Минеральные элементы роговицы и неорганические биохимические параметры слезы при кератоконусе Патеюк Людмила Сергеевна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 14

1.1. Теории патогенеза, этиопатогенетические факторы и сопутствующие проявления кератоконуса 14

1.2. Бионеорганическая химия соединительной ткани и роговицы 25

1.2.1. Роль металлов в метаболизме соединительной ткани 26

1.2.2. Роль металлов в метаболизме роговицы и пигментации роговицы 29

1.2.3. Современные представления о кольце Флейшера 33

1.3. Понятие о физико-химическом барьере 35

1.4. Неорганические биохимические параметры слезы

1.4.1. Неорганические компоненты слезы 40

1.4.2. Кислотность слезы 43

1.4.3. Осмолярность слезы 48

1.5. Современные методы аналитической химии 51

ГЛАВА 2. Характеристика материала и методов собственных исследований 56

2.1. Элементный анализ роговицы 61

2.1.1. Рентгенофлуоресцентный анализ роговицы 61

2.1.2. Энерго дисперсионная рентгеновская спектроскопия со сканирующей электронной микроскопией роговицы 62

2.2. Элементный анализ слезы 63

2.3. РН-метрия слезы 64

2.4. Осмометрия слезы 66

ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение 67

3.1. Распределение минеральных элементов в роговице в норме и при кератоконусе 67

3.1.1. Распределение минеральных элементов в роговице по данным рентгенофлуоресцентного анализа 67

3.1.2. Распределение минеральных элементов в роговице по данным энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии со сканирующей электронной микроскопией 71

3.1.3. Физико-химический барьер

в тканях роговицы при кератоконусе 78

3.2. Элементный состав слезы в норме и при кератоконусе 81

3.2.1. Элементный состав слезы по данным электронно-зондового рентгеноспектрального анализа 81

3.2.2. Буферная система слезы 86

3.3. Кислотность слезы в норме и при кератоконусе 89

3.3.1. Оригинальная методика рН-метрии слезы 89

3.3.2. Кислотность слезы в норме 95

3.3.3. Кислотность слезы при кератоконусе 100

3.4. Осмолярность слезы при кератоконусе 107

Заключение 108

Выводы 114

Практические рекомендации 116

Список литературы 117

• Роль металлов в метаболизме соединительной ткани
• Энерго дисперсионная рентгеновская спектроскопия со сканирующей электронной микроскопией роговицы
• Распределение минеральных элементов в роговице по данным энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии со сканирующей электронной микроскопией
• Оригинальная методика рН-метрии слезы

Введение к работе

Актуальность темы и степень ее разработанности

Кератоконус (КК) - невоспалительное эктатическое заболевание роговицы, проявляющееся деструктивными изменениями, прогрессирующим истончением и выпячиванием ее центральной части с соответствующим изменением формы до конусовидной. Вопрос о происхождении КК по-прежнему остается открытым: достоверно неизвестны ни его этиология, ни патогенез. Не установлены ультраструктурные механизмы и нарушения, лежащие в основе развития этого вида протрузии, несмотря на огромное число исследований, теорий и гипотез о природе КК.

Согласно немногочисленным эпидемиологическим данным заболеваемость КК широко варьирует (0,0003-2,3%) в зависимости от региона наблюдения (Горскова Е.Н., Севостьянов Е.Н., 1998; Jonas J.B. et al, 2009; Millodot M. et al., 2011). Высока социальная значимость этого заболевания в связи с возможностью возникновения у пациентов с КК инвалидности по зрению или профессиональной нетрудоспособности. Ранняя диагностика КК возможна только при наличии современной высокотехнологичной и дорогостоящей лечебно-диагностической базы. Лечебные мероприятия, выполняемые с целью стабилизации или оптической коррекции этого вида кератэктазии, также требуют высоких финансово-экономических затрат и высокого профессионализма врачебного персонала. Отдельного рассмотрения заслуживает эффективность проводимой при КК терапии, сопряженной с рисками повторных хирургических вмешательств в результате недостижения желаемых результатов или развития рецидивов (Barbara A., Rabinowitz Y.S., 2011; Sinjab М.М., 2011; Wang М., Swartz T.S., 2010). Большое количество опубликованных за последние годы научных работ, посвященных КК, говорит об актуальности данной проблемы (Абугова Т.Д., 2011; Лобанова О.С, Слонимский Ю.Б., 2012; Нероев В.В. и соавт.,

2012; Пенкина А.В. и соавт., 2012; Слонимский Ю.Б. и соавт., 2014).

Вопросы этиологии и патогенеза КК в системе современных медицинских знаний широко освещены на междисциплинарном уровне (офтальмология, генетика, гистология, цитология, биохимия, иммунология, аллергология, эндокринология и др.). Несмотря на многочисленные сообщения в специальной литературе об исследованиях, свидетельствующих в пользу той или иной теории возникновения КК и данных об его ассоциации с другими заболеваниями, вопрос о причинах и механизмах его развития остается открытым (Каспарова Е.А., 2002; Пучковская Н.А., Титаренко З.Д., 1990; Barbara A., Rabinowitz Y.S., 2011; Kenney CM, Brown D.J., 2003; Sinjab M.M., 2011; Wang M., Swartz T.S., 2010).

