативной витреоретинопатии.. 14
1.1.1 Факторы риска развития пролиферативной витреоретинопатии 14
1.1.2 Патофизиология заболевания 17
1.1.3 Факторы роста и цитокины в развитии пролиферативной витреоретинопатии 18
1.1.4 Клетки, участвующие в формировании мембран при ПВР
1.1.4.1 Клетки пигментного эпителия сетчатки 22
1.1.4.2 Макрофаги 24
1.1.4.3 Мюллеровы клетки 26
1.1.4.4 Фибробласты 27
1.2 Роль метаболитов арахидоновой кислоты в физиологии глаза 28
1.2.1 Метаболизм арахидоновой кислоты 28
1.2.2 Физиологическая роль циклооксигеназ в организме 29
1.2.3 Физиологическая роль циклооксигеназ в глазу 32
1.2.4 Физиологическая роль простагландинов в глазу 33
1.2.5 Роль метаболитов арахидоновой кислоты в разрешении воспалительного процесса в глазу 35
1.3 Роль факторов роста в физиологии глаза з
1.3.1 Эндотелиальный фактор роста (VEGF) 37
1.3.2 Нейротрофины. Нейротрофический фактор роста. Фактор роста нервов
1.4 Моделирование пролиферативной витреоретинопатии in vivo 47
1.5 Лечение пролиферативной витреоретинопатии
1.5.1 Триамцинолона ацетонид 54
1.5.2 Лорноксикам 57
Глава 2. Материалы и методы исследования 59
2.1 Клинические материалы и методы исследования пациентов 59
2.1.1 Клинико-функциональное состояние пациентов 59
2.1.2. Методы обследования пациентов 62
2.1.3 Методика хирургического удаления мембран 63
2.1.3.1 Предоперационная подготовка пациентов 64
2.1.3.2 Техника проведения хирургического вмешательства 64
2.2 Экспериментальные материалы и методы исследования 66
2.2.1 Анализ экспрессии генов циклооксигеназ и факторов роста методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции 66
2.2.1.1 Выделение РНК 66
2.2.1.2 Проведение ДНК-азной обработки РНК 67
2.2.1.3 Проведение обратной транскрипции (ОТ) мРНК 68
2.2.1.2.3 Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) 68
2.2.2 Содержание животных 70
2.2.3 Обследование глаз крысы 70
2.2.4 Разработка диспазной модели пролиферативной витреоретинопатии у крыс (Эксперимент №1) 71
2.2.4.1 Распределение животных по группам 71
2.2.5 Исследование действий противовоспалительных препаратов на динамику развития ПВР у крыс (Эксперимент №2) 72
2.2.5.1 Схема введения лорноксикама и триамцинолона ацетонида. 72
2.2.5.2 Распределение животных по группам 72
2.2.6 Получение гистологических препаратов крысиных глаз 73
2.2.6.1 Окрашивание гематоксилин-эозином 73
2.2.6.2 Окрашивание азаном по методу Гейденгайна на коллагены. 74
2.2.7 Метод обсчета гистологических препаратов крысиных глаз 74
2.2.8 Исследование экспрессии циклооксигеназ в сетчатке и хориоидее в диспазной модели ПВР у крыс, и влияния противовоспалительных препаратов на этот процесс (Эксперимент №3) 2.2.8.1 Распределение животных по группам 75
2.2.8.2 Иммуногистохимическое окрашивание на ЦОГ-1 и ЦОГ-2 75
2.2.9 Метод обсчета препаратов крысиных глаз, окрашенных иммуногистохимически 76
2.3 Статистический анализ 77
Глава 3. Результаты анализа экспрессии ростовых, трофических и провоспалительных факторов в эпиретинальных мембранах 78
Глава 4. Результаты разработки диспазной модели пролиферативной витреоретинопатии у крыс и критериев оценки состояния сетчатки и хориоидеи 83
4.1 Критерии оценки состояния сетчатки и хориоидеи при развитии ПВР у крыс 83
4.2 Результаты внешнего осмотра крысиных глаз 87
4.3 Результаты оценки изменений сетчатки после интравитреальной инъекции диспазы и образования эпиретинальных мембран 88
Глава 5. Результаты действия противовоспалительных препаратов на динамику развития пролиферативной витреоретинопатии у крыс 94
