Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Эрозии и язвы роговицы. Этиология, патогенез. Современные подходы к лечению .12
1.2. Современные представления о процессах регенерации роговицы 19
1.3. Буккальный эпителий. Характеристика клеток. Анализ результатов экспериментальных и клинических исследований .25
1.4. Коллаген. Свойства ткани. Применение в медицине .31
Глава 2. Материалы и методы исследования 35
2.1. Объект исследования .35
2.2. Модель эпителиально-стромального дефекта роговицы для изучения эффективности биоконструкции с клетками буккального эпителия. 35
2.3. Разработка биоконструкции с клетками буккального эпителия 36
2.3.1. Модель биоконструкции .36
2.3.2. Культура клеток буккального эпителия 37
2.4. Подбор коллагенового матрикса для трансплантации культуры клеток 39
2.4.1. Матрикс на основе коллагена I типа .39
2.4.2. Матрикс на основе коллагена II типа 40
2.5. Серии экспериментальных исследований 42
2.6. Ограниченное клиническое исследование 44
2.6.1. Методика трансплантации комбинированной биоконструкции с аутологичными клетками буккального эпителия на поврежденную роговицу человека 45
2.7. Методы исследования .45
2.7.1. Экспериментально- клинические методы исследования .45
2.7.2. Морфологическое исследование .47
2.7.3. Офтальмологические методы исследования .48
2.8. Статистическая обработка данных .48
Глава 3. Экспериментальная разработка биоконструкции с клетками буккального эпителия на матриксе из коллагеновых материалов 49
3.1. Получение культуры клеток буккального эпителия из биоптата защечного эпителия кролика для создания биоконструкции 49
3.2. Культивирование буккального эпителия на контактных линзах. Подготовка трансплантатов 55
Глава 4. Матрикс для биоконструкции с клетками буккального эпителия на основе коллагена I типа 58
4.1. Получение матрикса на основе коллагена I типа из сухожилий кроликов .58
4.2. Оценка переносимости матрикса на основе коллагена I типа тканью роговицы 58
Глава 5. Клинико-экспериментальная и морфологическая оценка влияния клеток буккального эпителия в составе комбинированной биоконструкции на процессы регенерации эпителиально-стромального дефекта роговицы .63
5.1. Сравнительная оценка результатов лечения дефектов роговицы клетками буккального эпителия на основе двух матриксов в составе биоконструкции 63
5.1.1. Результаты наблюдения .65
5.1.2. Данные морфологического исследования 70
5.2. Оценка динамики регенерации эпителиально-стромального дефекта роговицы под влиянием клеточного компонента биоконструкции 75
5.3. Изучение эффективности лечения эпителиально-стромального дефекта роговицы кролика клетками буккального эпителия на матриксе из коллагена I типа 79
5.3.1. Результаты наблюдения .80
5.3.2. Данные морфологического исследования 86
Глава 6. Ограниченное клиническое исследование эффективности лечения дефектов роговицы аутологичными клетками буккального эпителия 98
Заключение 119
Выводы .128
Практические рекомендации .129
Список литературы 130
- Буккальный эпителий. Характеристика клеток. Анализ результатов экспериментальных и клинических исследований
- Оценка переносимости матрикса на основе коллагена I типа тканью роговицы
- Оценка динамики регенерации эпителиально-стромального дефекта роговицы под влиянием клеточного компонента биоконструкции
- Ограниченное клиническое исследование эффективности лечения дефектов роговицы аутологичными клетками буккального эпителия
Введение к работе
Актуальность проблемы. Заболевания роговицы занимают одно из
ведущих мест в мире среди причин слепоты и слабовидения и составляют
более 35% в структуре глазной заболеваемости. Значительную часть
повреждений составляют травматические поражения переднего отрезка
глаза. По данным различных авторов, более 87% пострадавших составляют
люди трудоспособного возраста и почти у каждого третьего последствия
травмы ведут к инвалидизации, что и обусловливает медико-социальную и
экономическую значимость данной проблемы в офтальмопатологии
(Гундорова Р.А. 2014, Либман Е.С., Рязанов Д.П., Калеева Э.В., 2012, и др).
Основным методом лечения патологии роговицы на сегодняшний день
остается хирургическое вмешательство на роговой оболочке — послойная
или сквозная кератопластика, аутотенонопластика, покрытие
аутоконъюнктивой, пластика амниотичекой оболочкой и т.д. (Ким А.Э.,
2009; Каспарова Е.А., Труфанов С.В. 2010; Канукова Т.А. 2014, Мороз О.В.
