Содержание к диссертации
Введение
Глава 1 Обзор литературы 12
1.1 Основные представления о витальных красителях 12
1.2 Трипановый синий в катарактальной хирургии 15
1.3 Красители для хромовитрэктомии 21
Глава 2 Материалы и методы исследований 28
2.1 Дизайн исследования 28
2.2 Материал и методы экспериментальных исследований 31
2.3 Материал и методы клинических исследований 38
2.4 Статистическая обработка 47
Глава 3 Результаты экспериментальных исследований 48
3.1 Результаты санитарно-химических, токсикологических и технических испытаний 48
3.2 Результаты колориметрической оценки окрашивания интраокулярных структур 51
3.3 Оценка когезивности красителя для заднего сегмента глаза 53
3.4 Результаты электроретинографии после экспериментальной витрэктомии с применеием красителей 55
3.5 Результаты морфологических исследований 57
Глава 4 Результаты клинических исследований 70
4.1 Результаты дооперационного обследования пациентов 70
4.2 Интраоперационный сравнительный анализ окрашивающих свойств красителей 74
4.3 Характеристика течения послеоперационного периода 80
4.4 Клинико-функциональные результаты факоэмульсификации 82
4.5 Клинико-функциональные результаты лечения идиопатических макулярных отверстий и эпимакулярного фиброза 84
Заключение 89
Выводы 96
Практические рекомендации 98
Список сокращений 99
Список литературы 100
- Красители для хромовитрэктомии
- Результаты морфологических исследований
- Интраоперационный сравнительный анализ окрашивающих свойств красителей
- Клинико-функциональные результаты лечения идиопатических макулярных отверстий и эпимакулярного фиброза
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Внедрение современных технологий при проведении факоэмульсификаций и витреоретинальных операций требует использования безопасных и удобных в обращении инструментов, оборудования и расходных материалов для оптимизации и повышения результативности хирургических вмешательств (Тахтаев Ю.В. и соавт., 2002; Куликов А.Н., 2006; Чурашов С.В., 2007; Першин К.Б. с соавт., 2016; Arshinoff S.A. et al., 2012; Yung E.S. 2018). Одним из путей решения данной задачи является применение витальных красителей, которые обеспечивают лучшую интраоперационную визуализацию и, следовательно, безопасные манипуляции с прозрачными внутриглазными структурами и патологически измененными участками (Столяренко Г.Е. и соавт., 1988; Стебнев В.С., 2017; Badaro E., 2014; Weber I. P. et al., 2017).
Однако вопросы безопасности витальных красителей для интраокулярного применения до сих пор дискутируются (Балашевич Л.И., 2015; Кислицына Н.М. и соавт., 2016; Байбородов Я.В., 2017; Machado L.M., 2015; Madi H.A. et al., 2016; Maia M. et al., 2017).
Степень разработанности темы исследования
Результаты экспериментальных исследований, а также клинический опыт интраоперационного контрастирования внутриглазных структур витальными красителями описаны во многих работах отечественных и зарубежных авторов. Несмотря на это, изучение безопасности, поиск оптимальных вариантов комбинаций различных красителей открывают новые возможности их использования в офтальмохирургии.
Следует особо отметить, что до настоящего времени отечественные
красители для хирургии переднего и заднего сегмента глаза, разрешенные к применению в РФ, отсутствовали.
Цель исследования
Комплексная оценка безопасности и эффективности разработанных отечественных витальных красителей на основе трипанового синего для интраоперационного контрастирования внутриглазных структур.
Задачи исследования
1. Разработать витальные красители на основе трипанового синего для интраоперационного контрастирования передней капсулы хрусталика и структур витреомакулярного инетерфейса (эпиретинальной мембраны и внутренней пограничной мембраны).
-
Оценить окрашивающую способность, когезивные свойства, потенциальную токсичность и безопасность применения разработанных красителей.
-
Изучить гистологические и электронно-микроскопические изменения роговицы и сетчатки кроликов после экспериментальной факоэмульсификации и витрэктомии с применением разработанных красителей и их зарубежных аналогов.
-
Провести сравнительный анализ клинико-функциональных результатов факоэмульсификации с применением разработанного красителя и его зарубежного аналога в хирургии катаракты.
-
Провести сравнительный анализ клинико-функциональных результатов хромовитрэктомии с применением разработанного красителя и его зарубежного аналога в хирургии эпимакулярного фиброза и идиопатического макулярного отверстия.
Научная новизна результатов исследования
Впервые разработаны отечественные витальные красители на основе трипанового синего для интраоперационного контрастирования передней капсулы хрусталика и структур витреомакулярного инетерфейса (эпиретинальной мембраны и внутренней пограничной мембраны).
Впервые в экспериментальных условиях на основании результатов оценки окрашивающей способности, когезивных свойств, токсикологических, гистологических, электронно-микроскопических и электрофизиологических исследований доказана безопасность и эффективность разработанных красителей.