5.1 Общее состояние животных 94
5.2 Результаты клинических данных, полученных при осмотре глаз животных 95
5.3 Результаты анализа изменений архитектоники сетчатки 97
5.4 Результаты анализа изменений толщины слоев сетчатки и хориоидеи на разных сроках развития ПВР 103
Глава 6. Результаты действия противовоспалительных препаратов на экспрессию циклооксигеназ в диспазной модели пролиферативной витреоретинопатии у крыс 112
6.1 Изменения экспрессии ЦОГ-1 и ЦОГ-2 в хориоидее и слоях сетчатки на ранних сроках развития ПВР 112
6.2 Изменения экспрессии ЦОГ-1 и ЦОГ-2 в хориоидее и слоях сетчатки на поздних сроках развития ПВР 118
6.3 Экспрессия ЦОГ-1 и ЦОГ-2 в мембранах, образующихся в диспазной модели пролиферативной витреоретинопатии у крыс 120
Заключение 122
Выводы 143
Практические рекомендации 145
Список сокращений 146
Список литературы
- Клетки, участвующие в формировании мембран при ПВР
- Методика хирургического удаления мембран
- Иммуногистохимическое окрашивание на ЦОГ-1 и ЦОГ-2
- Результаты анализа изменений архитектоники сетчатки
Клетки, участвующие в формировании мембран при ПВР
Факторы риска развития ПВР - это обстоятельства, наличие которых предрасполагает к развитию данной патологии.
Пролиферативная витреоретинопатия относительно сетчатки развивается эпи-, суб- и интраретинально. Все формы считаются результатами одной и той же болезни, но при этом до сих пор остается неясным, какие факторы определяют место развития мембран относительно сетчатки. Почти вся имеющаяся информации касается развития преретинальной формы ПВР. Среди отслоек сетчатки частота образования субретинальных мембран составляет 15,7% [1]. Анализ данных показал прямую корреляцию наличия данной патологии с площадью отслойки сетчатки, длительностью ее существования, с наличием немых разрывов сетчатки и с молодым возрастом пациентов. Субретинальная форма ПВР чаще образуется после операций [2]. К сожалению, нет никакой информации о факторах риска развития третьей формы ПВР (интраретинальной). Есть предположение, что выраженность фиброза в этом случае зависит от количества воспалительных факторов, находящихся в стекловидном теле [3].
Исторически изучение факторов риска развития ПВР началось с тех, что вызывают вторичную ПВР, и только относительно недавно стали более прицельно изучать факторы, запускающие первичную пролиферацию.
Начиная с 1990-х годов, замечено, что ПВР возникает при воспалении, нарушении целостности структур глаза и гемато-офтальмического барьера. Так, пролиферацию обнаруживали в нескольких четко определенных клинических ситуациях: при наличии гигантских, крупных или нескольких небольших разрывов сетчатки, афакии, кровоизлиянии в стекловидное тело, отслойке хориоидеи, а также при наличии признаков увеита [4-7].
Регматогенная отслойка сетчатки (РОС) - один из основных факторов развития ПВР, при этом он сочетает в себе все провокационные компоненты заболевания. При РОС происходит повреждение целостности сетчатки, что часто сопровождается кровотечением из ретинальных сосудов и ведет к инициации воспаления. В проспективном исследовании Tseng W. и соавт. (2004) показали, что у 119 пациентов с РОС, которым ранее не проводилась витреоретинальная операция, в 52,9% случаях было ПВР и у 26,9% из них наблюдалась тяжелая форма со средней продолжительностью отслойки сетчатки 58,4 ± 129,1 дней [7]. ПВР часто развивается в послеоперационном периоде, приводя к рецидиву отслойки сетчатки [8,9].
