Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы .17
1.1 Регенерация и дисрегенерация .17
1.1.1 Методы стимуляции регенерации в биологии и медицине 23
1.1.2 Применение биоматериалов для ускорения регенерации тканей. Плацента, её состав, свойства, возможность применения в качестве биоматериала 26
1.2 Методы интенсивного внешнего воздействия для изменения биофизических свойств материалов 31
1.3 Применение нанотехнологии в стимуляции регенерации повреждённых тканей .34
1.4 Методы исследования биологических объектов на наноразмерном уровне .40
1.5 Особенности морфологии склеры .43
Глава 2. Материалы и методы исследования 53
2.1 Дизайн исследования .53
2.2 Методы доэкспериментальных исследований .54
2.2.1 Методика получения нанодисперсного материала 56
2.2.2 Методика приготовления биоимплантата для экстрабульбарного применения 57
2.2.3 Методы исследования нанодисперсного материала 61
2.3 Методы экспериментальных исследований 63
2.3.1 Клинические методы исследования животных после экстрабульбарного введения биоимплантата .66
2.3.2 Методы исследования морфологии биологических эффектов применения биоимплантата экстрабульбарно .67
2.3.3 Методы исследования регенеративной активности соединительнотканных структур глаза животного 71
2.3.4 Биомеханические методы исследования 74
2.3.5 Статистические методы исследования .77
Глава 3. Результаты приготовления нанодисперсного материала. Оценка его структуры и технологии имплантации в эксперименте 79
3.1 Методика получения нанодисперсной плаценты 80
3.2 Биофизические свойства и структура порошка нанодисперсной плаценты в сравнении с крупнодисперсным аналогом 89
3.3 Биофизические свойства порошка нанодисперного титана .95
3.4 Технология имплантации нанодисперсной плаценты в эксперименте 98
3.4.1 Технология изготовления биоимплантата на основе фрагмента сосуда пуповины и нанодисперсной плаценты для экстрабульбарного введения 98
3.4.1.1 Морфологические исследования структурно-функциональных изменений тканей глаза в зоне введения биоимплантата с нанодисперсной плацентой .99
3.4.1.2 Морфологические исследования структурно-функциональных изменений тканей глаза в зоне введения биоимплантата с нанодисперным титаном 104
3.5.1 Технология введения нанодисперсной плаценты инъекционно 107
3.5.2 Результаты исследования степени регенеративной активности тканей глазного яблока в зависимости объёмов введения нанодисперсной плаценты 109
3.5.2.1 Клиническая оценка введения суспензии нанодисперсной плаценты в эксперименте .109
3.5.2.2 Морфологические исследования степени регенеративной активности тканей глазного яблока в зависимости объёмов введения нанодисперсной плаценты 110
Глава 4. Экспериментальные исследования введения биомплантата с нанодисперсной плацентой экстрабульбарно 126
4.1 Результаты экспериментальных исследований введения биоимплантата с нанодисперсной плацентой экстрабульбарно у кроликов 127
4.1.1 Клиническая оценка введения биоимплантата с нанодисперсной плацентой в эксперименте 127
4.1.2 Морфологические исследования тканей глаза животного в зоне введения биоимплантата с нанодисперсной плацентой с оценкой биологических эффектов и глубины её распространения 129
4.1.3 Морфологические исследования тканей глаза животного в зоне введения биоимплантата с нанодисперсной плацентой с оценкой степени трофического обеспечения 179
4.1.4 Морфологические исследования соединительной ткани глазного яблока кролика в зоне введения биоимплантата с нанодисперсной плацентой с оценкой степени участия клеток мезенхимального происхождения 186
Глава 5. Результаты экспериментально-морфологического исследования регенеративных процессов в тканях глаза животного при имплантации нанодисперной плаценты 201
5.1 Результаты экспериментальных исследований введения биоимплантата с нанодисперсной плацентой у крыс 201
5.1.1 Клиническая оценка введения биоимплантата с нанодисперсной плацентой в эксперименте .202
5.1.2 Морфологические исследования степени регенеративной активности тканей глазного яблока крысы в зоне введения биомплантата с нанодисперсной плацентой .203