2014 и др.). Несмотря на активное развитие хирургической техники,
сохраняется высокая частота рецидивов после оперативного вмешательства,
отторжение и некроз трансплантата, развитие иммунологического
конфликта. Болезнь трансплантата с исходом в помутнение после
кератопластики, по данным литературы, встречается от 53 до 82%, при
рекератопластике - от 32 до 87 % случаев (Ходжабекян Г.В., 2003; Curran S.,
Murray G.I., 2000). Кроме того, на сегодняшний день трудности
кератопластики напрямую связаны с острой проблемой дефицита донорских
роговиц, а также возрастающим количеством пациентов, ожидающих
очереди на пересадку. Сохраняется высокая частота рецидивов после
хирургического вмешательства, отторжение и некроз трансплантата,
развитие иммунологического конфликта, что требует поиска альтернативных
подходов к лечению таких пациентов. В последнее время внимание
исследователей привлечено к поиску возможностей восстановления
структуры тканевых дефектов с применением клеточных технологий.
Степень разработанности темы. В офтальмологии, как и в других областях
медицины, возрастает интерес к изучению влияния стволовых клеток, как
аллогенных, так и аутологичных, культивированных вне организма, на
процессы репарации и регенерации в поврежденных тканях глаза (Гундорова
Р.А., Канукова Т.А., Капитонов Ю.А. 2014, Николаева Л.Р.
2006.; Арутюнова И.Р. 2001.; Ченцова Е.В., 2001-2015, Сапоровский С. С.
1994., Ходжабекян Г.В., Гундорова Р.А., Макаров П.В., Тверских В.В. 2003).
Большой интерес по данному вопросу, на наш взгляд, представляет
трансплантация аутологичных стволовых клеток, выделенных из
буккального эпителия взрослого человека.
Буккальный эпителий, также как и эпителий роговицы, является многослойным плоским неороговевающим. Клетки буккального эпителия сравнительно легко выделить, они хорошо пролиферируют в культуре и поэтому могут быть источником аутологичных прогениторных клеток. В 2003 году Nakamura Т. и Kinoshita S. в эксперименте продемонстрировали высокий регенераторный потенциал культивированных клеток буккального эпителия при его трансплантации на поврежденную роговицу.
Позже группа авторов (G. Priya, P. Arpitha, S. Vaishali at al, 2011) культивировали клетки буккального эпителия на амниотической мембране и затем трансплантировали пациентам с билатеральной формой лимбально-клеточной недостаточности. Расширенный иммуногистологический и морфологический анализ результатов показал высокую эффективность данного метода лечения. Подобные работы проводятся в настоящее время в различных странах мира (D. Dobrowolski, B. Orzechowska-Wylegala, B. Wowra 2015; C. Sotozono, T. Inatomi, T. Nakamura 2013; Y. Hayashida, K. Nishida, M. Yamato 2004г и др).
Несмотря на все более возрастающий интерес к использованию клеток буккального эпителия в качестве метода репаративной терапии, до настоящего времени остается нерешенным вопрос доступного и безопасного
носителя для клеток и создания биоконструкции, удобной для широкого применения в клинике.
Цель работы – разработать способ лечения дефектов роговицы различного генеза клетками буккального эпителия на коллагеновом носителе и оценить их влияние на процессы регенерации роговицы в эксперименте и в клинике.
Для достижения поставленной цели в работе определены следующие задачи:
-
Разработать методику лечения дефектов роговицы с помощью культивированных клеток буккального эпителия и технологию их применения.
-
Оптимизировать метод выделения и масштабирования клеток буккального эпителия из слизистой щеки для лечения дефектов роговицы.
-
В эксперименте провести оценку безопасности компонентов биоконструкции при лечении глубоких дефектов роговицы.
-
Оценить влияние трансплантации комбинированной биоконструкции с клетками буккального эпителия на заживление эпителиально-стромального дефекта роговицы в эксперименте.
-
Оценить эффективность лечения тяжелых ожогов роговой оболочки глаза человека аутологичными клетками буккального эпителия.
Научная новизна
-
Впервые разработан способ лечения глубоких дефектов роговицы с применением культивированных клеток буккального эпителия и разработана методика их трансплантации на биосовместимом коллагеновом носителе в составе комбинированной биоконструкции.
-
Оптимизирован метод выделения, культивирования и масштабирования клеток буккального эпителия из слизистой щеки для создания комбинированной биоконструкции.
