Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 13
I. 1. Клиника и этиопатогенез ретинопатии недоношенных .13
I. 1. 1. Факторы риска ретинопатии недоношенных 13
I. 1. 2. Классификация и клинические проявления ретинопатии недоношенных 14
I. 1. 3. Представления о патогенезе ретинопатии недоношенных 20
I. 1. 3. 1. Роль оксидативного стресса в развитии ретинопатии недоношенных .25
I. 1. 3. 2. Опыт и перспективы применения антиоксидантов в лечении и профилактике ретинопатии недоношенных 26
I. 1. 3. 3. Роль воспаления и изменений системного цитокинового статуса в развитии ретинопатии недоношенных .28
I. 2. Экспериментальное моделирование как основа изучения патогенеза ретинопатии недоношенных 30
I. 2. 1. Основные принципы моделирования .30
I. 2. 2. Характеристика различных животных моделей ретинопатии недоношенных 31
I. 2. 3. История разработки и преимущества крысиной модели ретинопатии недоношенных 33
I. 2. 4. Значение экспериментального моделирования в изучении патогенеза ретинопатии недоношенных и поиске новых подходов к лечению данного заболевания .36
ГЛАВА II. Материал и методы исследования .40
II. 1. Клиническая часть .41
II. 2. Экспериментальная часть 42
II. 3. Статистическая обработка .51
ГЛАВА III. Результаты собственных исследований .52
III. 1. Клиническая часть .52
III. 1. 1. Результаты офтальмоскопического обследования всех обследованных недоношенных детей 52
III. 1. 2. Разделение недоношенных детей на группы в зависимости от развития и характера течения ретинопатии недоношенных .52
III. 1. 3. Сравнительный анализ общесоматического статуса детей трех клинических групп .53
III. 1. 4. Общая характеристика иммунологического статуса всех обследованных недоношенных детей на момент первого офтальмоскопического обследования .55
III. 1. 5. Анализ содержания ростовых факторов в сыворотке крови недоношенных детей трех клинических групп 59
III. 1. 6. Анализ содержания про- и противовоспалительных факторов в сыворотке крови недоношенных детей трех клинических групп 71
III. 1. 7. Оценка влияния антиоксидантной терапии на течение ретинопатии недоношенных и на динамику уровня VEGF-А в сыворотке крови детей с ретинопатией недоношенных .75
III. 2. Экспериментальная часть 81
III. 2. 1. Гистологические признаки развития экспериментальной ретинопатии недоношенных .81
III. 2. 2. Состояние гематоретинального барьера и уровень антиоксидантной активности в стекловидном теле крысят в норме и в условиях развития экспериментальной ретинопатии недоношенных 91
III. 2. 3. Влияние экзогенного мелатонина на развитие экспериментальной ретинопатии недоношенных 93
III. 2. 3. 1. Влияние экзогенного мелатонина на гистологические признаки ретинопатии 93
III. 2. 3. 2. Влияние экзогенного мелатонина на биохимические параметры стекловидного тела крысят с экспериментальной ретинопатией недоношенных .96
Заключение .97
Выводы .100
Практические рекомендации .102
Список литературы
- Факторы риска ретинопатии недоношенных
- Опыт и перспективы применения антиоксидантов в лечении и профилактике ретинопатии недоношенных
- Экспериментальная часть
- Оценка влияния антиоксидантной терапии на течение ретинопатии недоношенных и на динамику уровня VEGF-А в сыворотке крови детей с ретинопатией недоношенных
Факторы риска ретинопатии недоношенных
Активные формы кислорода – крайне реактогенные короткоживущие молекулы, которые способны вступать во взаимодействие с клеточными липидами, белками и нуклеиновыми кислотами, приводя к локальному повреждению и последующей дисфункции органов. В низких и умеренных концентрациях они играют важную физиологическую роль в процессах апоптоза, поддержании сосудистого тонуса, гормональной регуляции, иммунных реакциях и адаптивном ответе на воздействие ферментов [135]. Однако высокая их концентрация оказывает отрицательное воздействие, приводя к развитию оксидативного стресса.