5.1.3 Морфологические исследования степени регенеративной активности многослойного эпителия конъюнктивы глаза крысы над зоной хирургической манипуляции 235
Глава 6. Результаты биомеханических исследований склеры .247
Заключение .253
Выводы .263
Практические рекомендации .265
Список сокращений .266
Список литературы .267
- Регенерация и дисрегенерация
- Методика получения нанодисперсной плаценты
- Морфологические исследования тканей глаза животного в зоне введения биоимплантата с нанодисперсной плацентой с оценкой биологических эффектов и глубины её распространения
- Морфологические исследования степени регенеративной активности многослойного эпителия конъюнктивы глаза крысы над зоной хирургической манипуляции
Регенерация и дисрегенерация
С глубокой древности людям были знакомы явления регенерации. Термин «регенерация» был предложен ещё в 1712 году французским учёным Р. Реомюром, изучавшим регенерацию конечностей речного рака. Регенерация (от лат. regeneratio - возрождение, возобновление) - это способность живых организмов со временем восстанавливать повреждённые ткани, а иногда и целые потерянные органы. Короткова Г.П. (1997) даёт такое определение данного явления: "... регенерация - это восстановительный морфогенез, имеющий всегда многоуровневый характер и варьирующий по своим механизмам в зависимости от специфики, степени и локализации повреждения, а также от стадии индивидуального развития и сложности организации особи...". Доподлинно известно, что обновление структур организма может осуществляться как в процессе жизнедеятельности (физиологическая регенерация), так и в результате их утраты при патологических процессах (репаративная регенерация) [16, 119-121, 212, 213]. При этом регенераторный процесс может наблюдаться как в естественных условиях, так и в эксперименте.
В большей степени регенерация присуща растениям и беспозвоночным животным, в меньшей - позвоночным. Известно, что у многих беспозвоночных возможна регенерация целого организма из кусочка тела. У большинства видов губок, гидроидных полипов, многих видов плоских, ленточных и кольчатых червей, мшанок, иглокожих и оболочников из небольшого фрагмента тела может регенерировать целый организм. Так, например, губку можно измельчить на отдельные кусочки, даже клетки, пропустив через сито, затем поместить их в воду и тщательно перемешать, разрушив их межклеточные связи. Спустя некоторое время клетки воссоединяются друг с другом путём «узнавания», и губка при этом практически полностью восстанавливается [104, 105].
Моллюски, членистоногие и позвоночные животные не способны регенерировать в целую особь из отдельного фрагмента, однако у многих из них происходит восстановление утраченного органа. Так, при изучении тритонов и аксолотля, установлено, что при регенерации у этих животных происходит «вспоминание» своего эмбрионального прошлого (рекапитуляция эмбриогенеза). Тритоны и аксолотль заново включают генетические программы, активизирующие так называемые Нох-гены, которые дают команду организму развиваться по определённому плану, при этом у животного отрастает утраченная часть тела – нога или хвост [57, 413, 439].
Птицы и млекопитающие как эволюционно наиболее развитые животные менее других способны к регенерации органов. Однако и у них наблюдается регенерация тканей: у птиц возможно замещение перьев и некоторых частей клюва, а млекопитающие могут восстанавливать покров, когти и частично печень, и они способны к заживлению ран. У высокоорганизованных млекопитающих и у человека не регенерируют целые наружные органы, а внутренние органы, такие как мышцы, кости, кожа и другие ткани способны к регенерации, которую исследователи изучают на органном, тканевом, клеточном, субклеточном и молекулярном уровнях [60, 99, 154, 210, 212, 213, 328, 338, 346, 362, 384, 389].
У высокоорганизованных животных регенерация может происходить путём роста тканей на раневой поверхности, перестройки оставшейся части органа в новый или путём роста остатка органа без изменения его формы [119, 120, 182-184, 216, 322].