-
Впервые на модели эпителиально-стромального дефекта показана
эффективность лечения повреждений роговицы комбинированной
биоконструкцией, содержащей культивированные клетки буккального эпителия.
-
Детальное морфологическое исследование показало стимулирующее воздействие культивированных клеток буккального эпителия в составе комбинированной биоконструкции на процессы репарации и регенерации в ходе лечения дефектов роговицы.
-
Впервые разработан и успешно опробован в клинике метод лечения дефектов роговицы аутологичными клетками буккального эпителия у пациентов с ожогами переднего отрезка глаза, тяжелыми и средней степени тяжести.
Теоретическая и практическая значимость работы
-
Впервые в офтальмологии разработан способ лечения глубоких дефектов роговицы с помощью клеток буккального эпителия на коллагеновом носителе в составе комбинированной биоконструкции. Экспериментально на модели эпителиально-стромального дефекта, а также с помощью морфологического исследования, показана безопасность и эффективность данной методики. Клетки буккального эпителия обладают стимулирующим влиянием на репаративные процессы, а также оказывают противовоспалительное действие и предупреждают образование грубой рубцовой ткани в области повреждения.
-
Впервые в офтальмологии показана клиническая эффективность лечения глубоких дефектов роговицы аутологичными клетками буккального эпителия в составе комбинированной биоконструкции у пациентов с ожогами переднего отрезка глаза.
-
Учитывая доступность аутологичного буккального эпителия, простоту получения материала, возможность постоянного поддержания его запаса в виде культуры, а также простоту способа трансплантации, предложенный метод позволит открыть новые перспективы для лечения повреждений роговицы и состояний, сопровождающихся замедлением репаративных
процессов. Использование данной методики уже на ранних стадиях заболевания позволит сократить частоту обращения к радикальной хирургической тактике.
Методология и методы исследования
Работа выполнена в дизайне экспериментально-клинического
исследования с использованием клинических, инструментальных и морфологических методов.
Положения, выносимые на защиту
-
Разработан инновационный метод лечения глубоких дефектов роговицы с помощью культивированных клеток буккального эпителия на коллагеновом носителе в составе комбинированной биоконструкции.
-
Оптимизирована методика выделения, культивирования и масштабирования клеток буккального эпителия из слизистой щеки для создания комбинированной биоконструкции.
-
Доказано (экспериментально и в клиническом исследовании), что лечение дефектов роговицы путем трансплантации комбинированной биоконструкции является эффективным, т.к. аутологичные клетки буккального эпителия в ее составе оказывают выраженное стимулирующее действие на процессы заживления дефекта роговицы.
-
Морфологические исследования показали, что применение клеток буккального эпителия обеспечивает более качественное заживление дефекта роговицы с формированием физиологической слоистости эпителиального покрова, полноценного стромального слоя, а также уменьшение количества клеток воспаления в ткани роговицы.
Степень достоверности, апробация результатов
Степень достоверности проведённых исследований определяется
достаточным объёмом выборки исследований. Работа выполнена с
использованием современных методов обследования. Методы
статистической обработки полученных результатов адекватны поставленным
задачам. Сформулированные в диссертации выводы и положения
аргументированы и логически вытекают из результатов многоуровневого анализа.
Основные положения диссертации и результаты проведенных
исследований доложены и обсуждены на научно-практических
конференциях: Российский общенациональный офтальмологический форум
«РООФ-2014» (Москва, 2014); международный съезд ассоциации
офтальмотравматологов ISOT (Сингапур, 2016) конференция с
международным участием (Москва, 2016); межотделенческая конференция ФГБУ «МНИИ ГБ им. Гельмгольца (Москва, 2018).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ в журналах, в том числе в 4 рецензируемых ВАК РФ. Получен 1 патент «Способ лечения глубоких дефектов роговицы» №2015152299 от 09.01.2017 авторы: Ченцова Е.В., Боровкова Н.В., Егорова Н.С., Макаров М.С. Конюшко О.И.
Структура и объем диссертации
Диссертация содержит 151 страницу компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 4 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы. Диссертация иллюстрирована 95 фотографиями, 5 диаграммами и 4 таблицами. Список использованной литературы содержит 220 источников, из которых 104 опубликовано в отечественных и 116 – в зарубежных изданиях.