Впервые в клинике на примере ультразвуковой факоэмульсификации и
хромовитрэктомии при патологии витреомакулярного интерфейса для
интраоперационного контрастирования применены разработанные красители и проанализированы результаты лечения в различные сроки наблюдения.
Теоретическая и практическая значимость работы
Примененный в исследовании комплексный подход к разработке, экспериментально-клинической оценке безопасности и эффективности витальных красителей для интраоперационного контрастирования внутриглазных структур может служить базой для дальнейших научных исследований при создании, апробации и внедрении новых и усовершенствованных технологий и изделий для офтальмохирургии.
Внедрение в клиническую практику разработанных витальных красителей, получивших регистрационные удостоверения:
- в Российской Федерации - РУ № ФСР 2009/05994 от 03.11 2009 г.,
РУ № РЗН 2016/5246 от 13.01.2017 г.;
- в Республике Беларусь: РУ № ИМ-7.97725 от 01.06.2011 г.;
- в Республике Казахстан: РУ РК-ИМН-5№017450 от 16.01.2018 г. расширяет арсенал и возможности офтальмохирургов при интраоперационном контрастировании передней капсулы хрусталика и витреомакулярных мембран.
Методология и методы исследования
Методологической основой данного исследования явилось
последовательное применение методов научного познания. Работа выполнена в виде сравнительного открытого исследования с применением экспериментальных, клинических, аналитических и статистических методов.
Основные положения, выносимые на защиту
-
На основании комплексного научно-технического и экспериментально-клинического подхода разработаны и апробированы витальные красители на основе трипанового синего для интраоперационного контрастирования внутриглазных структур.
-
Безопасность и эффективность разработанных витальных красителей доказана в экспериментальных условиях токсикологическими, гистологическими, электронно - микроскопическими и электрофизиологическими методами.
-
Клиническая эффективность разработанных витальных красителей на основе трипанового синего подтверждена достигнутыми высокими клинико -функциональными результатами операций с контрастированием внутриглазных структур - передней капсулы хрусталика при ультразвуковой факоэмульсификации и витреомакулярных мембран при хромовитрэктомии.
Степень достоверности и апробация результатов
Достоверность итогов диссертационного исследования подтверждена достаточным количеством экспериментальных и клинических исследований. Выводы, сформулированные в диссертации, и рекомендации обоснованы и логически вытекают из результатов проведенного исследования.
Основные положения диссертационного исследования были доложены на
научно-практической конференции «Актуальные проблемы офтальмологии»
(Уфа, 2009), III Всероссийской молодежной научно-практической
офтальмологической конференции с участием представителей стран ШОС «ОКО-2015» (Уфа, 2015), Симпозиуме и Конгрессе ASCRS-ASOA (Лос-Анджелес, 2017).
Материалы диссертационного исследования включены в практическое
руководство для врачей «Ультразвуковая хирургия катаракты –
факоэмульсификация» (Москва, издательство ООО «ИПК Парето - Принт», 2016. – 144 с.) и в программу цикла повышения квалификации «Wetlab по ультразвуковой хирургии катаракты» кафедры офтальмологии с курсом ИДПО Башкирского государственного медицинского университета.
Публикации. По материалам диссертационного исследования
опубликованы 14 печатных работ, в том числе 8 работ в журналах, входящих в
перечень рецензируемых изданий, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, получены 2 приоритетные справки по заявкам на патенты РФ на изобретение.
Личное участие автора
Автором лично определены цель и задачи исследования, проведен анализ
отечественной и зарубежной литературы по теме диссертации, разработан
алгоритм исследования. Автор участвовала в проведении научно-
исследовательских работ по разработке витальных красителей на основе трипанового синего для интраоперационного контрастирования внутриглазных структур, в регистрации их как медицинских изделий, участвовала в экспериментальных и клинических исследованиях, осуществляла сбор и анализ полученных данных, публиковала результаты исследований, представляла доклады по данной теме на научно-практических конференциях в Российской Федерации и за рубежом.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Диссертационная работа соответствует паспорту научной специальности 14.01.07 - глазные болезни: изучение и совершенствование хирургических технологий при патологии органа зрения.
Внедрение результатов исследования в практику
Витальный краситель для переднего сегмента глаза зарегистрирован и разрешен к производству, продаже и применению на территории РФ (Регистрационное удостоверение № ФСР 2009/05994 от 03.11.2009 г.), в Республике Беларусь (Регистрационное удостоверение № ИМ-7.97725 от 01.06.2011 г.) и в Республике Казахстан (Регистрационное удостоверение РК-ИМН-5№017450 от 16.01.2018 г.); витальный краситель для заднего сегмента глаза – на территории РФ (Регистрационное удостоверение № РЗН 2016/5246 от 13.01.2017 г.).