Почему, несмотря на в основном успешную хирургию отслоек сетчатки, по крайней мере в 10% случаев это приводит к развитию ПВР? Неизвестно! Мы считаем, что это может быть связано с исходным реактивным статусом пациента и тем, что избыточный травматизм при операции обладает сильным провокационным действием на процессы воспаления в глазу. Эту гипотезу подтверждают имеющиеся корреляции между выраженностью ПВР и дополнительными факторами риска: наличие предоперационной ПВР в стадии А или В [4,10]; использование для тампонады витреальной полости гексафторида серы (SF6) [11], силиконового масла или тяжелых жидкостей [12]; чрезмерная криотерапия, диатермо- или фотокоагуляция; повторное хирургическое вмешательство [5,6]. При этом замечено, что длительная отсрочка в хирургии регматогенной отслойки сетчатки приводит к более обширному образованию мембран на ее поверхности [13]. Girard и соавт. (1994) опубликовали результаты крупного проспективного исследования [4] отслойки сетчатки. Согласно их данным, только незначительные предоперационные ПВР степени А являются сильными предикторами развития тяжелых послеоперационных ПВР, тогда как ПВР степени С1 таковыми не являются; и только незначительные кровоизлияния, возникающие во время или после операции, связаны с более высокой распространенностью послеоперационных ПВР. При этом авторы не считают количество операций, афакию или субретинальный дренаж жидкости факторами, увеличивающими вероятность развития ПВР.
В настоящее время большое внимание уделяют определению генов-кандидатов, связанных с повышенным риском развития ПВР после отслойки сетчатки [14,15], одним из главных претендентов на эту роль является локус фактора некроза опухоли бета в гене лимфотоксина альфа LTA. Люди с полиморфизмом в этом локусе более склонны к развитию ПВР после отслойки сетчатки [14].
Sanabria Ruiz-Colmenares и соавт. (2006) обнаружили прямую зависимость между полиморфизмом аллеля Т гена TGF-J31, контролирующего клеточную пролиферацию и апоптоз, в ко доне 10 и развитием ПВР [16].
В исследовании Retina 4 Project показали, что полиморфизм в 72 кодоне белка р53 (rsl042522), стимулирующего клеточный апоптоз, повышает риск развития ПВР после регматогенной отслойки сетчатки [17].
Hetian Lei и соавт. (2012) определили, что подавление экспрессии р53 приводит к уменьшению апоптоза и старения клеток, участвующих в формировании мембран при ПВР. Они также показали, что стимуляция рецептора фактора роста тромбоцитов-альфа (PDGFRa), увеличивающего пролиферацию фибробластов, гладко-мышечных клеток и синтез коллагена, приводит не только к уменьшению синтеза р53, но и к сокращению клеток, что ведет к отслойке сетчатки в модели ПВР на кроликах [18].
Методика хирургического удаления мембран
На операционном столе операционное поле обрабатывалось спиртовым раствором, содержащим хлоргексидин, в конъюнктивальный мешок инсталлировали 0,05% раствор антисептика пиклоксидина (Витабакт). Затем в конъюнктивальный мешок инсталлировали 0,5% раствор местного анестетика проксиметакаина (Алкаин).
Для достижения максимального мидриаза, необходимого для обеспечения хорошей видимости и четкого контроля за внутриглазными манипуляциями на всех этапах оперативного вмешательства, в конъюнктивальный мешок инсталлировали раствор, содержащий 5% тропикамида и 0,8% фенилэфрина гидрохлорида (Мидримакс). На операционном столе под конъюнктиву у лимба вводили 0,1-0,2 мл 0,1%. После такой подготовки мидриаз в большинстве случаев составлял 7-8 мм.
Пациентам выполняли хирургическое вмешательство в следующем объеме: субтотальная витрэктомия pars plana, удаление эпиретинальных мембран, тампонада перфторорганическим соединением (ПФОС) и эндолазеркоагуляцию сетчатки.
