Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. История изучения болезни Штаргардта. Классификация. Терминология 14
1.2. Патогенетические основы болезни Штаргардта 16
1.3. Эпидемиология болезни Штаргардта 22
1.4. Клинические особенности болезни Штаргардта, инструментальные методы диагностики 23
1.5. Молекулярно-генетическая диагностика болезни Штаргардта. 29
1.5.1.Типы мутаций при болезни Штаргардта 30
1.5.2. Частые мутации гена ABCA4 и их встречаемость в популяции... 32
1.5.3. Методы молекулярно-генетической диагностики 38
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 41
2.1. Клинические исследования. 41
2.1.1. Характеристика выборки пациентов 41
2.1.2. Офтальмологические методы обследования пациентов 42
2.2. Молекулярно-генетические исследования 46
2.2.1. Материал для исследования 47
2.2.2. Методы молекулярно-генетического исследования 47
2.3. Методы информационной обработки данных 49
ГЛАВА 3. Результаты клинических исследований 51
3.1. Характеристика пациентов с болезнью Штаргардта. Наследственный анамнез 51
3.2. Клиническая картина болезни Штаргардта
3.2.1. Показатели визометрии 54
3.2.2. Показатели цветового зрения 56
3.2.3. Показатели компьютерной периметрии 57
3.2.4. Офтальмоскопическая и аутофлюоресцентная картина. Клинические характеристики пациентов при трех типах болезни Штаргардта 63
3.2.5. Флюоресцентная ангиография глазного дна 69
3.2.6. Структурные изменения сетчатки по данным спектральной оптической когерентной томографии 71
3.2.7. Электрофизиологические изменения сетчатки по данным общей и мультифокальной ЭРГ 84
ГЛАВА 4. Результаты генетических исследований 89
4.1. Молекулярно-генетическое исследование 5 наиболее частых мутаций гена ABCA4 89
4.2.Создание диагностической панели генетических маркеров болезни Штаргардта на основе секвенирования нового поколения. 91
4.3. Молекулярно-генетическое исследование генов ABCA4, ELOVL4, PROM1 и CNGB3 методом высокопроизводительного параллельного секвенирования 92
4.4.Молекулярно-генетическое исследование криптических сайтов сплайсинга в некодирующих областях гена ABCA4 99
4.5.Клинико-генетические корреляции 100
Клинические примеры 108
Алгоритм диагностики болезни штаргардта 117
Заключение 118
Выводы 129
Практические рекомендации 131
Список литературы 132
- Патогенетические основы болезни Штаргардта
- Офтальмологические методы обследования пациентов
- Показатели компьютерной периметрии
- Молекулярно-генетическое исследование генов ABCA4, ELOVL4, PROM1 и CNGB3 методом высокопроизводительного параллельного секвенирования
Патогенетические основы болезни Штаргардта
В настоящее время установлено, что причиной БШ являются мутации в генах ABCA4, ELOVL4, PROM1 и CNGB3. В большинстве случаев у пациентов с БШ выявляют мутации в гене ABCA4, который кодирует АТФ-зависимый трансмембранный переносчик из семейства ABC-белков [151]. ABCR4 - АТР-binding cassette transporter, retina-specific - относится к большому классу трансмембранных белков, АТФ-связывающих кассетных переносчиков (ATP-binding cassette transporters или ABC transporters), которые используют энергию АТФ для переноса различных субстратов – от ионов до липидов и белков – через клеточную мембрану [88].
В состав молекулы этих белков входит как минимум четыре домена: два трансмембранных и два нуклеотид-связывающих, известных как АТФ-связывающие кассеты. Трансмембранные домены ответственны за связывание и перенос субстрата, в то время как нуклеотид-связывающие – за поставку энергии для переноса за счет гидролиза АТФ [169].