Различают физиологическую и репаративную регенерацию. К физиологической регенерации относят непрерывное обновление структур на клеточном (смена клеток крови, эпидермиса и др.) и внутриклеточном уровнях (обновление клеточных органелл на молекулярном и ультраструктурном уровне), которым обеспечивается непрерывное функционирование тканей, органов и систем органов [44, 211, 212, 229, 230]. Физиологическая регенерация способствует структурному приспособлению организма к повседневным влияниям окружающей среды [44, 119, 120, 336, 470]. При повреждениях тканей в результате воспалительных процессов, травм и других патологических состояниях, которые сопровождаются массовой гибелью клеток, восстановление тканей происходит за счёт репаративной регенерации [211, 212, 214, 228, 461]. Репаративная регенерация – это процесс ликвидации структурных повреждений на всех уровнях организации после действия патогенных факторов.
Оба вида регенерации не являются обособленными процессами: они параллельно протекают в организме, тесно взаимосвязаны. Так, репаративная регенерация формируется на базе физиологической, то есть на основе тех же, лежащих в основе последней, механизмов, и отличается большей интенсивностью проявлений. Поэтому репаративную регенерацию следует рассматривать как нормальную реакцию организма на повреждение, характеризующуюся резким усилением физиологических механизмов воспроизведения специфических тканевых элементов того или иного органа. При этом в ходе репаративной регенерации включаются дополнительные механизмы, способствующие ускорению клеточного обновления [208-210].
Восстановление исходной части органа после его повреждения осуществляется различными путями. Если в процессе репаративной регенерации утраченная часть замещается равноценной специализированной тканью, говорят о полной регенерации (реституции - restitutio ad integrum). Если на месте дефекта разрастается неспециализированная соединительная ткань, то есть заживление идет посредством рубцевания - о неполной регенерации (субституции - substitutio). В последнем случае иногда функция органа восстанавливается за счёт интенсивного новообразования ткани (аналогичной погибшей) в неповреждённой части органа. Это новообразование происходит путём либо усиленного размножения клеток, либо за счёт внутриклеточной регенерации - восстановления субклеточных структур при неизменённом числе клеток (сердечная мышца, нервная ткань) [154, 155, 184, 212, 461].
При всём полиморфизме репаративной регенераторной реакции высших животных и человека механизм репаративной регенерации эволюционно основан на механизме физиологической регенерации [99]. В одних и тех же органах как физиологическая, так и репаративная регенерация проявляется на всех уровнях: тканевая, клеточная (митоз, амитоз) и внутриклеточная. В тканях, где размножение клеток отсутствует (нервная ткань, миокард), структурной основой нормализации их функции служит исключительно внутриклеточная регенерация. Следовательно, последняя является универсальной формой регенерации, свойственной всем органам без исключения. Именно это звено регенераторной реакции представляет собой тот универсальный механизм, различные комбинации которого составляют структурную основу компенсаторных процессов, по-разному называемых, но имеющих одну сущность и направление - обеспечение постоянства внутренней среды организма и динамического равновесия с внешней средой.
Считается, что репаративная регенерация развивается после наступления патологических процессов, таких как дистрофические, некротические и воспалительные изменения [310]. Однако такое бывает не всегда. Чаще, после воздействия патогенного фактора, запускаются механизмы восстановления, направленные на компенсацию убыли структур в связи с их внезапным ускоренным расходованием или гибелью, что представляет по существу репаративную регенерацию.