На расстоянии 4мм от лимба и устанавливали 3 порта 25G либо 27G в зоне проекции плоской части цилиарного тела на 2.30, 4.00 и 9.30 часах. К порту на 4ч присоединяли инфузионную систему. Через порт на 2.30 часах вводили световод, а через порт на 9.30 часах — витреотом. Интраоперационное ВГД поддерживалось на уровне 24-27 мм рт.ст., частота реза ножа наконечника витреотома менялась в пределах от 600 до 1500 резов в минуту при вакууме от 50 до 650 мм рт.ст. Так как у всех пациентов, вошедших в эксперимент, наблюдалась ПВР, то до введения ПФОС при помощи ретинального пинцета тщательно удаляли с поверхности сетчатки эпиретинальный слой стекловидного тела и эпиретинальные мембраны (ЭРМ). Фиксированное к сетчатке стекловидное тело подтягивали пинцетом и удаляли витреотомом. ЭРМ удаляли по стандартной методике, заводя одну из бранш раскрытого цангового пинцета между складками сетчатки на границе мембраны. Бранша заводится между мембраной и сетчаткой, после чего край эпиретинальной мембраны захватывается пинцетом и слегка отделяется от сетчатки. Данная манипуляция выполнялась по всему контуру мембраны. Затем производили отделение эпиретинальной мембраны от сетчатки, стараясь одномоментно отделить мембрану в полном объеме. Для сохранения целостности удаляемой мембраны, по мере её отделения, перехватывали мембрану пинцетом ближе к сетчатке. Такой прием позволял одномоментно и полностью удалить мембрану, занимающую значительную площадь сетчатки.
Убедившись в том, что диск зрительного нерва и центральная область сетчатки освобождены от стекловидного тела (СТ) и ЭРМ, к диску зрительного нерва подводилась канюля на шприце, через которую осуществлялась подача жидкого ПФОС.
После введения первой порции ПФОС, равной объёму удалённого СТ, канюля извлекалась, и вновь вводился наконечник витреотома. Осуществлялась витрэктомия следующего слоя СТ, примерно до зоны экватора. По мере заполнения витреальной полости жидким ПФОС выполнялось удаление эпиретинальных мембран. ПФОС прочно удерживало сетчатку в центральной зоне и ограничивало ее подвижность на периферии, что делало удаление эпиретинальных мембран безопасным и эффективным. Каждое последующее введение ПФОС осуществлялось после удаления эпиретинальных мембран. После завершения витрэктомии и ослабления всех тракций витреальная полость заполнялась ПФОС до уровня портов, субретинальная жидкость при этом одновременно вытекала из-под сетчатки через ретинальные разрывы.
Затем выполнялась эндолазерная коагуляция сетчатки (ЭЛК). Лазерные коагуляты наносились в шахматном порядке в 3-4 ряда вдоль всей зубчатой линии, а также вокруг разрывов и очагов хориоретинальной дегенерации. Используемая мощность лазера - от 120 до 150 мВт.
Далее приступали к тампонаде силиконом. По мере поступления силикона в витреальную полость ПФОС эвакуировалось через экструзионную канюлю. В процессе введения силикона визуально мониторировали наличие пульсации в артериях сетчатки; при появлении пульсации подачу силикона приостанавливали до момента возобновления непрерывного кровотока. Извлекали порты и герметизировали склеральные доступы. Операцию завершали субконъюнктивальной инъекцией 0,5 мл 0,4% раствора дексаметазона.
Мембраны, извлеченные во время хирургического вмешательства, сразу помещались в жидкий азот, затем в течение 12 часов их переносили в 500 мкл TRI-реагента (Sigma) и хранили при -20С до выделения РНК. В дальнейшем все процедуры выполняли для всех образцов одновременно.
Пробу с 500 мкл TRI-реагента гомогенизировали в течение 25 минут. Проводили центрифугирование при 10000 g в течение 10 минут, в результате которого частицы, не подвергшиеся лизису, выпадали в осадок. Надосадочную жидкость, содержащую РНК (450 мкл), переносили в стерильную пробирку, добавляли 100 мкл хлороформа, встряхивали на Vortex 30 секунд, после чего пробу инкубировали 10 минут при комнатной температуре. Далее пробы центрифугировали при 13500 g в течение 15 минут, в результате чего раствор разделялся на три фазы, верхняя из которых содержала РНК. Эту фазу (220 мкл) переносили в стерильную пробирку, туда же добавляли 110% объема отобранной фазы изопропилового спирта, аккуратно перемешивали, и после инкубации пробы при комнатной температуре в течение 10 минут проводили центрифугирование при 14000 g течение 35 минут. Водно-спиртовую фазу удаляли, осадок РНК промывали дважды 75%-ным этанолом, высушивали и растворяли в 30 мкл деионизованной воды, обработанной диэтилпирокарбонатом (ДЭПК) и содержащей 3 ед. активности ингибитора РНКаз. Концентрацию РНК оценивали электрофоретически, целостность РНК оценивали по сохранности 28S и 18S рРНК. Выделенную РНК хранили при температуре - 20С.