Буккальный эпителий. Характеристика клеток. Анализ результатов экспериментальных и клинических исследований
Одним из наиболее перспективных и новаторских направлений в регенеративной офтальмологии является клеточная инженерия, направленная на создание биоинженерных конструкций для восстановления органа или его части. В мире на сегодняшний день имеются данные о возможности эффективного использования для клеточной терапии прогениторных клеток, выделенных из эпителия слизистой щеки [179,125,215].
Слизистая оболочка полости рта представлена двумя слоями:
- эпителием
-собственная пластинка, образованная соединительной тканью
- между слоями располагается базальная мембрана.
Собственная пластинка состоит из коллагеновых волокон различных типов (III,IV,V, VI), эластических и ретикулярных волокон. Этот слой обеспечивает упругость слизистой оболочке, устойчивость к сжатию и растяжению [13,14,21]
Базальная мембрана представлена светлой пластинкой, образованной из гликопротеидов (ламинином, протеогликанами), и плотной пластинкой, содержащей коллагеновые волокна различных типов (I,III,IV,VII). Базальная мембрана выполняет опорную функцию, обеспечивая надежное прикрепление эпителия к подлежащей соединительной ткани: к ней с помощью полудесмосом с одной стороны прикрепляются базальные клетки эпителия, а с другой стороны посредством якорных фибрилл - коллагеновые волокна [14]. Помимо этого, базальная мембрана способствует сохранению архитектоники эпителиального слоя, способствуя его дифференцировке, участвует в избирательном обмене веществ в ткани.
В межклеточном веществе определяются сложные надмолекулярные комплексы, состоящие из протеогликанов, гликозаминогликанов и гликопротеинов. Протеогликаны слизистой оболочки, представленные декорином, бигликаном, версиканом и синдеканом-1, связаны с дерматансульфатом (60%), гепарансульфатом и хондроитин-4-суль- фатом (10%). Гиалуроновая кислота, которая содержится в достаточно большом количестве (30%), связывает воду, ионы и обеспечивает тургор слизистой, а также выполняет защитную функцию. В формировании надмолекулярных комплексов и связывании клеток участвуют фибронектин и другие гликопротеины основного вещества. [14,91,12,155]
Эпителий слизистой оболочки полости рта представляен многослойным плоским неороговевающим эпителием, состоящим из следующих слоев: базальный, шиповатый, зернистый, роговой.
Клетки эпителиального слоя синтезируют различные цитокины, факторы роста и регуляции: ИЛ-1 и ИЛ-6, фактор некроза опухолей (TNF), колониестимулирующий фактор роста (CSF), фактор роста эпителия (EGF), трансформирующий фактор роста (TGF-3). Эти же компоненты обеспечивают иммунный ответ, воздействуют на рост и дифференцировку фибробластоподобных клеток, участвующих в регенерации эпителия. [13,14,21,91 и др]
Помимо описанных функций для клеток слизистой оболочки полости рта характерна высокая способность к регенерация и тесное взаимодействие эпителиальных клеток как между собой, так и с ВКМ.
Клетки эпителиального слоя полости рта соединены между собой различными видами контактов: десмосомы, полудесмосомы, щелевидные контакты. Щелевые соединения и десмосомы объединяют клетки слизистой оболочки в единую систему, обеспечивая быстрый и синхронный ответ на стимуляцию. Через щелевые контакты происходит также питание клеток, удалнных от кровеносных сосудов.
Клетки базального слоя содержат большое количество кератиноцтов – клеток с высокой пролиферативной активностью, обладающих к тому же высоким потенциалом к дифференцировке, являясь по сути прогениторными клетками [12,13,14,155] .
Клетки шиповатого слоя имеют многочисленные отростки, связанные между собой десмосомами. Для клеток этого слоя характерна высокая митотическая и метаболическая активность.
В зернистом слое содержатся многочисленные пучки промежуточных филаментов и два вида гранул: в гранулах I типа (кератиносомы) определяются гидролитические ферменты и липиды, которые выделяются в межклеточное вещество, где они образуют водонепроницаемый барьер, а гранулы II типа сформированы кератогиалином. В слое клеток также синтезируются белки-маркры эпителия филлагрин и трихогиалин. Совместно с кальцием и ретиноевой кислотой путм регуляции активности различных протеиназ и протеинкиназ они участвуют в процессах дифференцировки клеток. Таким способом обеспечивается целостность слизистой оболочки.