Незрелые нейроваскулярные ткани зрительной системы недоношенных детей, включая сетчатку и головной мозг, чрезвычайно чувствительны к воздействию разных видов повреждающих факторов, среди которых важную роль играют активные формы кислорода, что обусловлено рядом причин: во первых, клетки сетчатки в норме обладают высокими темпами потребления кислорода и крайне чуствительны как к его недостатку, так и к избытку; во вторых, ткань сетчатки содержит самый высокий уровень полиненасыщенных жирных кислот, которые, как известно, являются «излюбленными» субстратами для повреждающих пероксидазных реакций; в-третьих, сетчатка в силу своего функционального назначения практически постоянно подвергается световому воздействию – активному инициатору формирования свободных кислородных радикалов. Повреждающее действие кислорода потенциируется также в силу того, что защитные свойства антиоксидантной системы недоношенных детей значительно снижены [27,34,43,88,127,135,174,221]. Таким образом, недоношенные дети со сниженным антиоксидантным потенциалом особенно чувствительны к токсическому воздействию повышенных концентраций кислорода, которые вызывают повреждение ткани за счет образования реактивных промежуточных форм кислорода и свободных радикалов в процессе перекисного окисления липидов мембран, патологическое воздействие которых вызывает вазоконстрикцию ретинальных сосудов, а затем приводит к вазоблитерации, неоваскуляризации и развитию ретинальной тракции [168]. В одном из исследований было показано, что увеличение окислительного стресса вследствие гипервентиляции или гипероксии вызывает селективный апоптоз эндотелиальных клеток ретинальных сосудов и индуцирует вазоблитерацию [239]. Было высказано предположение о том, что снижение выработки фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) при преждевременном рождении приводит к вазооблитерации новообразованных капилляров [179]. Кроме того, было продемонстрировано, что окислительный стресс приводит к увеличению экспрессии в ретинальной ткани фактора роста пигментного эпителия (PEDF), мощного ангиостатического фактора [180]. Более того, была прослежена корреляция повышенного окислительного стресса у недоношенных новорожденных с развитием и прогрессированием РН [88].
Основываясь на результатах многочисленных исследований, посвященных роли окислительного стресса в патогенезе РН, логичным явилось предположение, что антиоксидантная терапия может быть потенциально ценной терапевтической стратегией в профилактике и лечении РН. Тем не менее, результаты клинических испытаний, в которых тестировалась эффективность различных антиоксидантов, включая витамин Е, N-ацетилцистеин и лютеин, были неоднозначны, а также обнаружили серьезные побочные эффекты их применения у детей с РН [142,218]. Так, изучение присоединения витамина Е в схему терапии недоношенных детей были остановлены из-за развития у них сепсиса и некротизирующего энтероколита. Однако проведенный позже мета-анализ нескольких исследований подтвердил, что применение витамина Е приводило к снижению частоты развития 3 стадии РН [239]. Таким образом, в результате обобщения опыта применения антиоксидатных препаратов было сделано заключение, что хотя оксидативный стресс вносит определенный вклад в развитие тяжелой РН, широкое применение антиоксидантов может быть небезопасно [104].
Сегодня в связи с совершенствованием уровня лабораторно технической базы ученых ведется интенсивное изучение новых молекулярных участников окислительного стресса, сопровождающего развитие РН и, как следствие, поиск новых мишеней лекарственной терапии заболевания. Так, в настоящее время в качестве перспективного агента для профилактики и лечения заболеваний, индуцируемых окислительным стрессом, к числу которых, в определенной мере, относят и РН, учеными различных стран активно рассматривается мелатонин [100]. Известно, что синтез мелатонина, помимо основного источника – эпифиза, осуществляется практически во всех тканях, в том числе тканях глаза, а именно в сетчатке и цилиарном теле, причем сетчатка занимает второе место после эпифиза по количеству синтезируемого мелатонина [186]. Мелатонин обладает широким спектром антиоксидантных, противовоспалительных, нейропротекторных, а также антиангиогенных свойств [131,148,149,150,151,152,159,165,183,186,234]. Кроме того есть данные, свидетельствующие о способности мелатонина стабилизировать гематоретинальный барьер в условиях экспериментальной гипоксии [59].
Однако исследований, посвященных изучению влияния мелатонина на развитие и течение РН в эксперименте или клинике, до сих пор не проводилось и представляется крайне перспективным направлением.
Опыт и перспективы применения антиоксидантов в лечении и профилактике ретинопатии недоношенных
С целью оценки возможной патогенетической и прогностической роли нарушений системного иммунологического статуса в развитии РН было обследовано 85 недоношенных детей, находившихся на различных этапах выхаживания. Средний срок гестации при рождении обследованных детей составил 27,7 ± 2,2 недель (от 23 до 35 недель), средняя масса тела при рождении – 1086,1 ± 266,1 г (от 633 до 1790 г). 74 из 85 детей (87,1%) проводилась искусственная вентиляция легких (ИВЛ) продолжительностью от нескольких суток до 4 недель и более, у 79 детей (92,9%) была диагностирована системная или локальная форма внутриутробного инфицирования (ВУИ), у 56 детей (65,9%) отмечалось развитие внутрижелудочковых кровоизлияний (ВЖК) 1-4 степени, 40 детям (47,1%) проводились многократные переливания крови или ее компонентов.