Разработанные красители в настоящее время используются в клинической практике более 100 специализированных офтальмологических клиник, в том числе МНТК «Микрохирургия глаза» имени академика С.Н. Федорова (г. Москва), Казахского НИИ глазных болезней (г. Алматы), ГАУЗ СО «Областная офтальмологическая больница» (г. Саратов), БУЗ ВО «Вологодская областная офтальмологическая больница» (г. Вологда), ГБУЗ «Городская клиническая больница № 2» (г. Астрахань), Офтальмологической клиники «Хирургия глаза» (г. Самара), ГБУЗ РБ «Городская клиническая больница № 10» (г. Уфа), Центров лазерного восстановления зрения «Оптимед» гг. Уфа, Стерлитамак, Октябрьский, ОДО «ОКБ медицинской диагностической техники» (Республика Беларусь).
Объем и структура диссертации. Диссертация представлена рукописью на русском языке объемом 127 машинописных страниц и состоит из введения,
четырех глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка сокращений и списка литературы. Список литературы включает 260 наименований, в том числе 80 отечественных и 180 зарубежных литературных источников. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 35 рисунками.
Красители для хромовитрэктомии
Успехи применения витальных красителей в катарактальной хирургии обусловили интерес для возможности их использования в хирургии заднего отрезка глаза для идентификации преретинальных мембран и стекловидного тела. Визуализация и идентификация прозрачных внутриглазных структур является одной из основных составляющих успешной витреоретинальной хирургии. Новый раздел витреоретинальной хирургии, хромовитрэктомия, подразумевает избирательный подбор эндовитреальных красителей для окрашивания структур заднего отрезка глаза, что расширяет идентификацию истинных границ патологических мембран, позволяет оперировать пациентов на более ранних стадиях заболевания и c меньшим травматизмом [11, 56, 58, 69, 132, 139, 177, 194, 200, 228].
Удаление патологической эпиретинальной мембраны и пилинг внутренней пограничной мембраны в настоящее время успешно проводятся для лечения эпимакулярного фиброза и идиопатического макулярного отверстия [7, 9, 22, 25, 31, 37, 71, 99, 170, 224, 230, 257].
Наряду с другими техническими средствами, успех этих операций значительно зависит от витальных красителей.
Витальные красители для витреоретинальной хирургии первоначально вводили внутривенно. В 1939 г. описано первое клиническое применение красителей для идентификации разрывов при лечении отслойки сетчатки [218]. В 2000 г. Burk S. et al. предложили введение индоцианового зеленого для контрастирования ВПМ во время витрэктомии, что особенно широко стало использоваться в хирургии идиопатических макулярных разрывов [148, 222]. После многочисленных публикаций о возможных неблагоприятных эффектах (ICG) [81, 149], поиск альтернативных красителей усилился.
Peter Kroll в 2002 году предложил назвать термином «хромовитрэктомия» любую витрэктомию с использованием любого эндовитреального красителя, что нашло признание и в отечественной офтальмохирургии. Это новое перспективное направление витреоретинальной хирургии предусматривает использование эндовитреальных красителей в минимальных нетоксичных концентрациях и объемах для визуализации стекловидного тела, преретинальных и ретинальных структур во время операции [29, 57].
В числе первых красителей для окрашивания внутренней пограничной мембраны был предложен индоциановый зеленый, но из-за информации о токсичности, ICG не нашел широкого применения для внутриглазного использования [150, 154, 250].
Краситель Trypan Blue для витреохирургии применили Feron E. et al. в 2002 году [245]. С тех пор для оценки его токсичности и безопасности было проведено множество исследований, как на культурах клеток, так и у лабораторных животных с использованием световой, электронной, конфокальной и др. микроскопии, а также электрофизиологических методов.
О токсичности трипанового синего в виде дозозависимого повреждения нейрорецепторных элементов сетчатки грызунов in vitro было сообщенг после воздействия при концентрациях от 0,0125 до 0,1%, в то же время на культуре клеток пигментного эпителия сетчатки человека (ARPE-19) таких повреждений не было обнаружено [183, 247]. Дозозависимый токсический эффект на сетчатку грызунов был также показан: при концентрациях 0,15% и 0,25% выявлена дезорганизация внутренних ретинальных слоев, хотя при низких концентрациях краситель был нетоксичен [149, 242]. Жизнеспособность культуры клеток пигментного эпителия сетчатки человека, окрашенных трипановым синим в концентрациях 0,06, 0,15, 0,30% исследовали Stalmans с соавт. (2003) с применением конфокальной микроскопии. Признаков некроза клеток в культурах, обработанных красителем обнаружено не было, и авторы сделали предположение о том, что воздействие трипанового синего на клетки ПЭС может считаться безопасным [243].
Отсутствие «острой», но наличие «хронической» (от 5 минут воздействия до 6 дней) цитотоксичности трипанового синего в дозах от 0,05 до 0,6% в опытах на культивированных клетках ПЭС человека показано [128, 229, 235, 237].
Важные свойства трипанового синего показаны в исследованиях Hirasawa и соавт. (2007). При исследовании возможности поглощения красителей клетками ПЭС авторы обнаружили, что поглощения клетками трипанового синего не происходит, поскольку краситель не проходит через неповрежденные мембраны и поэтому может быть полностью удален в ходе хромовитрэктомии [147].