Роговой слой представлен плотно упакованными роговыми чешуйками, имеющими форму 14-гранной фигуры. Они постоянно слущиваются в наружных отделах слоя при механическом воздействии во время жевательных процессов вследствие разрушения десмосом и не участвуют в обменных процессах. Этот слой хорошо выражен на поверхности десны, щеки по линии смыкания зубов и тврдого нба [13,14.21,155 и др].
Исходя из вышеописанного, можно сделать вывод о сходстве строения эпителиальной ткани слизистой щеки и роговой оболочки глаза.
Это позволяет рассматривать буккальный эпителий в качестве культуры для создания тканеинженерных конструкций для лечения повреждений переднего отрезка органа зрения. Данную точку зрения подтверждают и результаты ряда экспериментальных и клинических исследований в мировой практике.
H. Nakamura и К. Kinoshita в 2003 году проводили экспериментальные исследования методики культивирования буккального эпителия и эффективности трансплантации его на поврежденную роговицу. Было отмечено, что данный метод лечения роговицы дает ряд преимуществ. В частности, культивированные клетки поддерживали пролиферативную активность собственной ткани без стимуляции кератинизации. Также указывается на возможность избежать применения иммуносупрессии в связи с использованием аллогенной ткани, что положительно сказывается на результатах. Особенно важно это для лиц с билатеральной формой ЛКН. Показано, что даже при небольших сроках экспозиции культивированного аллографта слизистой щеки, происходит достоверное ускорение процессов регенерации ткани, что связано с высокой клеточной активностью буккального эпителия [134,152,184 и др.].
Группа ученых Y. Hayashida, K. Nishida, M. Yamato (2004г) занималась изучением влияния трансплантата, полученного путем выращивания культуры клеток из лоскута щеки кролика, на процесс регенерации роговицы. В ходе наблюдения уже на 7 сутки в опытной группе они отмечали полную эпителизацию дефектов роговицы, значительное увеличение прозрачности ткани. К концу четвертой недели роговицы экспериментальных животных были полностью восстановлены и по внешним характеристикам ничем не отличались от здоровой ткани. В то же время в группе контроля к 7 суткам эпителизации не наблюдалось, а дефекты роговиц экспериментальных животных закрывались только к концу второй недели, причем с явлениями конъюнктивизации. Гистологическое исследование, проведенное в ходе той же работы, также выявило зачительное преимущество в динамике репаративных процессов на глазах после транплантации прогениторных клеток буккального эпителия. [181,219] Той же группой авторов в 2005г было проведено предварительное клиническое исследование, в ходе которого произведена трансплантация аутологичного тканеинженерного графта культивированных ex-vivo клеток слизистой щеки на дефекты роговиц четырех пациентов. В процессе длительного времени наблюдения отмечали выраженные улучшения процессов регенерации поврежденной ткани. Более чем через 1 год после трансплантации авторы отмечали на восстановленной роговице полное соответствие здоровой ткани по прозрачности, гладкости зеркальности и остальным характеристикам. Авторы выдвинули предположение о фенотипической модификации или трансдифференцировке клеток, полученных из слизистой щеки в клетки, близкие к корнеальному эпителию [182].
Оценка переносимости матрикса на основе коллагена I типа тканью роговицы
Для исследования переносимости матрикса на основе коллагена I типа, полученного из сухожилий кроликов методом кислотной экстракции, нами были проведены предварительные серии эксперимента.
В I предварительной серии на неповрежденную роговицу правого глаза каждого кролика укладывали часть биоконструкции, состоящую из мягкой контактной линзы и коллагена I типа, полученного методом кислотной экстракции, и проводили временную блефарорафию на 3 суток. Левый глаз оставался интактным. Экспериментальная работа проведена на 6 глазах 6 кроликов породы Шиншилла (масса 2-2,5кг). Оценку результатов эксперимента проводили на 3, 7 и 14 сутки. Общий срок наблюдения составил 14 суток.
Для оценки результатов использовали следующие критерии:
- Светобоязнь
- Гиперемия конъюнктивы
- Отек конъюнктивы
- Отек роговицы
- Наличие/отсутствие помутнения роговицы (Подробнее см. главу 2.6.) Результаты изучения переносимости тканями глаза коллагена I типа, полученного методом кислотной экстракции.
При помещении коллагена I типа на роговицу у кроликов на 50% глаз наблюдали инъекцию бульбарной конъюнктивы, обильное слизистое отделяемое на 3 сутки, отек роговицы 2 и 3 степени на 3-7 сутки; помутнение различной степени выраженности, на 7-14 сутки (рис. 10, табл. 1).