Белок ABCR4 и, соответственно, кодирующий его ген, обозначают как ABCR4 (ABCA4) белок и ABCA4 ген. Ген ABCA4 кодирует ABCR4 белок, который экспрессируется преимущественно в наружных дисках палочек и колбочек, а также в мозге, почках [34,131]. В фоторецепторных клетках сетчатки ABCR4 белок локализован по краям фоторецепторного диска, а именно в мембранах дисковых «петель». Молекулярная масса ABCR4 белка равна примерно 250 кДа, молярное соотношение между ABCR4 и родопсином в наружном сегменте палочки порядка 1:120.
ABCR4-переносчик необходим для рециркуляции ретиналя – основной части зрительного пигмента родопсина, играющего важную роль в зрительном цикле. Для палочек процесс изучен полнее (рис.1). А- гистологическое изображение апикальной части наружного сегмента палочек; В - петля фоторецепторного диска и фрагмент плазматической мембраны в увеличенном виде; С - схематическое изображение ABCR белка в наружных дисках палочек, локализован в мембране петли; pm-плазматическая мембрана, dm-мембранный диск, rim-дисковая «петля» [102]. Под зрительным циклом понимают фото- и биохимическую систему преобразования фотона в электрический сигнал сетчатки, которая захватывает наружные сегменты фоторецепторных клеток сетчатки – палочек и колбочек, и примыкающие к ним клетки РПЭ [16,22,154].
Процессы восприятия света начинаются с возбуждения фоторецепторов сетчатки – палочек и колбочек. В наружных сегментах этих клеток находятся зрительные пигменты, фотоактивация которых запускает сигнальный каскад. Зрительные пигменты принадлежат к большому семейству рецепторов, передающих сигнал через гуанозинтрифосфат-связывающие белки [59,155]. Рецепторы этого семейства играют ключевую роль в механизмах трансдукции в процессах сенсорной, гормональной и синаптической рецепции. Наиболее изученным представителем этого семейства является зрительный пигмент палочек – родопсин.
Родопсин состоит из белка опсина, заякоренного в мембране диска, и хромофора - 11-цис-ретиналя. При поглощении кванта света ретиналь из 11-цис-формы изомеризуется в полностью-транс форму (рис.2). При этом опсин активирует каскад вторичных посредников, что в итоге приводит к генерации пресинаптического импульса. Полностью-транс-ретиналь отщепляется от опсина. Для регенерации родопсина полностью-транс-ретиналь должен вернуться в 11-цис-форму, эта реакция протекает в пигментном эпителии. Эвакуацию полностью-транс-ретиналя через фоторецепторную мембрану осуществляет АТФ-зависимый переносчик ABCR4 белок, находящийся в петле диска [16, 31, 115, 160,167]. Липофильный полностью-транс-ретиналь в составе мембраны диска соединяется с фосфатидилэтаноламином (ФЭА), в виде N-ретинилиден-ФЭА достигает переносчика и попадает в межклеточное пространство, а далее в пигментный эпителий [13,14,172]. Через несколько промежуточных стадий исходная 11-цис-конформация восстанавливается, хромофор возвращается в диск фоторецептора и рекомбинирует с опсином. Снижение скорости рециркуляции ретиналя может приводить к задержке темновой адаптации (рис.3).
Офтальмологические методы обследования пациентов
Клиническое исследование включало анализ данных обследования 60 пациентов (120 глаз) с БШ.
Критерием исключения из исследования было наличие других глазных заболеваний, кроме БШ, которые могли повлиять на изменение функции зрения и анализ результатов обследования.
В исследовании принимали участие 29 (48,3%) мужчин и 31 (51,7%) женщин в возрасте на момент обследования от 6 до 73 лет (средний возраст 36±17,3). В табл. 1 представлена клиническая характеристика обследованных групп больных.
У всех пациентов выясняли подробный анамнез заболевания и жизни, а также наследственный анамнез, результаты которого оформляли в виде родословной по общепринятым правилам с использованием стандартной символики.