Обследование детей включало динамическую офтальмоскопию и забор образцов венозной крови (0,5 мл) с целью исследования системного цитокинового статуса.
Офтальмоскопия осуществлялась с помощью непрямого налобного бинокулярного офтальмоскопа (Heine) и линз 20 и 28 D (Ocular) после предварительной двукратной инстилляции 0,1% раствора атропина для достижения максимального мидриаза. При необходимости после местной инстилляционной анестезии применялись векорасширитель и склерокомпрессор. Сроки офтальмоскопического обследования определялись согласно принятому в России протоколу скрининга РН с первым осмотром в возрасте 4-6 недель жизни и последующими периодическими осмотрами, осуществляемыми многократно до полного завершения процесса васкуляризации сетчатки у детей, находившихся в группе риска развития заболевания, либо до полного самопроизвольного или индуцированного регресса развившейся РН 1-3 стадии. При этом, 15 детям при выявлении признаков начальной сосудистой активности на глазном дне неонатологами была назначена антиоксидантная терапия (ежедневные внутримышечные инъекции препарата «Гистохром» 0,02% 0,5 мл). Обследование и лечение детей проводилось совместно с врачом-офтальмологом Отдела патологии глаз у детей к.м.н. Е.Н.Демченко.
Забор образцов венозной крови осуществлялся всем детям при первом офтальмоскопическом обследовании одновременно с плановым профессора О.С. Слеповой. динамическим контролем биохимических показателей. В 0,5 мл каждого образца путем мультиплексного анализа (ИФА) на проточном цитометре BD FACS Canto II было исследовано содержание 18 цитокинов – VEGF-А, IGF-I, IGF-II, TGF-, IFN-, IFN-, TNF-, TNF-, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12р70, IL-17, IL-18. Исследования проводились совместно с сотрудником отдела иммунологии и вирусологии Н.С. Славинской под руководством
У 27 детей иммунологические показатели были исследованы в динамике на различных сроках наблюдения. У 14 детей забор крови осуществлялся 2 раза, у 10 детей – 3 раза, у 1 ребенка - 4 раза и у 2 детей – 5 раз. Таким образом, всего было получено и исследовано 130 образцов венозной крови.
Исследование было выполнено на 144 крысятах породы Вистар в соответствии с ГОСТ 53434-2009 от 02.12.2009 г. «Принципы надлежащей лабораторной практики GLP», постановлением главного государственного врача РФ №51 от 29.08.2014 г. «Об утверждении СП 2.2.1.3218-14 «Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)», Федеральным законом №61-ФЗ от 12.04.2010 г. «Об обращении лекарственных средств». Протокол исследования был утвержден локальным этическим комитетом. С целью воспроизведения экспериментальной РН (ЭРН) новорожденных крысят вместе с родившей их самкой (n=36) на 14 суток помещали в инкубатор Isolette (Air-Shields Vickers), внутри которого каждые 12 часов концентрация кислорода менялась от 60 до 15% (рис.8).
Достижение определенной концентрации кислорода внутри инкубатора обеспечивалось с помощью прибора «Концентратор кислорода LF-H-10A» (Longfei Group Co., Ltd, Китай), соединенного с инкубатором специальной трубкой для его подачи. Контроль за поддержанием необходимой концентрации кислорода в течение 12 часов и ее плановым изменением проводился с помощью газоанализатора ПГК-06 (ЗАО «ИНСОВТ», г. Санкт Петербург) (рис.9). Соблюдение условий эксперимента и контроль за функционированием оборудования осуществлялись совместно с сотрудником научно-экспериментального центра старшим лаборантом Б.В. Витер под руководством к.б.н. А.И. Щипановой.
Экспериментальная часть
При выявлении признаков начальной сосудистой активности или на момент диагностирования РН на различных сроках наблюдения 7 детям из 2 й группы и 8 детям из 3-й группы неонатологами были назначены внутримышечные инъекции 0,5 мл препарата «Гистохром» 0,02%, которые проводились до развития признаков самопроизвольного или индуцированного регресса РН. Иммунологический статус данных детей был обследован в динамике. При этом, целесообразной представилась оценка влияния проводимой антиоксидантной терапии на динамику уровня ростового фактора VEGF-А, роль которого в патологическом ангиогенезе при РН хорошо изучена и не вызывает сомнения.