Таким образом, примесь уксусной кислоты в коллагеновом матриксе, используемая в качестве растворителя коллагена в стандартной методике его получения, оказывала агрессивное воздействие на роговицу кролика.
В связи с вышесказанным, было принято решение о модификации способа получения матрикса на основе коллагена I типа с дополнительным снижением концентрации уксусной кислоты.
Для снижение кислотности геля коллагена было решено провести его лиофилизицию. Снижение кислотности при этом достигается за счет испарения влаги из биоматериала. В качестве сырья использовали 5% гель коллагена, который после предварительного замораживания при температуре минус 80оС помещали в лиофильную сушку. Однако полученный после лиофилизации коллагеновый матрикс обладал выраженным запахом уксуса, в связи с чем принято решение о продолжении модификации.
Для дополнительного снижения кислотности было решено предварительно развести коллагеновый гель стандартным водным раствором хлоргексидина 0,05% и затем лиофилизировать. Раствор коллагена 1 типа кролика смешивался в равных объемах со стандартным водным раствором хлоргексидина до достижения уровня pH=6,8 и лиофилизировали в лиофильной сушке, что дополнительно способствовало снижению кислотности материала. В результате получали губку из коллагена I типа толщиной 1-2 мм, не имевшую запаха уксуса.
Для оценки переносимости тканью роговицы коллагенового матрикса на основе коллагена I, полученного с дополнительных снижением концентрации уксусной кислоты, проводили II предварительную серию эксперимента на 6 глазах 6 кроликов породы Шиншилла (масса 2-2,5кг). Срок наблюдения 14 суток.
Результаты изучения переносимости тканями глаза коллагена I, полученного методом кислотной экстракции с дополнительным снижением концентрации уксусной кислоты.
Из коллагена I типа, полученного методом кислотной экстракции с дополнительным снижением концентрации уксусной кислоты, выкраивали круги диаметром 10 мм, которые затем накладывали на интактную роговицу кролика, сверху помещали контактную линзу. Проводили временную блефароррафию на 3 дня.
В течение всего периода наблюдения (14 дней) конъюнктива оставалась спокойной у всех животных, роговица прозрачная, гладкая, блестящая.
Таким образом, токсического или раздражающего действия коллагена I типа № 2 не наблюдалось (рис. 11).
Таким образом, установлено, что коллаген 1-го типа, полученный методом кислотной экстракции с дополнительным снижением концентрации уксусной кислоты, является безопасным для использования на тканях переднего отрезка глаза. Этот вид коллагенового матрикса и кератопротектор коллагеновый Аппликолл, на основе коллагена II типа нетоксичны для клеток (см. главу 3). Клетки буккального эпителия хорошо адгезируют на данных видах подложек, и могут быть полностью донесены до места применения. Исходя из вышесказанного, можно сделать вывод о пригодности данных коллагеновых материалов для создания биоконструкций.
Оценка динамики регенерации эпителиально-стромального дефекта роговицы под влиянием клеточного компонента биоконструкции
Данная серия экспериментальной работы проводилась на 6 кроликах породы Шиншилла (12 глаз). Срок проведения экспериментальной работы 30 суток.
Для оценки влияния клеточного компонента биоконструкции на регенерацию эпителиально-стромального дефекта роговицы (подробное описание операционного процесса кератэктомии см. в главе 2.2.) все лабораторные животные были разделены на 2 группы: на 6 правых глазах после кератэктомии укладывали биоконструкцию на матриксе из коллагена I типа с клетками буккального эпителия (опытные глаза), на 6 левых глазах применяли биоконструкцию с коллагеновым матриксом без клеток (контрольные глаза).
В ходе работы проводилось ежедневное наблюдение, фиксировались основные клинические данные на 3, 7, 14 и 30 сутки после кератэктомии.
После снятия швов с век (3 сутки наблюдения) на всех глазах наблюдалось сокращение величины дефекта, по сравнению с исходными значениями. Кроме того, отмечали клинические признаки воспаления: гиперемия конъюнктивы, слизистое отделяемое в количестве от скудного до умеренного, а также отек роговицы 2 степени. При этом, после лечения биоконструкцией с клетками на опытных глазах средняя величина дефекта роговицы составила 23,68±0,28мм, на контрольных глазах (коллагеновый матрикс без клеток) – 29,5±0,3мм (рис.23 а, б). При анализе результатов выявлено, что разница между полученными данными не является статистически значимой. Однако, при макроскопическом анализе отмечено, что новообразованный эпителий в контрольной группе (без клеток) выглядел значительно более рыхлым по сравнению с опытом.