В группы контроля были набраны здоровые добровольцы для проведения мф-ЭРГ (15 человек, 30 глаз), гЭРГ (17 человек, 34 глаза), ОКТ (17 человек, 33 глаза). Группы пациентов и группы контроля были однородны по возрасту (критерий Колмогорова-Смирнова, p 0,1). Таблица 1 Характеристика обследованных групп больных (n – количество пациентов). ПОКАЗАТЕЛЬ Пациенты с БШ Общее кол-во пациентов (n) 60 Пол М (n) Ж (n) 31 Возраст на момент обследования, M±SD (лет) 36 ± 17,3 Возраст манифестации БШ, M±SD (лет) 17,9±11,4 Длительность заболевания, M±SD (лет) 17±12,5 Наличие наследственного характера БШ (n) 14 В ходе проведения работы использовали традиционные офтальмологические методы обследования: визометрию с максимальной коррекцией аметропии, рефрактометрию, биомикроскопию, тонометрию.
Цветовое зрение оценивали по полихроматическим таблицам для исследования цветоощущения Е.Б. Рабкина [21]. Проверку осуществляли с очковой коррекцией для близи, отдельно для каждого глаза, предъявляя таблицы на расстоянии 33-35см. Результаты исследования подразделяли в зависимости от количества нечитаемых таблиц на три степени дисхроматопсии: легкая (пациент не читает 1-9 таблиц), средняя (пациент не читает 10-15 таблиц) и тяжелая (пациент не читает 16 и более таблиц).
При обратной офтальмоскопии на щелевой лампе с помощью диагностической линзы MaxField High Mag 78D (Ocular Instruments, США) оценивали состояние ДЗН, центральной и периферической зоны сетчатки; наличие и степень выраженности дистрофических изменений. В ходе проведения работы использовали специальные офтальмологические методы обследования. Флюоресцентную ангиографию глазного дна (ФАГ) проводили стандартным методом на фундус-камере FF 450 plus (FF 450 плюс) «Карл Цейс» (Германия) с встроенной цифровой камерой и HRT3 Heidelberg Engineering (Германия) совместно с д.м.н. М.В. Будзинской, И.В. Щеголевой. Для FF 450 plus в качестве возбуждающего фильтра использовали фильтр Baid Atomic B4, перед объективом видеокамеры устанавливали жёлтый барьерный фильтр ЖС-13, соответствующий по характеристике Kodak Wratten No 15.
В качестве контрастного вещества использовали 10% раствор флуоресцеина натрия (Флуоресцид) производства фирмы «Новартис» (Швейцария), который вводили в локтевую вену в количестве 2 мл в течение 2 сек. Перед проведением ФАГ зрачок максимально расширяли мидриатиками. До внутривенного введения контрастного вещества каждому пациенту делали фоновый снимок с целью контроля за псевдоаутофлюоресценцией структур глазного дна. Через 6-7 сек. от начала инъекции начинали серийную съёмку глазного дна в течение 20-25 сек. с интервалом 0,8-1сек. Последующие кадры снимали с интервалом 5-10 сек. Поздние фазы регистрировали через 15, 30 и 60 мин.
При проведении ФАГ основное внимание обращали на состояние циркуляции флуоресцеина в сосудах центральной зоны, обширность атрофического очага, зону молчания хориоидеи.
липофусцина, их локализацию и распространенность.Аутофлюоресценцию выполняли на конфокальном сканирующем лазерном офтальмоскопе (кСЛО), приборе HRA-2 «Heidelberg Engineering» (Германия) совместно с к.м.н. А.С. Стоюхиной. Всем пациентам была выполнена коротковолновая аутофлюоресценция (АФ 787 нм). При проведении АФ внимание обращали на зоны атрофии РПЭ и накопления липофусцина, их локализацию и распространенность.
Показатели компьютерной периметрии
Основные показатели статической периметрии MS - среднее значение световой чувствительности, MD - средний дефект световой чувствительности и sLV, отражающий глубину скотом (относительно диффузного снижения световой чувствительности), у пациентов 3-х групп представлены в табл.5.