Химический состав слезной жидкости при заболеваниях глаз может претерпевать существенные изменения (Бржеский В.В., 1990; Куренков В.В, и соавт., 2000; Майчук Д.Ю., 2005; Мошетова Л.К., Волков О.А., 2004). В ряде современных исследований отмечена связь КК с аномальным составом слезы (Горскова Е.Н. и соавт., 1998; Горскова Е.Н. и соавт., 2001; Горскова Е.Н. и соавт., 2002; Севостьянов Е.Н. и соавт., 2005; Семенова А.Л. и соавт., 2008; Kahan I.L. et al, 1990; Lema I., Duran J.A., 2005; Lema I. et al., 2008; Lema I. et al., 2009). Имеются сообщения о минеральном дисбалансе (железо и цинк) в роговице при КК (Севостьянов Е.Н. и соавт., 2005). Получены предварительные данные об уменьшении кислотности слезы и аномальном распределении меди в роговице при развитии КК. В 2011г. С.Э. Аветисов и соавт. предложили гипотезу о принципиально новом патогенетическом механизме развития КК, связанном с недостаточностью медь-зависимого фермента лизилоксидазы (Аветисов С.Э. и соавт., 2011).

В связи с вышеизложенным можно сделать вывод о необходимости детального изучения минерального метаболизма в тканях роговицы и в слезной жидкости в патогенезе КК - уточнить характер и роль нарушений обмена минералов в роговице, изучить минеральные компоненты слезы и провести анализ ее кислотности и осмолярности.

Цель: изучение распределения минеральных элементов в тканях роговицы и неорганических биохимических параметров слезы (минеральный состав, кислотность и осмолярность) в норме и при кератоконусе.

Задачи:

1. Изучить минеральный состав роговичных дисков без признаков патологических изменений и роговичных дисков, удаленных при сквозной кератопластике (СКП) по поводу КК III ст. с помощью методов рентгено флуоресцентного анализа (XRF) и энерго дисперсионной рентгеновской спектроскопии на базе сканирующего электронного микроскопа (SEM-EDS).

2. Адаптировать методы XRF и SEM-EDS для изучения биологических объектов; разработать методики элементного анализа тканей роговицы в соответствии с ее зонами и слоями.

3. Определить минеральные компоненты, входящие в состав слезы в норме и при КК, методом электронно-зондового рентгеноспектрального анализа (РСМА).

4. Разработать методику рН-метрии, позволяющую с высокой точностью оценивать кислотность содержимого конъюнктивальной полости; разработать программное обеспечение для компьютерного колориметрического анализа лакмусовых проб слезы.

5. Изучить статистическое распределение кислотности слезы в норме (среди здоровых лиц, не страдающих заболеваниями глаз, и пациентов с миопическим астигматизмом) в зависимости от рефракции, возраста, половой принадлежности, аллергологического анамнеза и привычки к табакокурению.

6. Выявить статистические особенности распределения кислотности слезы в норме (среди здоровых лиц, не страдающих заболеваниями глаз, и пациентов с миопическим астигматизмом) и при КК.

7. Изучить статистическое распределение осмолярности слезы при КК.

Научная новизна

8. Впервые на репрезентативном материале изучен минеральный состав роговицы в норме и при КК. При КК выявлено аномальное перераспределение минеральных элементов в тканях роговицы.

9. Разработаны методики проведения XRF и SEM-EDS для оценки состояния роговицы.

10. Впервые в репрезентативном материале проведено исследование минерального состава слезной жидкости в норме и при КК.

11. Впервые обнаружены значимые концентрации бора в слезе в норме и при КК. Предложена гипотеза боратной буферной системы в качестве наиболее надежной составляющей механизма, поддерживающего стабильность нормального кислотно-основного состояния слезы.

12. Впервые на репрезентативном материале проведено изучение кислотности слезы в норме (у здоровых лиц и пациентов с миопическим астигматизмом) и при КК.

13. Разработана оригинальная методика прецизионной рН-метрии, позволяющая оценивать кислотность сред конъюнктивальной полости при помощи лакмусовых тест-полосок высокой чувствительности. Разработано оригинальное программное обеспечение для проведения компьютерного колориметрического анализа лакмусовых тест-полосок с пробами слезы.

14. Выявлена гетерогенность уровня рН содержимого конъюнктивальной полости.

15. Установлено естественное возрастное изменение кислотности слезы: уменьшение рН ее вязкого компонента.

16. Впервые выявлено достоверное отличие кислотности содержимого конъюнктивальной полости у пациентов с КК от аналогичного показателя в норме.

10. Впервые на репрезентативном материале изучена осмолярность слезы у пациентов с КК.

11. Предложена новая теория патогенеза КК, основанная на принципе

«порочного круга».