У 4 из 7 детей 2-й клинической группы (57,1%) на фоне инъекций препарата «Гистохром» отмечалось снижение концентрации VEGF в 1,26 раз, в 6,6 раз, в 2,8 раз и в 1,3 раз, у 3 детей отмечался ее подъем к моменту развития РН или в начальный период ее активной фазы.
У 7 детей данной группы, не получавших «Гистохром» и иммунологические показатели которых были обследованы в динамике, только у 2 детей (28,6%) отмечалось снижение концентрации VEGF-А в 1,3 раза и в 6,7 раз, а у 5 – отмечалось ее повышение к моменту развития РН или в начальный период ее развития.
В 3-й клинической группе у 6 из 8 детей (75%), получавших «Гистохром», наблюдалось снижение концентрации VEGF-А в 5 раз, в 1,3 раза, в 1,4 раза, в 1,9 раза, в 1,3 раза, в 24,3 раза (следует отметить, что в данном случае интервал между забором крови составил 4 недели), у 1 ребенка – концентрация практически не изменилась (стабилизировалась), и только у 1 отмечался ее подъем. Лазеркоагуляция аваскулярных зон сетчатки проводилась детям данной подгруппы на сроках с 35 по 38 неделю (в среднем, на 36,63±0,42 неделе). У 5 детей, прошедших динамическое иммунологическое обследование и не получавших «Гистохром», у 2 отмечалось снижение концентрации VEGF-А (из них – у 1 после проведенной лазеркоагуляции аваскулярных зон сетчатки), у 3 – повышение. Лазеркоагуляция аваскулярных зон сетчатки детям данной подгруппы была проведена на сроках с 33 по 39 неделю (в среднем, на 35,6±1,03 неделе – если без 39 недели, то на 34,75±075 неделе).
С целью доказательства адекватности возможности сравнения сроков проведения лазеркоагуляции в описанных подгруппах детей следует отметить, что РН у детей, получавших «Гистохром», была диагностирована на сроках с 34 по 38 неделю (в среднем, на 35,25±0,49 неделе), а у детей без «Гистохрома» - на сроках с 32 по 37 неделю (в среднем, на 34,4±0,93 неделе).
Таким образом, влияние проводимой антиоксидантной терапии на уровень VEGF-А в сыворотке крови в большей степени прослеживается у детей с тяжелым течением РН, по сравнению с группой детей с самопроизвольным регрессом заболевания. Применение антиоксидантного препарата в данной группе детей приводило к относительно более медленному прогрессированию заболевания до пороговой стадии, а значит, к необходимости проведения лазеркоагуляции сетчатки на более поздних сроках соматически более зрелым детям.
Влияние проводимой антиоксидантной терапии на уровень VEGF-А в сыворотке крови детей с тяжелой РН представляется целесообразным проиллюстрировать с помощью конкретных клинических примеров. Клинический пример. Ребенок Г. из 3-й клинической группы - Роды на 27 неделе с массой тела 1100 г. Ребенок находился на ИВЛ более 8 недель. Выхаживался с диагнозом: БЛД, ВПС, ФАП, ВЖК 2 степени, ПВЛ, судорожный синдром. - Первый офтальмологический осмотр был проведен на 31 неделе ПКВ. Офтальмоскопически на данном сроке определялась широкая аваскулярная зона II, начальная извитость концевых сосудов. Назначены внутримышечные инъекции препарата «Гистохром» 0,5 мл. - На 36 неделе была диагностирована РН 1-2 степени. - На 38 неделе развилась 3 «пороговая» стадия РН. Была проведена лазеркоагуляция аваскулярной зоны сетчатки. - Признаки регресса заболевания отмечались на 40 неделе. Динамика концентрации VEGF-А в сыворотке крови данного ребенка представлена на рисунке 30.
Динамика концентрации VEGF-А в сыворотке крови ребенка Г. из 3-й клинической группы Клинический пример. Ребенок Р. Из 3-й клинической группы - Роды на 27 неделе с массой тела 840 г. Ребенок находился на ИВЛ более 8 недель. Выхаживался с диагнозом: внутриутробная пневмония, БЛД, судорожный синдром. - Первый офтальмологический осмотр был проведен на 33 неделе ПКВ. Офтальмоскопически на данном сроке определялась широкая аваскулярная зона II. - На 35 неделе ПКВ была отмечена начальная извитость концевых сосудов. Назначены внутримышечные инъекции 0,5 мл препарата «Гистохром». - На 38 неделе была диагностирована «пороговая» стадия РН и проведена лазеркоагуляция аваскулярной зоны сетчатки. - На 43 неделе в связи с возобновлением сосудистой активности и ростом экстраретинальной ткани была проведена повторная лазеркоагуляция сетчатки.