Как физиологическая, так и репаративная регенерация в основе содержит две фазы восстановительного процесса: фазу пролиферации – размножения камбиальных клеток и фазу созревания, когда пролиферирующие камбиальные клетки дифференцируются в зрелые элементы. В отношении источников регенерации в настоящее время существует две точки зрения. Согласно одной из них, теории резервных клеток, происходит пролиферация камбиальных, незрелых клеточных элементов (стволовых клеток и клеток-предшественников), которые интенсивно размножаясь и дифференцируясь восполняют убыль высокодифференцированных клеток органа, обеспечивающих его специфическую функцию [49, 50, 51, 147]. Другая теория предполагает, что источником регенерации могут быть также высокодифференцированные клетки, которые в условиях патологического процесса могут перестраиваться, утрачивать часть своих специфических органелл и одновременно приобретать способность к пролиферации и дифференцировке [6, 220].
По сути регенерация отражает собой главный процесс, лежащий в основе всего разнообразия структурно-функциональных изменений клеток, их непрерывный распад и синтез. В общем процессе восстановления организма - морфогенезе, ярко проявляется единство воспаления, регенерации и фиброза, которые по существу являются неразрывными компонентами целостной тканевой реакцией на повреждение. Весь процесс представляет динамическую саморегулирующую систему [212, 257, 258]. Срыв гомеостатических механизмов ауторегуляции (межклеточные и межтканевые взаимодействия, гуморальный, иммунный, нейротрофический) ведет к нарушению и извращению стереотипной динамики процесса, разобщению воспаления и регенерации, неадекватному фиброзу. Процесс теряет адаптивный характер и переходит в «дисрегенерацию». Это понятие близко понятию патологической регенерации (гипо- или гиперрегенерация), но не идентично ему. Понятие «дисрегенерация» шире патологической регенерации, главное в нём – появление нового качества в виде тканевой атипии. Дисрегенерацию следует рассматривать как результат срыва адаптивной воспалительно-репаративной реакции. Поэтому дисрегенерация, возможно, причастна к формированию как тканевой дисплазии, так и метаплазии.
Методика получения нанодисперсной плаценты
По данным литературных источников, деформационно стимулированные структурно-химические изменения органических веществ разделяются на 2 группы. Процессы первой группы связаны с разрывом и формированием внутримолекулярных ковалентных связей (распад молекул, оксидирование и гидролиз). Вторая же группа включает такие процессы, как разупорядочение, аморфизация и полиморфные переходы кристаллических решеток веществ, конформационные превращения в составляющих решётки молекулах, как правило, происходящие с разрывом и образованием более слабых межмолекулярных связей [293, 329, 377, 424, 428].
Однако, несмотря на значительное количество работ в этой области, далеко не всегда можно заранее прогнозировать превращения конкретных органических веществ под действием деформации. Поэтому всегда возникает вопрос о дозе подводимой энергии, которая напрямую воздействует на органическое вещество. Из анализа данных о количестве подведённой механической энергии при деформации известных лекарственных препаратов показано, что доза воздействия не должна превышать 100 кДж/г, так как при увеличение мощности дозы подводимой энергии происходит необратимое изменение химического и молекулярного состава исходного лекарственного вещества [39, 41, 83, 127]. При этом агрегатное состояние вещества значительно изменяется при подведённой механической энергии в интервале от 0,16 до 10 кДж/г. Поскольку дальнейшее увеличение механической энергии приводит к превалированию процессов агломерирования над измельчением, увеличивая не только размеры агломератов, но и их плотность и диффузионные силы удержания агрегатного состояния, было выбрано время измельчения в шаровой планетарной мельнице длительностью 15, 30, 60 и 120 минут, что соответствовало подведённой механической энергии менее 15 кДж/г. Полученные после механоактивации плаценты спектры поглощения методом инфракрасной спектроскопии (Рисунок 6) показывали, что они практически идентичны, за исключением небольшого перераспределения интенсивностей полосы в области больших волновых чисел. Изменение соотношения интенсивностей сигнала нанодисперсной плаценты в области 3000 – 3500 см-1 свидетельствовали о деструкции как внутримолекулярных, так и межмолекулярных водородных связей в процессе механообработки в молекуле коллагена. При механоактивации в течение 15-30 минут происходило освобождение ионов водорода вследствие разрыва межмолекулярных ковалентных сшивок [23], образованных в поперечном направлении между молекулами коллагена группами лизина, аллизина, гидроскилизина и гидроксиаллизина, как представлено на схеме (Рисунок 7).