Теоретическая и практическая значимость работы

Разработанные методики XRF и SEM-EDS для изучения тканей роговицы могут быть адаптированы для изучения других биологических объектов. Выявленные нарушения минерального метаболизма в роговице и сдвиг рН вязкого компонента слезы в щелочную сторону при КК, а также новая теория патогенеза КК по принципу «порочного круга» в дальнейшем предполагают разработку патогенетических методов терапии, диагностики и профилактики этого заболевания. Предложенная гипотеза боратной буферной системы слезы может быть рассмотрена в контексте создания местно действующих фармакологических препаратов. Разработанную методику рН-метрии содержимого конъюнктивальной полости применяют в научно-исследовательской работе ФГБНУ «НИИГБ». Выявленная гетерогенность кислотности содержимого конъюнктивальной полости в норме и при КК является предметом будущих научно-исследовательских работ.

Методология и методы диссертационного исследования

Методологической основой диссертационной работы явилось применение комплекса методов и основных принципов научного исследования, соблюдены схема и этапы последнего. Сочетание качественных и количественных методик исследования позволили предложить гипотезу о возможных причинно-следственных связях в этиопатогенезе КК. Работа выполнена в дизайне одномоментного кросс-секционного исследования с использованием клинических, инструментальных, аналитических, лабораторных и статистических методов.

Положения, выносимые на защиту

1. При КК III ст. нарушен минеральный обмен в роговице. Аномальное распределение минеральных элементов в роговице характеризует преимущественное накопление железа, меди и цинка в зоне пигментного

кольца Флейшера (Fleischer В.) в поверхностных слоях стромы, в области боуменовой мембраны и в эпителии роговицы; центральная зона роговицы тотально обеднена всеми тремя элементами.

2. Методы рентгенофлуоресцентного анализа (XRF) и энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии на базе сканирующего электронного микроскопа (SEM-EDS) могут быть использованы для изучения роговицы.

3. Минеральный компонент слезной жидкости в норме и при КК представлен преимущественно растворимыми соединениями хлора, натрия, калия и бора. Боратная буферная система может выступать в качестве вероятной составляющей механизма, поддерживающего нормальное кислотно-основное состояние слезы. Минеральный состав слезы при КК аналогичен таковому у здоровых лиц.

4. Оригинальная методика рН-метрии с проведением компьютерного колориметрического анализа лакмусовых проб может быть использована для измерения кислотности биологических сред, в т.ч. для измерения кислотности содержимого конъюнктивальной полости. Содержимое конъюнктивальной полости гетерогенно; кислотность свободной слезной жидкости достоверно выше ее вязкого компонента, имеющего более щелочной характер.

5. Естественную возрастную изменчивость кислотности слезы характеризует физиологическое уменьшение рН (закисление) ее вязкого компонента. Кислотность свободной слезной жидкости не зависит от возраста, половой принадлежности, аллергологического анамнеза, привычки к табакокурению и рефракции. Статистическое распределение рН свободной слезной жидкости и вязкого компонента слезы пациентов с миопическим астигматизмом не отличается от аналогичного показателя здоровых лиц.

6. У здоровых лиц и у пациентов с миопическим астигматизмом распределение рН свободной слезной жидкости является нормальным, а при КК имеет признаки полимодальности. Кислотность вязкого компонента слезы пациентов с КК в более молодом возрасте превышает норму.

7. Связь кислотности слезы с патогенезом КК возможна согласно предложенной теории патогенеза КК по принципу «порочного круга».

8. Статистическое распределение осмолярности слезы при КК не имеет отличительный особенностей от нормы.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность полученных результатов определяет репрезентативный объем материала с использованием современных методов исследований и объективных методов обработки данных. В работе использовано современное сертифицированное офтальмологическое, аналитическое и лабораторное оборудование, условия исследования стандартизированы для выполнения поставленных задач. Анализ материала и статистическая обработка полученных данных выполнены с применением современных методов и в соответствии с современными стандартами сбора и обработки научных данных.

Основные положения и материалы диссертации доложены на:

1. Научно-практической конференции с международным участием «VI Российский общенациональный офтальмологический форум» (Москва, 2013) - «Изменение химического состава роговицы при кератоконусе (предварительное сообщение)»;

2. XII Международной научно-практической конференции «Федоровские чтения - 2014. Современные технологии лечения патологии роговицы»: «Современные технологии лечения патологии роговицы» (Москва, 2014) - «Новые данные о происхождении кольца Флейшера при кератоконусе»;

3. V Международном симпозиуме «Осенние рефракционные чтения»: «Индуцированные аметропии» (Москва, 2014) - «Новая концепция патогенеза кератоконуса»;

4. «XIV Всероссийской школе офтальмолога» (ВШО - 2015) (Московская обл., 2015) - «Биохимические неорганические параметры слезы при кератоконусе»;

5. X Съезде офтальмологов России (Москва, 2015) - «Физико-химический барьер в роговице - основа новой концепции патогенеза кератоконуса»;

6. Заседании проблемной комиссии Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научно-исследовательский институт глазных болезней» (ФГБНУ «НИИГБ») - 08.06.2015 г.