Выявлено уменьшение MS и увеличение MD в зависимости от расширения площади изменений центрального поля зрения, а также статистически значимая разница по этим показателям периметрии между I-II и I-III группами. Показатель sLV во II и III группах по сравнению с I группой несколько уменьшается. Это связано с тем, что глубина скотом в центральном поле зрения во II и III группах увеличивается одновременно с диффузной потерей световой чувствительности всего поля зрения, о чем свидетельствует явное возрастание коэффициента MD. Таким образом, при оценке
Примечание: здесь и в последующих таблицах - медиана, нижняя/верхняя квартиль, - уровень значимости. прогрессирования дистрофического процесса целесообразно учитывать динамику всех показателей периметрии.
Кинетическая периметрия, с помощью которой оценивали площадь поля зрения, имела значимые отличия в группе контроля и пациентов (табл.5, рис.12-14). Наиболее выраженные изменения отмечены в III группе пациентов, распределенных по данным статической периметрии, площадь поля зрения которых существенно отличалась как от показателей здоровых лиц, так и пациентов I-II групп. Выявлена статистически значимая связь между степенью изменений кинетической и статической периметрии (Критерий Хи-квадрат Пирсона: 27,0, df=4, p 0,0002).
Несмотря на то, что острота зрения в трех группах пациентов, распределенных по данным статической периметрии, была практически идентичной, удалось обнаружить статистически значимую разницу по количеству нечитаемых таблиц Е.Б. Рабкина между I и II, III группами (табл.6). Менее выраженная дисхроматопсия была установлена в I группе, что, вероятно, связано с более сохранных центральным/парацентральным полем зрения. Между степенью дисхроматопсии и изменениями поля зрения была выявлена корреляционная связь. Коэффициент гамма-корреляции составил 0,55 (p 0,05).
Показатели остроты зрения и цветового зрения у пациентов с БШ в зависимости от изменения статической периметрии.
Как принято считать, БШ - это дистрофия центральной зоны сетчатки, характеризующаяся формированием центрального атрофического очага. Тем не менее полученные данные компьютерной периметрии демонстрируют изменения не только центрального, но и во многих случаях периферического поля зрения, что важно для оценки нарушений всего фоторецепторного аппарата глаза. 3.2.4. Офтальмоскопическая и аутофлюоресцентная картина.
Клинические характеристики пациентов при трех типах болезни Штаргардта. На основании офтальмоскопической и аутофлюоресцентной картины в зависимости от наличия дистрофического очага и распространенности желтопятнистой крапчатости пациенты были разделены на три группы в зависимости от типа БШ: БШ I тип – 33 пациентов (66 глаза) с центральным атрофическим очагом; БШ II тип – 13 пациентов (26 глаз) с центральным атрофическим очагом и локализованными пара- и перифовеальными желтовато-белыми пятнами; БШ III типа - 14 пациентов (28 глаз) с центральным атрофическим очагом и многочисленными желтовато-белыми пятнами по всему глазному дну, а также с обширными атрофическими изменениями РПЭ (табл.7, рис.15-17). При сравнении показателей возраста начала и длительности заболевания, остроты зрения, цветового зрения не было получено значимой разницы у пациентов с 3 типами БШ. Распределение пациентов по типу БШ. Тип БШ Кол-во пациентов/глаз Возрастначалазаболевания Длительность заболевания Острота зрения Офтальмоскопическая картина пациента М., 48 лет с БШ: 2 тип -атрофический очаг в центральной зоне, окруженный желтопятнистой крапчатостью. Рисунок 17. Офтальмоскопическая картина пациента Ю., 12 лет с БШ: 3 тип - атрофический очаг в центральной зоне с желтопятнистой крапчатостью, распространяющейся за пределы сосудистых аркад.