При длительности механоактивации в течение 60 минут происходило дополнительное разрушение водородных связей между полипептидными цепочками внутри молекулы тропоколлагена, образованными, как правило, гидроксипролином (Рисунок 8а). Разрыва же самой полипептидной цепи в молекуле тропоколлагена на отдельные аминокислотные звенья не происходило, а зерно нанодисперсной плаценты после механоактивации представляло отдельную полипептидную цепочку молекулы тропоколлагена, свёрнутую в пространстве в виде глобулы и имеющую размеры от 40 до 100 нм (Рисунок 8б).
При механоактивации порошка плаценты в течение 15-30 минут АСМ-методом установлено, что происходила диспергация вещества плаценты с образованием пластинчатых частиц размером 100-200 нм (Рисунок 9). Однако из литературных источников известно, что склера как плотноволокнистая соединительная ткань, состоящая из плотноупакованных коллагеновых волокон, имеет поры размерами 100-200 нм [391], объединённые между собой в систему каналов, заполненных водой и способных пропускать через склеру различные вещества методом диффузии, а также под воздействием электро- или ионофореза [275, 314, 337, 434, 454]. Поэтому следует предположить, что пластинки нанодисперсной плаценты размерами 100-200 нм будут плохо проникать в поры склеры такого же диаметра. В связи с этим время механоактивации 15 и 30 минут не было взято за основу в настоящем исследовании.
Атомно-силовая микроскопия, метод отображения рельефа
Разрушение разрыва водородных связей между полипептидными цепями в молекуле тропоколлагена при механоактивации косвенно подтверждали и данные рентгеновской дифракции (Рисунок 10). Изменение интенсивности пика в углах до 15 градусов для аморфных материалов свидетельствовали о разрушении среднего порядка в материале.
При механоактивации в течение 60 минут оценка размеров частиц АСМ-методом показала, что порошок нанодисперсной плаценты состоял из отдельных зёрен размером от 40 до 100 нм, которые образовывали за счёт физической адгезии частицы размером от 200 до 500 нм. Частицы же в свою очередь образовывали слабосвязанные агломераты размером от 2 до 10 мкм (Рисунок 11а, Рисунок 11б). При этом плотность агломератов порошка нанодисперной плаценты была очень низка, так как образующие их частицы были связаны только слабыми адгезионными силами и начинали разрушаться на отдельные частицы уже в процессе сканирования под иглой кантилевера после нескольких проходов. Особенно хорошо наблюдался характерный размер 40-100 нм, свойственный зёрнам частиц нанодисперсной плаценты на профилях сечения аглометатов (Рисунок 12).
При механоактивации в течение 60 минут и подведенной удельной энергии менее 15 кДж/г происходило нагревание вещества порошка плаценты до 60 0С, что в свою очередь приводило к денатурации коллагена – основного белка плаценты, повышало его «хрупкость» и облегчало его дальнейшую диспергацию до первичной структуры [102].
По данным эмиссионной спектроскопии суммарное содержание примесных элементов после 60 минут не превышало 0,007 мас.% и соответствовало содержанию примесей в исходном образце, что также свидетельствовало об отсутствии загрязнения образцов. Механоактивация же плаценты в течение 120 минут приводила к возрастанию химического загрязнения только атомами железа на порядок (0,065 мас.%), что не позволяло использовать плацентарный материал с такой длительностью воздействия.
Кроме того, механоактивация плаценты в течение 120 минут приводила к формированию плотных агломератов нанодисперсной плаценты, связанных наряду со слабыми адгезионными силами прочными диффузионными. В этом случае, рассматриваемые агломераты по прочности и плотности можно назвать агрегатами, что затрудняло их распад при введение в операционное поле, и наностуктурный материал вел себя как частицы крупнодисперсного аналога (более 20-30 мкм), применение которого было изучено другими авторами [144, 156].