Личный вклад автора в проведенное исследование

Личный вклад автора состоит в непосредственном участии в подготовке и проведении всех экспериментальных и клинических исследований, обработке и интерпретации полученных дынных, анализе результатов, подготовке публикаций и докладов по теме диссертации.

Внедрение результатов работы

Разработанные в ходе настоящей работы методики и полученные результаты исследований реализованы и применяются в научно-исследовательской работе ФГБНУ «НИИГБ».

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 - в журналах, входящих в перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертационной работы

Диссертация изложена на 144 страницах машинописного текста, иллюстрирована 16 таблицами и 30 рисунками. Работа состоит из введения, главы обзора литературы, главы о материале и методах настоящих исследований, главы о результатах собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 251 источник, из них 66 -русскоязычных и 185 - иностранных.

Роль металлов в метаболизме соединительной ткани

Кератоконус (КК) как самостоятельная нозологическая форма впервые был описан в 1729 г. английским офтальмологом Бенедиктом Дудделем (Duddell Benedict) в «Трактате о заболеваниях роговой оболочки глаза, и о различных видах катаракт (англ. «A treatise of the diseases of the horny-coat of the eye, and the various kinds of cataract»; Лондон, издательство «Clark & Roberts») [133, 240, 244]. К настоящему времени существенно усовершенствованы методы ранней диагностики, мониторинга, коррекции и лечения этого эктатического заболевания роговицы. Менее изученными остаются вопросы, связанные с этиологией и патогенезом КК. Энциклопедическое толкование определяет патогенез как «механизмы возникновения и развития болезни и отдельных ее проявлений на различных уровнях организма», в то время как этиология - это «раздел патологии, изучающий проблему причинности в медицине». Подробный анализ приведенных в доступной литературе работ показал, что представленные авторами результаты относятся не только к рассмотрению этиологических или патогенетических факторов КК, но и к оценке ряда сопутствующих проявлений, как местного, так и общего характера.

Наиболее широкое распространение на сегодняшний день получила генетическая теория развития КК, в частности выявлены факты семейной наследственности, конкордантности между идентичными близнецами и ассоциации КК с другими генетическими нарушениями. Несколько локусов, ассоциированных с КК, в том числе в случаях семейного анамнеза, были картированы; тем не менее, мутации генов, непосредственно ответственные за развитие этого заболевания, так и не были определены [81, 174, 197].

Согласно эпидемиологическим исследованиям лица азиатского происхождения страдают КК чаще, чем европеоидное население [127]. Для первых также характерны более раннее начало заболевания и более высокая частота трансплантаций роговицы по поводу КК [202]. Тем не менее, частота встречаемости КК среди пациентов, относящихся к европеоидной расе, значительно выше, чем среди представителей негроидной расы и лиц латиноамериканского происхождения [247]. Наибольшая частота встречаемости КК (2,3%) имеет место в некоторых регионах Индии и Израиля [142, 186].

Семейный анамнез выявляют в 6-23,5% случаев КК [46, 77, 111, 134, 186, 187, 199, 208, 247]. Вариабельны схемы наследования КК. Даже в пределах одной генеалогической схемы клиническая картина заболевания широко варьирует [46]. Известно, что монозиготные близнецы, обладающие идентичными генотипами, сходны и в фенотипах, включая проявления генетически детерминированных заболеваний. В парах идентичных близнецов описаны случаи КК: страдать кератэктазией могут оба близнеца или один из них; клиническая картина заболевания у близнецов может быть как идентичной, так и иметь значительные различия. То есть в отношении КК монозиготные близнецы могут проявлять как конкордантность, так и дискордантность [46, 81, 83, 90, 134, 178, 200]. У дизиготных близнецов, имеющих различные генотипы, течение КК варьирует так же, как у обычных братьев и сестер [235].

В доступной специальной литературе приведены данные о различных типах наследования при изучении семейных анамнезов КК. Имеются сообщения об аутосомно-рецессивном варианте наследования КК [153].

Аутосомно-доминантный тип наследования с вертикальной передачей также был выявлен в семьях, члены которых страдали КК. Высказано предположение о возможности неполной пенетрации или вариабельности экспрессии генов, предрасполагающих к развитию КК [131, 197, 208, 213]. В связи с этим некоторые исследователи считают КК наследственным заболеванием, фенотипические проявления которого зависят от множественных факторов окружающей среды [114, 197].

В ряде эпидемиологических исследований отмечают связь развития КК с полом, хотя имеющиеся данные носят разноречивый характер [117-119, 172, 177, 186].

Некоторые авторы указывают на возможную ассоциацию КК с заболеваниями, вызванными патологическими изменениями соединительной ткани и ее метаболизма, со множеством врожденных или наследственных (генных и хромосомных) болезней, с пролапсом митрального клапана и с дистрофиями роговицы [31, 81, 106, 111, 139, 140, 170, 185, 187, 215, 237, 243]. Приведенные данные позволяют предположить, что вышеперечисленные патологические состояния - разнообразные клинические проявления нарушений обмена коллагена.