Иммуногистохимическое окрашивание на ЦОГ-1 и ЦОГ-2
После инъекций диспазы наблюдали развитие воспалительной реакции, зрительно характеризующейся полнокровием сосудов радужки, отеком; в ряде случаев визуально регистрировали развитие катаракты и гемофтальма. Следует напомнить, что каждая временная точка оценки состояния сетчатки животных - это отдельные группы крыс, частоты развития катаракты и гемофтальма в которых могут различаться. Поэтому была введена общая частота встречаемости признака (табл. 11).
Частота развития катаракты и гемофтальма в диспазной модели, выраженная в % (N с признаком/N в группе). - р 0,05 по сравнению с группой Д1 по точному критерию Фишера. неделя 6 неделя 8 неделя Общее кол-во Стоит отметить, что введение физиологического раствора не приводило к развитию аналогичных изменений.
У животных с инъекцией диспазы максимальный катарактогенез регистрировали уже на первой недели эксперимента в группе Д2 и - 80% и 75% случаев соответственно (табл. 11). Минимальная из вводимых доз фермента значимо мень приводила к развитию катаракты в первые семь дней эксперимента. Общая частота катарактогенеза в группах Д2 и ДЗ не отличалась между собой и на была 40% выше, чем в группе Д1 (р 0,05).
В диспазной модели гемофтальм на 7 сутки в группах Д1, Д2 и ДЗ встречался, соответственно, в 67, 80 и 75 процентах случаев. В группах Д1 и Д2 наблюдалась тенденция уменьшения частоты встречаемости гемофтальма к восьмой недели эксперимента: р=0,16 и р=0,18 соответственно. При этом общая частота развития гемофтальма в группа Д1 и Д2 одинакова, а вот в группе ДЗ была тенденция к увеличению общей частоты встречаемости данной патологии (р=0,16).
На 7-е сутки в диспазной модели наблюдали увеличение средней протяженности волнообразных изменений в зависимости от дозы вводимого фермента от 14,67, 25,99 и до 47,48% в группах Д1 (1 крыса из 4-х), Д2 (3 крысы из 4-х) и ДЗ (2 крысы из 4-х) соответственно (рис. 7). Кроме этого, в диспазной модели показательно выглядит дозозависимое увеличение длины измененной сетчатки от 32,93% в группе Д1 до 60,32% в группе Д2 и 86,3 % в группе ДЗ (статистически значимое в группах Д2 и ДЗ, р 0,05 по сравнению с 3,06% у крыс, получавших инъекцию физиологического раствора). Важно отметить, что в группе контроля на протяжении всего эксперимента не наблюдали развития ПВР.
Через 7 суток после моделирования ПВР на сетчатке обнаружены эпиретинальные мембраны у 2-х крыс из 4-х в группе Д1, у 2-х из 5-ти в группе Д2 и у 3-х из 4-х в группе ДЗ. В области под эпиретинальными мембранами сетчатка была значительно увеличена в размерах: происходило разрастание глиальных клеток в ганглионарном и внутреннем ядерном слоях, также увеличивалась толщина внутреннего плексиформного слоя.
На 6-ой и 8-ой неделе после интравитреального введения диспазы рассматривали развитие ПВР в хроническом периоде. Всех животных с инъекцией разных доз диспазы разделили на две группы - с отсутствием эпиретинальных мембран и наличием эпиретинальных мембран. Интересно, что толщина слоев сетчатки изменялась по-разному в группах с нарастанием мембран и без: под мембранами статистически значимо увеличивалась толщина слоя фоторецепторов (в 5,22 раза, р 0,01) и уменьшалась толщина наружного ядерного слоя (в 2 раза, р 0,01) (рис. 8). Все остальные слои сетчатки, кроме плексиформных, в группе с мембранами были увеличены.
К 6-ой неделе после введения диспазы в сетчатке формировались «розеточные» структуры, которые затрагивали наружный ядерный слой, либо наружный ядерный и внутренний ядерный слои, у 100% (у четырех) крыс в группе Д1, у 40% в группе Д2 (у 2-х из пяти) и у 60% (у трех из пяти) в группе ДЗ. Статистических различий в частоте развития «розеток» на шестой неделе эксперимента выявлено не было. У контрольных крыс подобных изменений не наблюдали.