Экспериментальным путём установлено, что оптимальное время получения нанодисперсной плаценты методом механоактивации является 60 минут с подведённой при этом удельной энергией менее 15 кДж/г, поскольку при данном времени механоактивации получаются зёрна нанодисперной плаценты размерами в 40-100 нм, что предположительно позволило бы им проникать в поры склеры размером 100-200 нм [391], а коллагеновое волокно плаценты разделяется на отдельные полипептидные цепочки.
Морфологические исследования тканей глаза животного в зоне введения биоимплантата с нанодисперсной плацентой с оценкой биологических эффектов и глубины её распространения
В ранние сроки после введения биоимплантата экстрабульбарно на 3-и сутки во всех рассматриваемых группах животных наблюдалась умеренная воспалительная инфильтрация зоны оперативного вмешательства, которая была более выражена в опытных группах животных и в первой контрольной группе. Лейкоцитарные клетки были представлены популяциями мононуклеаров моноцитарно-макрофагического и лимфоцитарного ряда. В обеих опытных группах биоимплантат полностью сохранялся, также сохранялся биомплантат, представленный фрагментом отрезка сосуда пуповины во второй опытной группе. Наблюдалось набухание оболочки биомплантата в опытных группах и первой контрольной группе, а также иммиграция в неё клеток реципиента. При этом наблюдалось проникновение 130 в оболочку биоимплантата клеток как лейкоцитарного ряда (моноцитов и лимфоцитов), так и единичных фибробластов и эндотелиоцитов.
На 7-е сутки во всех рассмотренных случаях в обеих опытных группах и в первой контрольной группе биомплантат сохранялся (Рисунок 44, Рисунок 45, Рисунок 46). Отмечалась умеренная воспалительная инфильтрация как стенки биоимплантата в первой опытной группе, так и окружающей конъюнктивы и подконъюнктивальной основы. Это проявлялось в лимфоцитарно-моноцитарных клеточных ответах, умеренной инфильтрации мононуклеарами тканей прилежащей склеры и конъюнктивы, появлении отдельных лейкоцитов в стенке и в содержимом биомплантата. При этом во второй опытной группе, как и в первой контрольной группе, проявления клеточных реакций были менее выражены в окружающей биомплантат соединительнотканной основе. Во второй контрольной группе признаки клеточной инфильтрации конъюнктивы в зоне хирургической манипуляции были минимальны (Рисунок 47).
Прилегающий участок склеры реципиента в первой опытной группе характеризовался разрыхлением её собственного вещества. При этом между коллагеновыми волокнами склеры были видны нейтрофилы и лимфоциты, а также мелкие полихромно окрашенные однородного цвета массы с прослеживающейся зернистой структурой, аналогичные наблюдаемым при исследовании гистологического среза биомплантата (Рисунок 48, Рисунок 50, Рисунок 51). Такой картины в собственном веществе склеры во второй опытной группе, также как и в случае имплантации фрагмента отрезка сосуда пуповины, не наблюдалось, а клеточный ответ присутствовал только на поверхности склеры (Рисунок 49).
При микроскопическом изучении среза биоимплантата в первой опытной группе внутри фрагмента отрезка сосуда пуповины наблюдались такие же мелкие пылевидные частицы синевато-сиреневого цвета, какие наблюдались в соединительнотканных структурах глаза кролика – агломераты нанодисперсного порошка плаценты, которые не превышали 1-2 мкм в диаметре и совпадали по размеру с агрегатами исходного порошка нанодисперсной плаценты до имплантации. При анализе биоимплантата АСМ-методом сохранялась наноразмерность плаценты (Рисунок 55). Методом флуорецентной спектроскопии при изучении содержимого биоимплантата получен специфический спектр нанодисперной плаценты (Рисунок 56), который был в дальнейшем взят в качестве контроля при оценке глубины распространения биологического материала в собственное вещество склеры глаза реципиента.