Высказано предположение о том, что в развитии КК существенную роль играют воспалительные медиаторы, а также стимулирующие воспаление факторы, такие как хроническое трение глаз, аллергические и воспалительные заболевания переднего отрезка глаза, розацеа-кератит, синдром «болтающегося», или «дряблого» века (англ. floppy eyelid). В этих условиях эпителий роговицы начинает продуцировать литические ферменты и воспалительные цитокины, которые активируют кератоциты и вызывают повреждение тканей роговицы [81].

При КК отмечены изменения состояния клеточного и гуморального иммунитета, как местного, так и системного характера [2, 20, 23, 29, 64].

В ряде исследований изучены иммуногенетические аспекты возникновения КК. Так, была выявлена ассоциация распределения антигенов гистосовместимости и гаплотипов HLA I класса с развитием и клинической картиной КК [17, 22].

Кроме этого, КК может сочетаться с рядом аутоиммунных нарушений [193]. При прогрессировании заболевания было выявлено повышение титров специфичных антител к тканям роговицы [53].

По данным различных исследователей в 35-57% случаев КК может быть ассоциирован с разнообразными атопическими заболеваниями [77, 81, 134, 145, 149, 150, 186, 209, 239, 247].

Тем не менее, в ряде исследований к этиологическому фактору КК относят не сами атопические состояния, а травмирующее роговицу трение глаз при дискомфорте, вызванном аллергическим поражением глаз [82, 138, 145, 148, 171, 180, 246, 248]. Выявлена корреляция КК с трением (чесание) глаз, в результате которого может возникать каскад патологических изменений [179]. Имеются сведения о развитии КК в случае психологически обусловленного трения глаз (моторные навязчивости) при стрессе, эмоциональном напряжении или по привычке, а также в случае поведенческих аномалий психотического характера [145, 158, 175]. В качестве предрасполагающих к КК факторов механической травмы рассматривают синдром «болтающегося» века, положение во сне лицом вниз, синдром обструктивного апноэ [81, 105, ПО, 163, 191]. Существует мнение, согласно которому контактные линзы могут быть причиной постоянной механической травмы роговицы и, соответственно, предрасполагать к развитию КК; тем не менее, этот вопрос остается спорным [3, 19, 33, 152, 166].

Энерго дисперсионная рентгеновская спектроскопия со сканирующей электронной микроскопией роговицы

В качестве исследуемого материала использовали кадаверные роговичные диски без признаков патологических изменений и роговичные диски (операционный материал), удаленные при СКП по поводу КК III ст. согласно классификации, предложенной М. Амслером (Amsler М., 1951), а также пробы слезы базальной секреции здоровых лиц и пациентов с КК I—III ст. [1, со ссылкой на 74].

Кадаверным материалом служили кадаверные глаза, энуклеированные не позже чем через 12 ч. после смерти донора, консервированные в специальной среде для хранения роговиц (среда Борзенка С.А. - Мороз З.И.) во влажной камере при температуре 4-6С не более 3 сут. [14, 62].

Критерии включения пациентов в исследуемые группы: прогрессирующий КК I—III ст. обоих глаз.

Критерии включения пациентов в контрольные группы нормы: отсутствие диагноза и/или подозрения на КК.

Критерии исключения пациентов из исследования: хирургические вмешательства по поводу КК, использование жестких (в течение 6 мес. до исследования) и мягких контактных линз (в течение 3 дней до исследования), инстилляции офтальмологических препаратов (в течение 2 нед. до исследования при регулярном применении и 1 мес. - при нерегулярном), ССГ и другие заболевания глазной поверхности и/или переднего отрезка глазного яблока, хирургические вмешательства на переднем отрезке глазного яблока и/или структурах придаточного аппарата глаза, тяжелые заболевания глаз в настоящее время или в анамнезе, сопутствующие общесоматические заболевания.

Всем пациентам проведен опрос (сбора анамнеза и жалоб) и стандартное для КК офтальмологическое обследование, включавшее стандартные и специальные офтальмологические диагностические манипуляции: - визометрия (без и с максимальной коррекцией); - периметрия (скрининг); - авторефрактокератометрия (в т.ч. в условиях циклоплегии); - пневмотонометрия; - биомикроскопия; - офтальмоскопия (в т.ч. в условиях мидриаза); - эхобиометрия (кератопахиметрия и определение длины переднезаднего отрезка глазного яблока); - комплексное исследование роговицы при помощи оптического анализатора переднего отрезка глаза «Galilei G4» (Ziemer Ophthalmic Systems AG, Швейцария).

Исследование на аппарате «Galilei G4» сочетает в себе кератоскопию -миры Пласидо (Placido А.), и сканирующее исследование роговицы при помощи двухканальной камеры Шаймпфлюга (Scheimpflug Т.). В результате одно устройство позволяет проводить несколько важных диагностических методов: кератометрию, кератотопографию, кератотомографию и кератопахиметрию; а также рассчитывать кератотопографические индексы иррегулярности роговицы и вероятности наличия КК.