Высокие дозы фермента 0,035и/мкл и 0,075и/мкл, к 8-ой неделе приводили к ремоделированию сетчатки до состояния, которое позволяет оценить общую толщину сетчатки, но не отдельных ее слоев. В связи со значительной деструкцией, было затруднительно оценить наличие «розеток» во всех группах. Анализ толщины слоев у животных под сформировавшимися мембранами по сравнению с участками без мембран показал: увеличение толщины слоя фоторецепторов в 2,3 раза (р 0,05); уменьшение толщины наружного ядерного и наружного плексиформного слоев практически в 2 раза (р 0,05) и значительное увеличение всех остальных слоев сетчатки. В результате общая толщина сетчатки под эпиретинальными мембранами увеличивалась в 1,7 раза (р 0,05).
На примере эпиретинальных мембран, образующихся к шестой недели эксперимента (рис. 9), видно, что выраженность изменений зависила от дозы вводимого интравитреально фермента. Так при суммарном введении 0,03U диспазы выраженность мембраны была минимальная, 0,07U - размер мембраны увеличился, интравитреальное введение диспазы в дозе 0,15U сопровождалось образованием выраженной фиброзной ткани на поверхности сетчатки.
Результаты анализа изменений архитектоники сетчатки
Дегенеративные изменения сетчатки в виде «розеток» обнаруживали на седьмые сутоки эксперимента (табл. 15). В группе Физ р-р «розетки» в сетчатке наблюдались у одной крысы из девяти на первой неделе эксперимента и у одной из семи - на шестой неделе. Противовоспалительные препараты, введенные сами по себе, не увеличили частоту развития данных дегенеративных изменений сетчатки. В группе, получавшей диспазу, выражен эффект увеличения частоты развития «розеток» с увеличением длительности эксперимента (р 0,05). К концу эксперимента фермент увеличил частоту встречаемости данных изменений сетчатки на 56% (р 0,05) по сравнению с группой Физ р-ра. Противовоспалительные препараты снизили частоту развития «розеток» и на 42-ой день она не отличалась от таковой в группе Физ р-ра. Однако общее часло «розеток» в группе Дисп+Триам было больше, чем группе Физ р-ра. В группе Дисп+Лорн частота развития «розеток» со временем не увеличивалось, и их общее количество не отличалось от группы Физ р-ра.
Для оценки дегенеративных изменений фоторецепторов использовали бальную шкалу. Введение физиологического раствора в стекловидное тело глаза крысы сопровождалось незначительными изменениями со стороны фоторецепторов, которые начинали проявляться на 7-ые сутки после инъекции (табл. 16), при этом к концу эксперимента состояние фоторецепторов имело тенденцию к улудшению (р=0,11). Изменения фоторецепторов у крыс в группе Физ р-р наблюдались только у тех животных, у которых была отслойка сетчатки.
Дегенеративные изменения фоторецепторов появлялись в первые сутоки после введения диспазы и прогрессировали с развитием ПВР: к концу эксперимента состояние фоторецепторов было в 2,2 раза хуже (р 0,05), чем в начале эксперимента. На 42-е сутки состояние фоторецепторов в группе Дисп было в 2,5 раза хуже (р=0,14), и в ней на 48% чаще встречалось поражение данных клеток (р 0,01), чем в группе Физ р-р (табл. 17). Использование триамцинолона ацетонида для лечения ПВР сопровождалось наростанием выраженности дегенеративных изменений фоторецепторов (р=0,06) по ходу эксперимента, и частота встречаемости изменений фоторецепторов в группе Дисп+Триам была на 33% больше (р 0,05) по сравнению с группой Физ р-ра. Эффект действия лорноксикама на состояние фоторецепторов сетчатки стал проявляться с седьмого дня эксперимента. Его использование в 34-х % случаев (р 0,05) предупреждало развитие поражений фоторецепторов при развитии ПВР, и имело тенденцию приводить к уменьшению выраженности изменений фоторецепторов на 7-ой и 42-ой день эксперимента (р=0,13) по сравнению с группой, не получавшей лечения.