При рассмотрении содержимого биомплантата на конфокальном изображении выявлялись поверхностные характеристики агломератов и обнаруживался глобулярный (размером до 2 мкм) характер их организации (Рисунок 57а). Эта характеристика более наглядно выявлялась при анализе профиля этого объекта при конфокальном исследовании (Рисунок 57б). В то же время при флуоресцентной микроскопии этот же объект имел более гомогенный характер организации в силу близких химических характеристик объекта.
При анализе биологического материала плаценты во второй опытной группе обнаруживалось, что размер не повергавшегося механоактивации материала значимо превышал 50 мкм, приближаясь по размерам к надклеточным тканевым структурам (Рисунок 58).
В данные сроки наблюдения АСМ-методом (Рисунок 59) было отмечено проникновение частиц нанодисперсной плаценты в окружающую биомплантат соединительнотканную основу конъюнктивы глаза реципиента, а также сохранение её наноразмерной структуры (40-100 нм). Разволокнение поверхностных слоев склеры во второй опытной группе, их инфильтрация под биоимплантатом с крупнодисперсной плацентой не отмечались. В первой контрольной группе клеточная инфильтрация соединительнотканых структур зоны имплантации отрезка сосуда пуповины была незаначительно выражена и представлена в основном клетками моноцитарно лимфоцитарного ряда, а также отдельными фибробластами, склера была интактна. Во второй контрольной группе у ложнооперированных животных наблюдалась минимальная инфильтрация соединительнотканой основы конъюнктивы зоны хирургического вмешательства, склера также была интактна.
При изучении динамики реакций передней стенки глаза важной составляющей оценки ответов явилось выяснение динамики организации волокнистого компонента межклеточного вещества соединительнотканной основы склеры и конъюнктивы. В интактной склере распределение коллагеновых волокон носило упорядоченный характер, наблюдалось их плотное распределение в объёме межклеточного вещества, равномерный характер толщины волокон, строго упорядоченное и ясно прослеживаемое положение изотропных и анизотропных дисков, которое выявлялось по характеру жёсткости по ходу коллагеновых волокон и характеру изменения рельефа. При этом обнаруживалось, что зрелые коллагеновые волокна обладают ясно прослеживаемой поперечной исчерченностью. Периоды поперечной исчерченности для зрелых коллагеновых волокон, определённые из АСМ-изображений c помощью Фурье-анализа (Image Analysis 3, НТ-МДТ, Россия) спектральных частот, имели размеры 69-70 нм, что соответствовало аналогичному распределению анизотропных и изотропных дисков, выявляемых при помощи электронной микроскопии [378, 456]. В рыхлой соединительной ткани конъюнктивы волокна имели сетевидное распределение в объёме межклеточного вещества, при их упорядоченной макромолекулярной организации, аналогичной склере. В зоне непосредственно прилежащей к биоимплантату с нанодисперсной плацентой в первой опытной группе на 3-и и 7-е сутки волокнистый компонент межклеточного вещества нередко формировал войлокообразную структуру диаметром 0,3-0,5 мкм в первой опытной группе (Рисунок 60). Сохранённые коллагеновые волокна были разрыхленными, теряли равномерный характер толщины, менее четко различались упругие характеристики изотропных и анизотропных дисков.
Морфологические исследования степени регенеративной активности многослойного эпителия конъюнктивы глаза крысы над зоной хирургической манипуляции
Оценка степени репаративной активности многослойного эпителия конъюнктивы производилась в тех же группах экспериментальных животных (крыс), участвующих в исследовании репаративной активности непосредственно зоны имплантации биологического материала. Как уже отмечалось ранее, в первой опытной группе под конъюнктиву на склеру глаза крысы вводили биоимплантат с нанодисперсной плацентой. Во второй опытной группе вводили биоимплантат с крупнодисперсной плацентой. В первой контрольной группе имплантировали фрагмент отрезка сосуда пуповины, равный по диаметру и длине фрагмента отрезка сосуда используемого для приготовления биоимплантата. Вторая контрольная группа животных – ложнооперированные. Морфологические исследования производили через 7, 30 и 60 суток после манипуляций.