Программное обеспечение аппарата «Galilei G4» позволяет рассчитать следующие кератотопографические индексы: АА (Area Analyzed), АСР (Average Central/Corneal Power), CSI (Central/Surround Index), DSI (Differential Sector Index), IAI (Irregular Astigmatism Index), I-S (Inferior-Superior Index), OSI (Opposite Sector Index), SAI (Surface Asymmetry Index), SDP (Standard

Deviation of Corneal Power), SRI (Surface Regularity Index) и CMLI (Cone Location and Magnitude Index); а также индексы вероятности наличия кератэктазии КРІ (Keratoconus Prediction Index), KProb (Probability of Keratoconus) и PPR (Percent Probability of Keratoconus) [251].

Индексы КРІ, KProb и PPR используют как диагностический критерий при обследовании пациентов с подозрением на КК. Остальные индексы позволяют проводить дифференциальную диагностику и мониторинг состояния пациентов с КК.

При наличии показаний пациентам проводили дополнительные уточняющие методы исследования.

В качестве специальных неофтальмологических методов исследования в настоящей работе были использованы современные методы элементного химического анализа, рН-метрии и осмометрии для изучения минерального состава роговицы и неорганических биохимических параметров слезы в норме и при КК. Методы информационной обработки данных

При информационной обработке набранного материала и полученных в результате исследований сведений были использованы современные методы накопления и оценки данных. Данные, полученные при выполнении диссертационной работы, сводили в единую базу на основе таблиц Microsoft Excel 2007 со ссылками на структурированные папки с графической информацией.

Все оцениваемые величины были разделены на две категории по отношению к дальнейшей обработке.

I. Первая категория измеряемых параметров включала в себя данные малочисленных выборок, выборок с нерегулярными данными и данные оценки пространственного распределения. Эти данные не подлежали статистическому описанию и были представлены в работе визуально: результаты химического элементного состава роговицы и слезы.

Графическую обработку и визуализацию данных этой категории проводили с использованием программы Microsoft Excel 2007 и Corel Draw 12. Математическая обработка итоговых результатов содержания минеральных элементов в роговице по данным SEM-EDS и их последующая визуализация были проведены при помощи пакета Surfer 8.0 (Golden Software, Inc., США), который позволяет интерполировать неравномерно распределенные данные с преобразованием в координатную сетку с равномерным распределением, например, для построения карт и решения других сложных графических задач. Интерполяцию проводили с учетом геометрического расположения точек, в которых происходил замер, и учетом анизотропии вещества роговицы. Использован алгоритм «минимальной кривизны» с фактором анизотропии 1/4.

П. Вторая категория данных, подлежавших статистическому описанию, была подразделена на две части по характеру распределения (согласно

критерию согласия / Пирсона). Оценку и первичную визуализация характера распределения (построение гистограмм) проводили с использованием программного обеспечения SOFA Statistics vl.4.3 для Linux.

При нормальном распределении оцениваемых величин применяли параметрические методы статистики: для исследования связи двух признаков - линейный коэффициент корреляции (корреляционный анализ) Пирсона, а для исследования различия выборок - /-тест (критерий) Стьюдента для независимых выборок. Этим методам статистической обработки подлежали данные по кислотности свободной жидкости в норме, в том числе сравнительные проверки в бинарных субвыборках.

В случаях, когда распределение анализируемых величин не соответствовало закону нормального распределения (все остальные данные, полученные в ходе настоящей работы, кроме вышеперечисленных), применяли непараметрические статистические методы: связь двух признаков исследовали с помощью коэффициента ранговой корреляции (корреляционный анализ) Спирмена, а различие выборок проводили посредством [/-теста (критерий) Манна-Уитни.

Сравнительные тесты на различие и идентичность выборок, оценку параметров линейных корреляций по Пирсону, оценку корреляций по Спирмену проводили с помощью программного обеспечения GNU PSPP (psppire 0.7.9) для Linux и SOFA Statistics vl.4.3 для Linux. Учитывая относительно небольшие выборки большинства оцениваемых величин, были выбраны 95% пороговые надежности и мощности при оценке тождественности групп и силы корреляции. Статистическая проверка считалась пройденной при/? = 0,05.

Распределение минеральных элементов в роговице по данным энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии со сканирующей электронной микроскопией

Первоначально для регистрации рН слезы в нижнем конъюнктивальном своде применяли стеклянные микроэлектроды. Со временем стало очевидным, что рабочая поверхность электрода при достижении требуемого электрохимического контакта существенно «внедряется» в ткань конъюнктивы. Исходя из этого, было принято решение о необходимости разработки менее инвазивного способа измерения кислотности.

Для более точного измерения кислотности слезы необходимо исключить травматизацию конъюнктивы в процессе регистрации рН и минимизировать влияние рефлекторной слезопродукции на результаты измерения кислотности.

Лакмус - один из основных кислотно-основных индикаторов, применяемый для определения рН растворов. Бумажные рН-индикаторы являются эталоном во многих областях, в том числе и в медицине.

Индикаторная тест-полоска представляет собой пропитанную лакмусом фильтровальную бумагу. Результатом рН-метрии является четкая окраска для каждой величины рН, которую необходимо сравнить с цветовой шкалой. Процесс сравнения тестового окрашивания с эталонным является субъективным моментом в исследовании, и существует реальная возможность влияния человеческого фактора на результат рН-метрии.