Общая частота встречаемости поражения фоторецепторов, выраженная в процентах (N крыс с поражением фоторецепторов/N крыс в группе) -р 0,05, - р 0,01 по сравнению с данными, полученными в группе Физ р-р; f - р 0,05 по сравнению с данными в группе Дисп (по точному критерию Фишера)
Дисп+Триам 55 (12/22) В первые трое суток после введения диспазы наблюдали не только выраженное кровоизлияние из сосудов сетчатки, которое сопровождалось проникновением крови в стекловидное тело, но и локальное повреждение сосудов сетчатки в области взаимодействия с диспазой (табл. 18). Также в эти сроки можно было наблюдать выраженные субретинальные кровоизлияния из сосудов хориоидеи, что было зафиксировано как при офтальмоскопии глаз крыс, так и на гистологических срезах (рис. 12).
На седьмые сутки эксперимента при гистологическом исследовании препаратов в группах Дисп и Дисп+Лорн наблюдали гем суб- и эпиретинально в следовых количествах. В группе Дисп+Триам у всех животных были выраженные суб- и эпиретинального кровоизлияния. Через 6 недель после начала эксперимента ни в одной из исследуемых групп не было кровоизлияний.
В группах с интравитреальным введением чистого физиологического раствора, лорноксикама или триамцинолона ацетонида не наблюдалось поражения сосудов сетчатки и хориоидеи, и мембраны на поздних сроках эксперимента не образовывались.
У животных, получавших диспазу, к седьмым суткам начинали образовывать субретинальные (СРМ) или эпиретинальные (ЭРМ) мембраны (табл. 19). Использование лорноксикама снизило частоту образования мембран на 43% (р 0,05). Триамцинолона ацетонид не оказал никакого эффекта на частоту проявления данной патологии, наблюдаемой при развитии ПВР.
Частота встречаемости суб- и эпиретинальных мембран у животных на сроках от 7 до 42 дней эксперимента. (N крыс с мембранами/N крыс в группе) - р 0,05 по сравнению с данными, полученными в группе Дисп (по точному критерию Фишера)
На первой неделе после интравитреального введения физиологического раствора толщина сетчатки увеличилась на 54 мкм (р 0,001) за счет увеличение толщины всех слоев сетчатки, кроме ганглионарного (рис. 14). К шестой неделе толщина сетчатки уменьшилась на 19% (р 0,01) по сравнению с 7 сутками и стала практически неотличимой от интактного контроля (табл. 20). При этом толщина хориоидеи не изменялась на протяжении всего эксперимента.
В таблице 20 использовали следующие условные обозначения: -р 0,05, - р 0,01, # - р 0,001 отличие от группы интактного контроля; % -р 0,05 отличие от данных, полученных на 3 сутки эксперимента, в группе Дисп; f - р 0,05, ff - р 0,01, - р 0,001 отличие от данных, полученных на 7 сутки эксперимента, в группе Физ р-р; ! - р 0,05, !! - р 0,01, 4 -р 0,001 отличие от данных, полученных на 3 сутки эксперимента, в группе Дисп+Триам; - р 0,05, - р 0,01, - р 0,001 отличие от данных, полученных на 7 сутки эксперимента, в группе Дисп.; w- р 0,05, $ - р 0,01, - р 0,001 отличие от данных, полученных на 7 сутки эксперимента, в группе Дисп+Лорн.; S- р 0,05, Д - р 0,01 отличие от данных, полученных на 42 сутки эксперимента, в группе Дисп.
Введение 2 мкл диспазы в дозе 0,015и/мкл в стекловидное тело глаза крысы уже на первые сутки приводило к изменениям сетчатки, которые вначале были незначительные и нарастали с увеличением длительности эксперимента (рис. 15). На первые сутки происходило увеличение внутреннего ядерного и наружного плексиформного слоев на 33% (р 0,05) и на 50% (р 0,01) соответственно. На третьи сутки общая толщина сетчатки уменьшалась на 21% (р 0,05) по сравнению с группой интактного контроля. Это в основном происходило за счет уменьшения толщины наружного ядерного, внутреннего плексиформного слоев в 1,4 раза (р 0,05) и нейроганглионарного слоя в 1,5 раза (р 0,01).