При оценке пролиферативной активности многослойного эпителия конъюнктивы глаза крысы над зоной хирургического вмешательства применяли моноклональные антитела к негистогенному белку Ki-67, который определяется в ядрах клеток во время поздней G-фазы, S, G2 и M, но не в G0-фазе клеточного цикла. Пролиферативную активность многослойного эпителия конъюнктивы глаза крысы оценивали как процент Ki-67+-клеток от общего числа клеток эпителия конъюнктивы в поле зрения равном 0,01 мм2. Изображения эпителия в первой опытной группе с введением биоимплантата с нанодисперсной плацентой в разные сроки экспериментального исследования представлены на Рисунке 149, Рисунке 150 и Рисунке 151.
Изображения эпителия во второй опытной группе при введении биоимплантата с крупнодисперсной плацентой в расзные сроки экспериментального исследования представлены на Рисунке 153, Рисунке 154 и Рисунке 155.
Изображения эпителия в первой контрольной группе при имплантации фрагмента отрезка сосуда пуповины без наполнения его плацентой представлены на Рисунке 155, Рисунке 156 и Рисунке 157.
Изображения эпителия в контрольной группе при проведении хирургической манипуляции без имплантации какого-либо биологического материала представлены на Рисунке 158, Рисунке 159 и Рисунке 160.
В результате проведённых исследований было установлено, что достоверно значимо усиливалась пролиферативная активность эпителия конъюнктивы глаза крысы над зоной введения биоимплантата в обеих опытных группах в сравнении с контрольной группой с введением фрагмента отрезка сосуда пуповины, не запоненного плацентарной тканью (Таблица 14). При этом индекс пролиферации высчитывался как процентное отношение количества пролиферирующих клеток в многослойном эпителии конъюнктивы глаза крысы к общему количеству клеток эпителия в поле зрения равном 0,01 мм2. Измерялась также толщина многослойного эпителия конъюнктивы над зоной хирургического вмешательства от базальной мембраны камбиального слоя до верхней границы наружных клеток. Данные представлены в Таблице 15.
Из представленных в Таблице 15 данных видно, что в обеих опытных группах достоверно увеличивалась толщина многослойного плоского неороговевающего эпителия конъюнктивы над зоной хирургического вмешательства, при этом достоверной разницы между опытными группами не отмечено. Имплантация же фрагмента отрезка сосуда пуповины без содержания в нём плаценты также приводила к утолщению многослойного эпителия конъюнктивы над зоной хирургического вмешательства достоверно в сравнении со второй контрольной группой, однако степень утолщения была значительно меньше, чем у животных в первых двух опытных группах.
Следовательно, введение биоимплантата в соединительнотканную основу конъюнктивы глаза усиливало пролиферативную активность и в многослойном плоском неороговевающем эпителии конъюнктивы над зоной имплантации, что сопровождалось достоверно значимым увеличением экспрессии Ki-67 в базальных слоях эпителия. При этом более выраженная пролиферативная активность наблюдалась при имплантации биоимплантата с нанодисперсной плацентой. Также отмечалась пролиферативная активность базального и частично шиповатого слоя эпителия, сопровождающаяся увеличением высоты клеток в пределах базальных рядов указанных структур. Всё это сопровождалось увеличением толщины эпителия, преимущественно за счёт пролиферативно активных зон со смещением регенераторно-активных клеток в поверхностные ряды многослойного плоского неороговевающего эпителия конъюнктивы глаза крысы.
Таким образом, в результате второй серии основного этапа экспериментальных методов исследования установлено, что введение биоимплантата с нанодисперсной плацентой усиливает регенеративные процессы в соединительнотканных структурах глазного яблока в 1,4 раза в сравнении с крупнодисперсным аналогом, а также индуцирует фибробластические процессы в интактной склере.