В процессе настоящего исследования была разработана оригинальная методика рН-метрии с проведением компьютерного колориметрического анализа и получением результирующего значения кислотности с точностью до 0,01 ед. рН. Измерение рН слезы осуществляли по ранее описанному методу при помощи лакмусовых тест-полосок [58, 103, 223]. Для объективизации результатов при исследовании использовали специальные индикаторные бумаги высокой чувствительности с возможным диапазоном измерений от 6,4 до 8,0 и интервалом, равным 0,2 ед. рН (Macherey-Nagel, Германия).

Забор слезной жидкости проводили однократным касанием тест-полоской конъюнктивы в средней трети нижнего свода. Фильтровальная бумага тест-полоски обладает высокими капиллярно-адсорбционными свойствами, вследствие чего время забора материала и влияние рефлекторной секреции на результаты пробы сведены к минимуму. Анализируемый материал аппликационного теста был представлен исключительно содержимым конъюнктивальной полости с минимальным влиянием тканей конъюнктивы, которое сложно исключить при использовании стеклянных микроэлектродов.

Для бо лыпей объективизации результатов стандартная методика была дополнена компьютерной колориметрической оценкой. Разработанная в ФГБНУ «НИИГБ» оригинальная компьютерная программа - анализатор кислотности «РНА» (англ. pH-analyzer) позволяет в соответствии с цветовой шкалой индикации оценивать достаточно окрашенные участки тест-полоски.

Интерфейс программы представлен на рис. 14, а результат оригинальной методики цифрового измерения рН слезы с помощью тест-полоски - на рис. 15.

Оценку результатов осуществляли через 1-4 мин. после проведения манипуляции с тест-полоской. В течение этого времени окрашивание индикаторной полоски было стабильным, что было подтверждено при разработке методики многократным последовательным анализом активированных тест-полосок.

Калибровка результатов измерений была проведена при помощи стандартных буферных растворов с рН 7,01 и 6,86; воспроизводимость измерений по максимальному разбросу значений составила АрН = 0,024. Рисунок 14. Интерфейс программы «РНА» для анализа рН лакмусовых тест-полосок с пробами слезы

Исходно кислотность измеряли, регистрируя максимальное значение рН без учета гетерогенности анализируемого материала на тест-полоске. Статистический анализ первоначальных измерений, полученных при разработке методики, выявил бимодальность распределения кислотности слезы (рис. 16). Ее характеризовали два основных максимума частоты встречаемости рН: более кислый и более щелочной, которые соответствовали (условно) свободной слезной жидкости и вязкому (слизистый) компоненту. Эти максимумы согласуются с опубликованными данными о среднем значении кислотности (табл. 5): значения рН свободной слезной жидкости практически соответствуют измерениям, указывающим на более кислый характер слезы, а значения рН слизистого компонента слезы соответствует более щелочным измерениям. Гетерогенность сред конъюнктивальной полости может являться одной из причин такой вариабельности данных, полученных исследователями ранее. Возможно, некоторые из авторов методологически не получали значения рН, соответствующие одной из выявленных в нашем исследовании мод. Результаты, полученные исследователями ранее в пользу более щелочного уровня рН, можно объяснить внедрением микроэлектродов в подлежащие ткани конъюнктивы и ответным рефлекторным слезоотделением на их механическое раздражение.

Разработанная методика рН-метрии позволяет измерять кислотность с учетом гетерогенного характера слезы: изолировано оценивать уровень рН как свободной слезной жидкости, так и более вязкого компонента слезы. Вязкий компонент обнаруживали не во всех образцах, что, возможно, связано с долей вероятности его фиксации на тест-полоске.

Уровень рН вязкого компонента существенно превышает таковой свободной слезной жидкости (слабощелочная и слабокислая реакция, соответственно), а достоверность различий позволяет говорить о принципиальной разнице между рН разнородных сред слезы в конъюнктивальнои полости ([/-тест Манна-Уитни, р 0,05). Тест-полоска с двумя компонентами слезы представлена на рис. 17.

Так, в отличие от рН-метрии с использованием стеклянных микроэлектродов лакмусовая проба дает представление не только о максимальных зарегистрированных в конъюнктивальнои полости значениях кислотности, но и о распределении значений рН в пределах тест-полоски.

Особенности возрастного состава обследуемых пациентов могут быть причиной вариабельности представленных в доступной литературе данных о кислотности слезы здоровых лиц. Статистический анализ полученных в настоящей работе результатов показал, что кислотность свободной слезной жидкости не зависит от возраста, тогда как кислотность вязкого компонента с возрастом меняется (результаты корреляционного анализа по группам представлены ниже). Линейный тренд рН распределения свободной слезной жидкости позволяет говорить о средних величинах этого параметра и применять классические методы статистического анализа (гистограммы распределения этого параметра по группам представлены ниже). Достоверных отличий в распределении рН свободной слезной жидкости между пациентами, в образцах которых было наличие вязкого компонента, и теми, у кого он отсутствовал, не было выявлено (результаты статистического анализа представлены по группам ниже).