Сходные сведения представлены и в других публикациях [107, 125, 144, 149, 222]. Отсутствие токсичности на сетчатку кролика спустя 4 недели после интравитреальной инъекции 0.06% TB показано Veckeneer и соавторами с помощью гистологических и электрофизиологических методов. Вместе с тем, световая и электронная микроскопия позволили обнаружить, что воздействие высоких концентраций (0.2%) TB приводит к повреждению фоторецепторов и дезорганизации в нижнем секторе сетчатки [189, 252].
Эти сведения согласуются с исследованием Haritoglou C. и соавт. 2004 г., согласно которому концентрация TB 0.02% была безопасной, но возникала дезорганизация внутренних ретинальных слоев при концентрациях 0.15 и 0.25% [242].
Эффекты трипанового синего на функции сетчатки быка исследованы электроретинографически [207]. В работе был показан необратимый токсический эффект трипанового синего в концентрации 0.15%: после 15 секундного воздействия происходило угнетение b-волны ЭРГ. Разрушение фоторецепторов в сетчатке кроликов обнаружено при использовании TB в концентрации - 0.2% [189].
Ультраструктурных повреждений сетчатки кошки после пилинга ВПМ с применением красителей обнаружено не было, но с ретинальной стороны внутренней пограничной мембраны находились фрагменты клеток Мюллера в виде разрывов и отрывов [221].
В серии работ, выполненной группой Penha F.M. было исследовано влияние субретинальной инъекции TB 0.15%, ICG 0.5%, глюкозы и BSS на глаза кроликов. Животные были исследованы через 6, 12 и 24 ч и спустя 14 дней после инъекции с помощью офтальмоскопии и флюоресцентной ангиографии глазного дна (ФАГД). Гистологические препараты изучали с помощью световой и электронной микроскопии. ФАГД показала наиболее выраженные дефекты после применения ICG. Субретинальная инъекция TB привела к гистологическим отклонениям через 24 ч и спустя 14 дней после операции, красситель вызывал отек внешних и внутренних сегментов фоторецепторов и пикноз внешнего ядерного слоя через 6 и 12 ч после операции. Через 24 ч и 14 дней после воздействия трипанового синего также был затронут пигментный эпителий. Повреждения, вызванные гипоосмолярными растворами красителей были более значительными по сравнению с изоосмолярными красителями и BSS [127].
В публикациях последних лет [125, 260] представлены результаты оценки эффективности и токсичности различных концентраций TB для окрашивания во время субретинальной инъекции в глазах крыс in vivo. Показан дозозависимый нейротоксичный эффект на клетки сетчатки с минимальными изменениями при концентрации TB 0,04%.
Токсическое влияние интравитреальных инъекций BBG на структуру и функции сетчатки изучено в ряде экспериментальных работ. Было показано отсутствие токсических эффектов на клеточные структуры сетчатки и отсутствие изменений электроретинограммы при дозировках красителей 0,01 и 0,1 мг/мл. Более высокие концентрации (1,0 и 10,0 мг/мл) вызывали вакуолизацию клеток ганглиозного слоя и клеток Мюллера [85, 120, 132]. Rodrigues E. et al. (2009) показал безопасность интравитреальных инъекций 0,05 мл 0,05% и 0,5% BBG, а также субретинальных инъекций BBG в дозе 0,25 мг/мл на глазах кроликов с помощью флюоресцентной ангиографии и электронной микроскопии [198].
Воздействие BBG на структуры глаза были исследованы на клеточной культуре [106, 121, 152], в экспериментах на животных [121, 129, 236, 249].
Принципиально важным подходом в хромовитрэктомии для улучшения окрашивающих свойств витальных красителей является их комбинаци. Так, Stalmans и др. (2003) сообщил о технике последовательного «двойного» окрашивания, используя трипановый синий для пилинга эпиретинальной мембраны, а ICG – для визуализации внутренней пограничной мембраны [243]. Значительно позднее (Awad et al., 2011) была предложена комбинация трипанового синего с бриллиантовым синим [104].
Именно комбинированные красители на основе TB и BBG относят к новому поколению интравитреальных красителей, они обеспечивают достаточно высокую степень окрашивания как внутренней пограничной, так и эпиретинальной мембран при минимальных концентрациях и объемах [97, 129, 154, 178, 188, 256]. Тонкослойная хроматография показала, что объединение TB и BBG не приводило к объединенному красящему эффекту, красители в комбинации не взаимодействуют химически друг с другом, и, поэтому каждый краситель окрашивает собственные «таргетные» структуры [141].
Кроме комбинации витальных красителей для улучшения их красящих характеристик, были выполнены работы по их сочетанию с вязкостными добавками. Неблагоприятные эффекты не были обнаружены вплоть до 120-й секунды воздействия красителей [104, 159, 213, 228, 252].
Более того, было отмечено, что добавление полиэтиленгликоля к раствору красителя даже заметно уменьшило токсичность красителей, возможно, в связи с повышением вязкости и плотности раствора и нейропротекторными эффектами PEG [104, 165].