Оценка влияния антиоксидантной терапии на течение ретинопатии недоношенных и на динамику уровня VEGF-А в сыворотке крови детей с ретинопатией недоношенных
Выявленные на данном сроке изменения соответствуют начальному регрессу РН в клинике. Сетчатка крысят контрольной группы на данном сроке имеет слоистое строение с выраженными ядерными слоями. Отмечается значительная выраженность внутреннего плексиформного слоя по сравнению с наружным. Во внутреннем плексиформном слое встречаются единичные сосуды с узким или недифференцирующимся просветом (запустевшие?). В слое нервных волокон определялись сосуды с обычным просветом и редко расположенными гипохромными ядрами эндотелиальных клеток. Таким образом, воспроизведенная нами модель ЭРН характеризуется фазностью изменений со стороны ретинальных сосудов аналогичной последовательным стадиям РН в клинике, что свидетельствует об адекватности нашей экспериментальной модели.
Гистологические исследования проводились совместно с сотрудником отделения патологической анатомии и гистологии глаза врачом-патологоанотомом А.М. Майбогиным, иммуногистохимические – совместно с вед.науч.сотр., к.б.н. Л.Д. Андреевой под руководством профессора И.П. Хорошиловой-Масловой [21,35,36].
Как видно из таблицы 5, у крысят контрольной группы содержание общего белка в стекловидном теле на 7 сутки после рождения было практически вдвое выше, чем в последующие сроки наблюдения. Поскольку данный показатель можно рассматривать в качестве индикатора проницаемости стенок кровеносных сосудов сетчатки, полученные результаты можно объяснить незаконченным к данному сроку формированием ГРБ. Кроме того, еще одним источником белка в стекловидном теле может являться еще функционирующая система гиалоидных сосудов, инволюция которой окончательно завершается на более поздних сроках.
Сравнительный анализ уровня общего белка в стекловидном теле крысят двух групп показал, что данный показатель у крысят с ЭРН существенно превышал таковой у крысят контрольной группы: на 7 сутки – в 1,5 раза, на 14 сутки почти в 3 раза и на 18 сутки – в 2 раза. Такое значительное увеличение содержания белка в стекловидном теле может происходить вследствие пролиферации сосудов с повышенной проницаемостью и выходом из них плазменных белков. Также это можно объяснить тем, что при ЭРН, помимо описанной незрелости ГРБ, имеют место выраженные нарушения его структуры и функции на всех сроках наблюдения с максимумом на 14 сутки, что согласуется с данными литературы [238, 239].
Общая тенденция к снижению содержания общего белка в стекловидном теле в динамике в обеих группах крысят может объясняться постепенным созреванием структуры ГРБ, а также отчасти, возможно, инволюцией гиалоидных сосудов в процессе постнатального развития.
АОА в стекловидном теле крысят контрольной группы постепенно нарастала в динамике, что можно объяснить естественными процессами созревания и совершенствования системы защиты от свободнорадикального воздействия. У крысят с ЭРН АОА на 7 сутки не отличалась от контроля, но на 14 сутки становилась выше контрольного уровня в 6,4 раза. На 18 сутки (после окончания действия кислорода) АОА, также как и содержание белка, снижалась, однако по-прежнему превышала норму практически в 2 раза.
Полученные данные подверждают фазность течения ЭРН и могут быть подытожены следующим образом. В течение первой недели, несмотря на повышенную по сравнению с контролем проницаемость ГРБ, АОА не увеличивалась, возможно, в силу «расходования» плазменных антиоксидантов на связывание свободных радикалов, содержание которых в этот период возрастает. Значительное увеличение АОА на второй неделе может быть связано с поступлением в стекловидное тело плазменных антиоксидантов из патологически измененной ретинальной сосудистой сети вследствие нарушения ГРБ и процессов активной вазопролиферации, что подтверждается высоким значением содержания общего белка в стекловидном теле в этот период. Кроме того, определенный вклад может вносить возможное увеличение синтеза антиоксидантов in situ в самой сетчатке (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза, мелатонин и др.) в ответ на развивающийся окислительный стресс. Последующее снижение АОА у крысят опытной группы на 18 сутки свидетельствует о явно возросших затратах антиоксидантов в борьбе с активными формами кислорода, поскольку сохраняющаяся высокая концентрация белка в стекловидном теле свидетельствует о том, что проницаемость ГРБ по-прежнему остается нарушенной. Исследования проводились совместно с научным сотрудником отдела патофизиологии и биохимии О.В. Безнос под руководством профессора Н.Б. Чесноковой [21,35,36].