Корреляция кислотности вязкого компонента слезы с возрастом заключается в том, что с возрастом происходит повышение этого параметра. Таким образом, определение средних значений кислотности вязкого компонента в выборке, а также описание результатов классическими статистическими методами не являются корректным, и анализ этого параметра необходимо осуществлять только с учетом возраста пациента.

Оригинальная методика рН-метрии слезы

Логарифмическое преобразование шкалы возраста по оси абсцисс позволяет построить линейную функцию зависимости рН вязкого компонента от возраста, а также после свертки провести дополнительный корреляционный анализ рН вязкого компонента слезы с возрастом (линейный коэффициент корреляции Пирсона, г = -0,488, р 0,001). Функцию свертки по возрасту описывает уравнение f(x) = -0,25 Іп(возраст) 103 Результаты линейного корреляционного анализа подтверждают правильность и достоверность логарифмической природы возрастной динамики кислотности вязкого компонента слезы.

Как видно на рис. 25 и 26, в относительно молодом возрасте кислотность вязкого компонента слезы при КК существенно превышает таковую в норме; к 40-50 годам эта разница исчезает.

Сравнение кислотности вязкого компонента слезы в исследуемой и контрольной группах представлены в табл. 16.

Описание результатов статистического анализа кислотности вязкого компонента слезы классическими статистическими методам не является корректным; анализ этого параметра следует осуществлять с учетом возраста пациента.

Отсутствует корреляция кислотности свободной слезной жидкости и вязкого компонента слезы при КК (коэффициент ранговой корреляции Спирмена, соответственно, р 0,05,) с рефракцией роговицы (максимальная преломляющая сила роговицы Steep SimK по данным кератометрии «Galilei G4») (г = -0,192 и г = 0,028, соответственно), со степенью роговичного астигматизма (ASimK по данным кератометрии «Galilei G4») (г = -0,089 и г = -0,103, соответственно) и с индексами иррегулярности роговицы (на примере CLMI по данным «Galilei G4») (г = 0,069 и г = и г = -0,147, соответственно).

Также не выявлено достоверных отличий в кислотности свободной слезной жидкости и вязкого компонента слезы между пациентами, у которых было выявлено наличие кольца Флейшера, и теми, у кого оно отсутствовало ([/-тест Манна-Уитни, р 0,05). По-видимому, это связано с тем, что упомянутые показатели скорее характеризуют степень тяжести КК, нежели активность патологического процесса.

Была выявлена положительная корреляционная связь между результатами кератопахиметри и кислотностью свободной слезной жидкости при КК (коэффициент ранговой корреляции Спирмена, г = 0,526, р 0,05). Взаимосвязь между толщиной роговицы и кислотностью свободной слезной жидкости представлена на рис. 27. Корреляция между результатами кератопахиметрии и кислотностью вязкого компонента слезы при КК (коэффициент ранговой корреляции Спирмена, г = -0,067, р 0,05) отсутствует.

В результате настоящего исследования выявлена корреляция кислотности вязкого компонента слезы с возрастом пациентов, что можно рассматривать как естественное физиологическое изменение, происходящее в организме человека по мере его старения.

Известно также, что с возрастом происходят изменения и в кислотно-основном состоянии организма человека - в частности, закисление внутренней среды [122]. Ранее в специальной литературе сообщалось о физиологической изменчивости параметров слезы в зависимости от возраста. С увеличением возраста обследуемых пациентов отмечают снижение функциональных показателей слезной пленки: уменьшается рефлекторная слезопродукция, снижается общий объем слезы, нарушаются динамические параметры слезной пленки, уменьшается секреция мейбомиевых желез, увеличивается испаряемость слезы, возрастает осмолярность слезной жидкости, уменьшается время разрыва слезной пленки [104, 176]. Тем не менее, в доступной литературе отсутствуют данные о возрастной изменчивости кислотности слезы.

Настоящее исследование показало, что кислотность слезы, а именно ее вязкого компонента, является одним из изменяющихся с течением возраста параметров гомеостаза глазной поверхности. По мере увеличения возраста пациентов происходит физиологическое увеличение кислотности (уменьшение рН) вязкого компонента слезы.

Выявленное повышение рН вязкого компонента слезы при КК по сравнению с нормой может быть как следствием деструктивных процессов в роговице при КК (распад протеинов с образованием аммонийных соединений), так и причиной предрасположенности молодого населения к развитию КК (низкий уровень кислотности в молодом возрасте может быть фактором, предрасполагающим к развитию патологического процесса).

В резульатате осмометрии слезы при КК были получены следующие данные: осмолярность варьировала в диапазоне 275-306 мОсм/л, в среднем составляя 282,12 ± 8,62, мода - 275 мОсм/л.

Результаты статистической обработки полученных при измерении осмолярности слезы данных у пациентов с КК свидетельствуют о возрастной изменчивости этого параметра (коэффициент ранговой корреляции Спирмена, г = 0,526,/? 0,05), что отражено на рис. 28.