Новейшие исследования, проведенные методами оптической когерентной томографии, автофлюоресценции и электроретинолграфии после субретинального введения комбинированного красителя Membrane Blue Dual грызунам каких-либо структурных и функциональных токсических эффектов не обнаружили [145].
Результаты морфологических исследований
На 5 сутки после операции как с разработанным витальным красителем для переднего сегмента глаза, так и с зарубежным аналогом общая структура соединительнотканной стромальной пластинки роговицы глаза кроликов и покрывающего его многослойного неороговевающего эпителия полностью сохранялась (рисунок 9,10). В эпителии были четко различимы все слои.
Коллагеновые волокна стромальной пластинки были расположены параллельными рядами относительно друг друга и ровно окрашивались пикрофуксином в красный цвет при окраске по Ван-Гизону (рисунок 9) и в розовый цвет эозином при окраске гематоксилином и эозином (рисунок 10). Эти признаки свидетельствуют о сохранности волокнистых пучков. Хорошо дифференцировались удлиненные веретеновидные темные ядра кератоцитов в строме роговицы. Эндотелиальный слой имел типичную структуру и плоским однорядным слоем лежал на задней пограничной мембране.
Через 14 дней после воздействия обоих красителей заметных при светооптической и электронной микроскопии признаков дистрофических изменений в клетках заднего эпителия роговицы и в стромальной пластинке не обнаруживалось. Направление хода пучков коллагеновых волокон соединительнотканной стромы не было нарушено. Структура многослойного неороговевающего эпителия, покрывающего переднюю поверхность роговицы глаза, также не была изменена. Эндотелиальные клетки заднего эпителия плоским однорядным слоем лежали на четко выраженной ровной плотной десцеметовой мембране роговицы (рисунок 11,12).
При электронной микроскопии все клеточные слои оставались сохранными. Передняя пограничная Боуменова мембрана просматривалась нечетко, что являлось характерной особенностью ее струтктуры для глаз кроликов. В строме роговицы признаки отека не выявлялись, сохранялась полностью параллельность расположения коллагеновых фибрилл в пучках (рисунок 13). Эндотелиальные клетки роговицы имели типичную для них ультраструктуру (рисунок 14). В цитоплазме клеток хорошо просматривались митохондрии, каналы гладкого и гранулярного эндоплазматического ретикулума, пластинчатый комплекс Гольджи, единичные рибосомы и полирибосомы, а также определялись пиноцитозные пузырьки, мелкие вакуоли (рисунок 15).
Таким образом, проведенные гистологические и электронно – микроскопические исследования роговицы глаз кроликов не выявили патоморфологических изменений после экспериментального оперативного вмешательства с использованием красителей (разработанного и контрольного).
Морфологически сетчатка глаза кроликов интактной группы была представлена 11 слоями и включала мембрану Бруха, которую гистогенетически у кроликов относят и к сосудистой оболочке (хориоидее), и к сетчатой оболочке глаза; пигментный эпителий сетчатки; слой фоторецепторов (палочек и колбочек); наружную пограничную мембрану; наружный ядерный слой; наружный сетчатый слой; внутренний ядерный слой; внутренний сетчатый слой; слой ганглиозных клеток; слой нервных волокон, формирующих зрительный нерв; внутреннюю пограничную мембрану, которую формируют внутренние ножки радиальных глиоцитов (Мюллеровских клеток), пронизывающих всю сетчатку до межфоторецепторного матрикса (рисунок 16).
Наиболее темный наружный ядерный слой был представлен многочисленными плотными рядами тел фоторецепторных нейронов, а более светлый внутренний ядерный слой - телами биполярных, горизонтальных, амакриновых нейронов и радиальных мюллеровских глиоцитов.
Крупные светлые нейроны с округлыми ядрами в один ряд составляли слой ганглиозных клеток. Сенсорная часть (слой палочек и колбочек) прилежала к пигментному эпителию, от которого она легко отделялась при гистологической проводке. На рисунке 17 показаны клетки пигментного эпителия, лежащие на мембране Бруха, по другую сторону лежит сосудистая оболочка – хориоидея.
Как видно, на гистологических срезах контрольных образцов отсутствовали патоморфологические изменения (дистрофия, некроз) во всех слоях сетчатой оболочки.
На следующем этапе изучали изменения морфологии сетчатки глаза кроликов на 5 сутки, 14 и 30 сутки после витрэктомии и интравитреального применения красителей.
На 5 сутки обнаружены умеренно выраженные морфологические изменения в обеих экспериментальных группах (рисунок 18, 19). Слои сетчатки хорошо просматривались, кроме пигментного эпителия (при гистологической проводке данный слой отделился от фоторецепторного слоя). Нейроны ганглиозного слоя содержали крупные ядра с одним темным плотным ядрышком, в цитоплазме тельца Ниссля выявлялись в виде базофильных включений. Вокруг многих ганглиозных нейронов определялись признаки отека в виде оптических светлых расширений. Кроме того, цитоплазма ножек радиальных мюллеровских глиоцитов была уплотнена. В стекловидном теле вдоль внутренней глиальной мембраны местами обнаруживались небольшие скопления крупных макрофагов (рисунок 19). В отдельных макрофагах в цитоплазме были хорошо видны темные гранулы – фаголизосомы, вероятно с частицами введенного красителя.