На 7е сутки после применения биоконструкции с клетками буккального эпителия наблюдалась полная эпителизация дефекта роговицы в опытной группе (рис.24 а). В тоже время отмечали отек роговицы 1-2 степени, соответствующий области кератэктомии, который купировался к 14 суткам. На контрольных глазах, при лечении биоконструкцией без клеток – эрозия сохранялась, ее площадь сократилась до 0,71мм, также имел место отек роговицы 1-2 степени (рис.24 б).
На 14 сутки на всех глазах в опыте, и на 5 глазах из 6 в контроле прокрашивание дефекта роговицы флуоресцеином отсутствовало, что свидетельствовало о полной эпителизации. В одном случае в контрольной группе сохранялся дефект размером 0,071мм (рис.25). Отек роговицы 1 степени сохранялся на 3 глазах в опыте и на 5 в контроле.
К 30 суткам на всех глазах обеих групп прокрашивание флуоресцеином отсутствовало, воспалительные явления в виде отека роговицы полностью купированы. Следует отметить, что в опытной группе на месте дефекта роговицы наблюдалось формирование более нежного помутнения (3-4 балла по Войно-Ясенецкому) по сравнению с контролем (6-8 баллов).
Исходя из полученных в эксперименте данных, можно сказать о более быстром заживлении дефекта (в среднем на 7 суток) при использовании биоконструкции с клетками буккального эпителия (рис. 26, Таблица 3), а также формировании более нежной рубцовой ткани в отдаленные сроки. Таким образом, можно сделать вывод о стимулирующем воздействии клеток буккального эпителия на заживления дефекта. Такой эффект, на наш взгдяд, связан с высокой секреторной активностью прогениторных клеток, сопровождающейся выработкой большого количества репаративных факторов: цитокинов, факторов роста, оказывающих положительное влияние на заживление дефекта роговицы.
Ограниченное клиническое исследование эффективности лечения дефектов роговицы аутологичными клетками буккального эпителия
Целью регенеративной медицины является функциональное восстановление поврежденных тканей с помощью клеточных популяций, вводимых в организм отдельно или совместно с бионосителями.
Учитывая доказанное в доклиническом исследовании положительное воздействие созданной нами биоконструкции с клетками буккального эпителия на регенерацию роговицы после ее повреждения, было принято решение провести ограниченное клиническое исследование. Клиническая апробация данной методики лечения разрешена Комитетом по этике ФГБУ «Московский научно-исследовательский институт глазных болезней (протокол № 31/5 от 01.03.2016 и протокол № 32/2 от 19.05.2016).
Ограниченное клиническое исследование проведено у 10 пациентов, из них 8 мужчин и 2 женщины в возрасте от 19 до 48 лет. Пациенты поступали в офтальмологический стационар с диагнозами термохимический ожог (3 пациента) и химический ожог роговицы (7 пациентов) различной степени тяжести, с преобладанием тяжелой: средней (2 пациента), тяжелой (8 пациентов) (по классификации Пучковской). Сроки поступления в стационар варьировали от 2 суток (в 2 случаях) до 2 месяцев (в 1 случае), в среднем 5-14 дней с момента ожога. У всех исследуемых на момент поступления наблюдали блефароспазм, слезотечение, выраженную воспалительную реакцию: смешанная инъекция конъюнктивы, хемоз. Отмечали резкую ишемию лимбальной зоны (от 1/3 до окружности) и отек роговицы. Во всех случаях имело место повреждение роговицы, характеризующееся наличием глубокой эрозии, тотальной или субтотальной, что могло привести к изъязвлению и перфорации роговицы. Отмечали помутнение роговицы от поверхностного («запотевшее стекло») до стромального («матовое стекло»). Острота зрения варьировала от 0,01 до 0,1, в среднем 0,05. Всем пациентам было проведено традиционное лечение. Местная консервативная терапия (в виде инстилляций и инъекций) включала антибактериальные, противовоспалительные, препараты для коррекции биохимических нарушений, слезозаменители, репаративное лечение. Системно пациенты получали антибактериальную и противовоспалительную терапию, ингибиторы протеолитических ферментов. Хирургическое лечение включало первичную и отсроченную хирургическую обработку в момент поступления в стационар, трансплантацию амниотической мембраны (от 1 до 3 раз в зависимости от тяжести состояния).