Во внутреннем ядерном слое большинство нейронов сетчатки кроликов обеих групп имели признаки выраженной гидропической дистрофии. Внутренний сетчатый слой был без особенностей, а наружный сетчатый слой был истончен, что затрудняло его визуализацию. Наружный ядерный слой имел типичную для интактной сетчатки структуру. Ниже наружной глиальной мембраны в фоторецепторном слое также выявлялись признаки отечности.
Через 14 дней после введения красителей в обеих группах морфологические изменения были практически не изменились. Все слои сетчатки хорошо просматривались на гистологических препаратах, кроме пигментного эпителия (рисунок 20). Описанные патоморфологические признаки не прогрессировали. Отек ганглиозного слоя и нейронов внутреннего ядерного слоя сохранялся (рисунок 21).
В отдельных участках цитоплазма ножек радиальных мюллеровских глиоцитов в области внутренней глиальной мембраны была уплотненной.
На рисунке 22 и 23 представлены гистологические изменения сетчатки через 30 дней после введения красителя. Как видно, степень выраженности патоморфологических изменений уменьшалась. Все слои сетчатой имели четкие очертания. Признаки умеренно выраженного отека вокруг отдельных ганглиозных нейронов сохранялись, признаки гидропической дистрофии нейронов внутреннего ядерного слоя были менее выражены, чем на предыдущем сроке эксперимента (рисунок 22). В отдельных участках отек в ганглиозном слое почти полностью исчезал. Ганглиозные нейроны были с крупными светлыми ядрами и с одним четким округлым небольшим ядрышком в них. В цитоплазме ганглиозных клеток можно было увидеть значительное количество базофильных включений – телец Ниссля.
Исчезали признаки отека и в области наружной глиальной мембраны на уровне фоторецепторного слоя. Местами структура сетчатки полностью напоминала структуру сетчатки глаза интактных кроликов (рисунок 23). На таких участках во всех слоях сетчатки признаки отека полностью отсутствовали. Клетки пигментного эпителия сетчатки имели обычную структуру.
Подобная динамика гистологических изменений наблюдалась и при электронно-микроскопическом анализе. Так, через 5 дней после операции в обеих группах выявляли умеренно выраженные изменения. Под плотной полосой внутренней глиальной мембраны хорошо просматривались широкие ножки Мюллеровых глиоцитов. Цитоплазма глиальных элементов выглядела несколько уплотненной. В ганглиозном слое большинство ганглиозных нейронов с крупными округлыми ядрами содержали в цитоплазме значительное количество рибосом и полирибосом, множество вытянутых каналов гранулярного эндоплазматического ретикулума, которые формировали скопления.
Отдельные ганглиозные нейроны проявляли признаки отека в виде светлых вакуолей на месте митохондрий, расширения каналов гранулярного эндоплазматического ретикулума, разрежения цитоплазмы, слабого расширения перинуклеарного пространства (рисунок 24, 25).
Интраоперационный сравнительный анализ окрашивающих свойств красителей
Применение разработанных красителей в клинической практике различными хирургами показало, что от специалистов не требуется изменения привычной хирургической техники.
Чтобы оценить эффективность красителей в визуализации передней капсулы хрусталика, легкость введения их и удаления, интенсивность и равномерность окрашивания и легкость проведения капсулорексиса после окрашивания, эти параметры ранжировались по шкале от 1 (низкое) до 10 баллов (превосходное) каждым хирургом для каждой отдельной операции (таблица 13).
Во всех случаях непрерывный круговой капсулорексис был проведен без осложнений. Красители в обеих группах равномерно окрашивали переднюю капсулу без окрашивания других интраокулярных структур.
По субъективным ощущениям хирурги отметили, что краситель в контрольной группе интенсивнее окрашивал переднюю капсулу, чем в исследуемой, что можно связать с более низкой концентрацией разработанного красителя (0,05% против 0,08% в контрольной). Однако этой интенсивности окрашивания оказалось субъективно достаточно для выполнения капсулорексиса во всех случаях.
Кроме того, хирурги положительно оценили окрашивание тоннельного разреза роговицы и парацентезов, облегчающее их визуализацию в ходе операции. По легкости манипуляций с разработанным и контрольным красителями разницы не отметили (субъективная оценка 9,4±0,8 и 9,2±0,7, соответственно).
Как уже было отмечено, на этапе введения красителя и проведения капсулорексиса осложнений не было. В 5 случаях наблюдались осложнения, которые не были связаны с окрашиванием передней капсулы. Так, негерметичность операционной раны встретилась в 1 случае в I основной и в 1 случае в I контрольной группах, причиной которых стал большой объем движений ультразвуковым инструментом и близкие к максимальным значениям мощности, выбранные в связи с высокой плотностью катаракт (PNS = 5). Признаков ожога тоннельного разреза не было. Герметизировали разрез одним узловым швов, который снимали на 7-й день.
В трех случаях (в 1 из основной, в 2 из контрольной группы) наблюдались микротравмы радужки в результате ее ущемления краями тоннельного разреза. При гидратации тоннельного разреза радужка возвращалась в правильное положение. Незначительные дефекты пигментного листка радужки не оказывали влияния на результат оперативного вмешательства.
Эффективность красителей для интраоперационного окрашивания витреомакулярных мембран оценивали при выполнении микроинвазивной хромовитрэктомии.
Во всех случаях этап окрашивания внутренней пограничной мембраны и эпиретинальных мембран при выполнении микроинвазивной хромовитрэктомии был проведен без осложнений. Красители в обеих группах в силу своей тяжести быстро и равномерно оседали на макулярную поверхность без диффузии в витреальную полость (рисунок 33). При использовании разработанного красителя это обеспечивалось присутствием в составе 2% ПЭГ и 0,3% гиалуроната натрия, а при использовании красителя в контрольной группе – присутствием 4% ПЭГ и оксида дейтерия (как водная основа красителя). После аспирации красителей ЭРМ и ВПМ последние приобретали насыщенный синий цвет: эпиретинальные мембраны окрашивались за счет трипанового синего, а внутренняя пограничная мембрана – за счет BBG в составе обоих красителей.
После экспозиции в 10-15 секунд оба красителя одинаково хорошо и быстро аспирировались из витреальной полости, витреомакулярные мембраны (ЭРМ, ВПМ) хорошо визуализировались, имели четко обозначенные границы. Край патологической мембраны хорошо дифференцировался, что помогало провести малотравматичный пилинг. При потере в ходе пилинга края мембраны (n=1 в II основной группе ИМО) хороший контраст позволил повторно захватить ее край и продолжить процедуру. Бесспорную помощь оказывало использование красителей при выявлении в ходе пилинга многослойности удаляемой мембраны. Единичные мелкие геморрагии устраняли кратковременным повышением ВГД. Во всех случаях удалось провести удаление мембран в полном запланированном объеме у всех пациентов под хорошим визуальным контролем. После пилинга участок сетчатки без ВПМ хорошо контрастировал на фоне окрашенной сетчатки, демонстририруя эффективность проведенной процедуры (рисунок 33в).
Оценку эффективности окрашивания витреомакулярных мембран в сравнительном аспекте с зарубежным аналогом проводили аналогично вышеописанной методике по шкале от 1 (низкое) до 10 баллов (превосходное) каждым хирургом для каждой отдельной операции. Хирурги дали высокую оценку обоим красителям (9,2±0,8 и 9,1±0,7, соответственно), отметили легкость применения и достаточную интенсивность и равномерность окрашивания в обеих группах. Хирурги акцентировали внимание на отсутствии растекания и возможности целенаправленно вводить и управлять потоком красителя в полости стекловидного тела (рисунок 33, таблица 14).
Также стоит учесть, поскольку состав тканей различных внутриглазных структур, таких как эпиретинальные мембраны или внутренняя пограничная мембрана, может различаться, например, в зависимости от степени фиброзного компонента ЭРМ, соответственно, степень окрашивания также может различаться в зависимости от стадии и тяжести заболевания [118, 134, 188, 202].
В результате проведенной хромовитрэктомии с использованием разработанного и контрольного красителей удаление визуализируемой ЭРМ и ВПМ было достигнуто у всех пациентов, что показывает важность мембранной визуализации перед их удалением. Повторное применение красителя потребовалось лишь в 3 (9,4%) случаях во II основной ИМО и в 4 (13,3%) случаях во II контрольной группе ИМО после удаления эпиретинальной мембраны для дальнейшего пилинга внутренней пограничной мембраны.
Использование красителей позволило максимально полно удалить мембраны и минимизировать риск возникновения рецидива.
В 4 (12,1%) глазах II основной ИМО и 2 (6,7%) глазах II контрольной группы ИМО были интраоперационно обнаружены участки периферической хориоретинальной дистрофии и была выполнена ограничительная эндолазеркоагуляция.
С помощью интраоперационной ОКТ контролировали закрытие макулярного отверстия и полноту запланированного удаления ЭРМ и пилинга ВПМ. Двойной контроль – визуальный с помощью контрастирования прозрачных структур красителем и на ОКТ – позволял более четко детализировать особенности взаимодействия мембран витреомакулярного интерфейса, более деликатно, точно и в полном объеме производить удаление мембран, сближение краев макулярного отверстия, вовремя фиксировать даже минимальные отклонения или осложнения в ходе операции, тем самым, увеличивая функциональные и анатомические показатели в послеоперационном периоде.