На фоне проводимого лечения видимого улучшения состояния не было. У всех исследуемых пациентов наблюдали II – III стадии ожоговой болезни (по классификации Р.А. Гундоровой и Г.Г.Бордюговой), характеризующиеся незаживающей эрозией роговицы, у 6 с изъязвлением. Сохранялся отек роговицы и помутнение ее слоев. В связи с вышеописанной клинической картиной, затяжным характером течения изъязвления роговицы, а также учитывая, что разработанный метод лечения является не инвазивным, а аппликационным, с использованием собственного материала пациента, принято решение о трансплантации данным пациентам аутологичных клеток буккального эпителия в составе комбинированной биоконструкции.
Всем пациентам разъяснены цели и задачи исследования, описаны проводимые медицинские манипуляции, выдана для подписи соответствующая форма добровольного согласия. В день поступления у всех пациентов исследуемой группы производили забор лоскута слизистой щеки для выделения и культивирования аутологичных клеток буккального эпителия (подробно о заборе биоматериала см. Главу 2) и изготовления комбинированной биоконструкции. Клетки буккального эпителия получали по оптимизированной методике, подробно описанной в Главе 3. По мере готовности комбинированной биоконструкции с аутологичными клетками буккального эпителия (в среднем 14 дней) осуществляли ее трансплантацию.
Аутологичные клетки буккального эпителия в составе биоконструкции укладывали на поврежденную роговицу (рис. 42 а,б) с последующим наложением тугой повязки на веки для дополнительной фиксации (подробно о методике трансплантации см. Главу 2). Сроки экспозиции варьировали в зависимости от тяжести состояния и составляли от 3 до 5 суток.
После снятия биоконструкции у всех пациентов отмечали сокращение площади эрозии и ее глубины, а также уменьшение отека и повышение прозрачности ткани роговицы.
Через 3-6 суток после лечения клетками буккального эпителия наблюдали полную эпителизацию у 7 пациентов, еще у 3 эрозия сохранялась, однако ее площадь и глубина значительно уменьшились. Стоит отметить, что у всех пациентов отек роговицы купирован на 3-4 сутки после лечения. Помутнение роговицы сохранялось у 8 пациентов, однако носило поверхностный характер. Острота зрения составляла в среднем 0,1-0,2.
У 3 пациентов предпринята повторная трансплантация аутологичных клеток буккального эпителия через 5-9 дней после первого этапа лечения. В результате повторного лечения аутологичными клетками буккального эпителия уже на 3-5 сутки на всех глазах роговица была эпителизирована, воспалительная реакция полностью купирована. Острота зрения составляла в среднем 0,1-0,15. Пациентов выписывали для динамического наблюдения.
Общий срок наблюдения составил от 6 мес до 1,5 лет. За этот период рецидив эрозии наблюдали у 3 пациентов в среднем через 1,5-2 месяца после лечения. При повторном поступлении в стационар этим пациентам проводили лечение аутологичными клетками буккального эпителия, которые предварительно восстановили из сохраненного в лаборатории материала. В результате добивались полной эпителизации эрозии роговицы.
Представляем клинические примеры лечения аутологичными клетками буккального эпителия в составе комбинированной биоконструкции.
Клинический пример №1. Пациент П., 1980 г.р. Поступил в офтальмологический стационар после попадания на переднюю поверхность глаза раствора щелочи (1 сутки после ожога). Поставлен диагноз OU – миопия высокой степени, состояние после LASIK, OD – химический ожог роговицы и конъюнктивы средней степени тяжести; OS – химический ожог роговицы и конъюнктивы тяжелой степени.
Состояние при поступлении:
Vis OD = 0,1 н/к;
Vis OS = 0,05 н/к;
Tn OD/OS = N/N (пальпаторно)
OD – глазница и окружающие ее части не изменены, положение глаза правильное, движения ограничены во всех направлениях. Веки отечные, блефароспазм, слезотечение. Конъюнктива бледно-розовая, хемоз, единичные поверхностные пленки. Роговица отечная, мутная в нижней половине, тотальная эрозия роговицы, ишемия лимба в нижней половине. OS – глазница и окружающие ее части не изменены, положение глаза правильное, движения ограничены во всех направлениях. Веки отечные, блефароспазм. Умеренное слезотечение. Конъюнктива бледная, хемоз, поверхностные пленки. Роговица отечная в виде «матового стекла», тотальная эрозия роговицы, резкая ишемия лимба. (рис.43 а).