Ятрогенных осложнений в виде отслойки сетчатки, повреждения ткани нейроэпителия при удалении эпиретинальной мембраны и пилинге внутренней пограничной мембраны не наблюдали.
Полученные данные позволяют сделать вывод, что микроинвазивная хромовитрэктомия с разработанным красителем обеспечивает достаточную визуализацию витреоретинального интерфейса во время эндовитреального вмешательства, не уступая признанному лидеру MembraneBlue Dual, делая важный и сложный этап удаления полупрозрачных мембран более деликатным и безопасным, снижая риск возникновения интраоперационных осложнений.
Клинико-функциональные результаты лечения идиопатических макулярных отверстий и эпимакулярного фиброза
У всех пациентов II основной и II контрольной групп после оперативного лечения отмечено увеличение остроты зрения. Динамика максимальной корригированной остроты зрения представлена в таблице 18. В целом за период наблюдения у всех пациентов имело место постепенное увеличение остроты зрения до 0,3-0,7, статистически значимых различий между II основной и II контрольной группой не было (p 0,05).
Субъективно пациенты в обеих группах отмечали исчезновение или уменьшение метаморфопсий.
По данным ОКТ, во всех случаях был достигнут положительный анатомический эффект – при эпимакулярном фиброзе – полное удаление патологической мембраны, улучшение анатомического профиля макулы; при идиопатическом макулярном отверстии – закрытие макулярного отверстия (рисунок 34), во всех случаях наблюдалась положительная динамика – отмечалось уменьшение ретинального отека (таблица 19), улучшение анатомического профиля макулы.
При этом восстановление микроархитектоники наружных слоев сетчатки происходило постепенно, с последовательным уменьшением диаметра дефекта на уровне фоторецепторов вплоть до полного его исчезновения в ходе периода наблюдения (рисунок 35). Случаев закрытия макулярного отверстия с формированием рубца в зоне фовеа в исследуемых группах не наблюдалось.
По данным микропериметрии, за период наблюдения у всех пациентов отмечалось статистически значимое (p 0,05) увеличение светочувствительности макулярной области и улучшение стабильности точки фиксации (таблица 20), согласованное с восстановлением нормальной топографии сетчатки в макулярной зоне по данным ОКТ. Абсолютная скотома наблюдалась в первые 2 месяца после операции у 2 (6,0%) пациентов II основной группы ИМО и у 2 (6,6%) пациентов II контрольной группы ИМО, все они до операции имели минимальный линейный размер макулярного отверстия более 400 мкм и после операции ко 2-му месяцу наблюдения по данным ОКТ отмечалось восстановление микроархитектоники наружных слоев сетчатки, о чем свидетельствует повышение световой чувствительности в макулярной области и значительное улучшение стабильности фиксации, при этом макулярное отверстие было закрыто полностью (рисунок 35). Все пациенты к 6 мес. после операции отмечали субъективное повышение зрительных функций и улучшение качества зрения.
Данные микропериметрии сопоставимы в обеих группах и согласуются с литературными данными [42, 68, 73, 167, 170, 171].
По данным общей ЭРГ, биоэлектрическая активность сетчатки в обеих группах оставалась в пределах нормального диапазона во все сроки наблюдения.
Сравнительный анализ исходных данных исследуемых групп (II основная, II контрольная) не выявил их достоверных различий (р 0,05).
Таким образом, у пациентов II основной группы в послеоперационном периоде были получены сопоставимые анатомо-функциональные результаты с пациентами II контрольной группы, что подтверждается следующим: во всех случаях достигнут положительный анатомический эффект-устранение тракции в макулярной зоне и удаление патологической мембраны при эпимаклярном фиброзе и закрытие макулярного отверстия при идиопатическом макулярном отверстии, уменьшение ретинального отека (к 1 году после операции средняя толщина сетчатки в фовеа составила в группах с ИМО 240,1±22,0 мкм и 242,3±27,2 мкм и в группах с ЭМФ 309,3±17,6 мкм и 313,5±22,8 мкм, соответственно), улучшение анатомического профиля макулы; максимальная корригированная острота зрения составила в группах с ИМО 0,45±0,21 и 0,44±0,30 и в группах с ЭМФ 0,46±0,14 и 0,47±0,13, соответственно; по данным микропериметрии увеличилась пороговая светочувствительность (при сетке 20, 41 стимул: в группах с ИМО до 28,7±3,1 дБ и 28,2±2,8 дБ, соответственно; в группах с ЭМФ - до 28,9±2,4 и 27,4±3,1; при сетке 6, 37 стимулов: в группах с ИМО до 20,9±4,2 дБ и 21,5±3,5 дБ, соответственно; в группах с ЭМФ – до 21,0±2,8 и 21,8±4,3, соответственно) и достигнута устойчивая фиксация взора во всех случаях.
Полученные результаты сопоставимы с литературными данными о лечении данной патологии, в которых положительного анатомического результата достигают в 86-100% случаев [5, 6, 10, 45, 52, 54, 80, 146, 160].