На рис. 18-20 приведены примеры аутофлюоресцентной картины пациентов с тремя типами БШ, на которых дифференцированы участки гиперфлюоресценции, соответствующие отложениям липофусцина в клетках пигментного эпителия, и участки гипофлюоресценции в зонах атрофии пигментного эпителия. Во всех случаях было обнаружено наличие патологического очага гипофлюоресценции в макулярной области. В некоторых случаях отмечен ареол гиперфлюоресценции вокруг гипофлюоресцентной зоны. При 2 и 3 типе БШ выявлены множественные мелкие очаги гиперфлюоресценции, расположенные вокруг дистрофического очага и/или достигающие сосудистых аркад и распространяющиеся за ее пределы, обусловленные скоплением липофусцин-подобного материала в РПЭ. Рисунок 18. Аутофлюоресцентная картина пациента А., 26 лет с БШ, 1 тип: 1 - ареол гиперфлюоресценции, 2 - участки гипофлюоресценции.
Молекулярно-генетическое исследование генов ABCA4, ELOVL4, PROM1 и CNGB3 методом высокопроизводительного параллельного секвенирования
В подавляющем большинстве случаев причиной БШ являются мутации в гене ABCA4 (MIM: 601691), что делает его одним из важнейших локусов этого заболевания. В настоящее время в этом гене описано более 800 мутаций, среди которых были выделены 5 наиболее частых – p.G863A, p.L541P, p.A1038V, p.G1961E, p.P1380L [86,91, 153].
В данной работе молекулярно-генетическое исследование 5 наиболее частых мутаций гена ABCA4 выполненное 54 пациентам с БШ, позволило выявить по крайней мере одну мутацию у 27 пациентов (50%) (табл. 27, рис.30). При этом гаплотип L541P/A1038V, обнаруженный у 15 пациентов, принимали за единую мутацию (в зарубежной литературе часто обозначают термином «комплексная мутация»).
БШ, обусловленная мутациями в гене ABCA4, наследуется по аутосомно-рецессивному типу, поэтому для молекулярно-генетического подтверждения клинического диагноза БШ необходимо обнаружение у пациента по крайней мере двух патогенных мутаций в этом гене. При скрининге 5 наиболее частых мутаций в гене ABCA4 две мутации были выявлены у 7 из 54 больных (13%).
Из 5 мутаций в гене ABCA4, ранее признанных как наиболее частые, действительно распространенными в выборке российских больных с БШ являются три – p.L541P, p.A1038V и p.G1961E, причём мутации p.L541P, p.A1038V у 56% пациентов с выявленными мутациями составляют гаплотип, то есть представляют собой единую, комплексную, мутацию. Низкая эффективность полного молекулярно-генетического подтверждения диагноза БШ по результатам скрининга 5 наиболее частых мутаций в ABCA4 может быть объяснена тремя причинами: ошибками клинической диагностики; наличием у больных минорных мутаций в гене ABCA4, не вошедших в панель частых мутаций, и высокой представленностью в исследованной выборке больных мутаций в других генах, ассоциированных с БШ. Для уточнения вклада каждой из перечисленных причин и для совершенствования молекулярно-генетической диагностики БШ в России была обследована случайная подвыборка пациентов (25 из 54 больных) методом высокопроизводительного параллельного секвенирования генов ABCA4, ELOVL4, PROM1 и CNGB3.
Набор генов для включения в панель для скрининга мутаций при БШ определен по результатам анализа профильной научной литературы. В панель включены гены ABCA4 и CNGB3, мутации в которых обуславливают аутосомно-рецессивные случаи БШ, и гены ELOVL4 и PROM1, повреждения которых ассоциированы с аутосомно-доминантной формой заболевания. Дизайн системы праймеров для геномного секвенирования обеспечивает полное покрытие всех кодирующих областей выбранных для исследования генов, а также некодирующих участков концевых экзонов и участков генов, мутации в которых могут приводить к нарушениям сплайсинга РНК.
Для обогащения образцов ДНК фрагментами целевых участков генома методом AmpliSeq разработали два пула праймеров (в общей сложности 294 пары праймеров), обеспечивающие полное покрытие исследуемых участков ABCA4, ELOVL4, PROM1 и CNGB3. Дизайн панели предполагает 99%-ное покрытие прилежащих к экзонам интронных последовательностей протяженностью не менее 100 п.н. В состав разработанной панели включили 33 пары праймеров для секвенирования известных на сегодняшний день минорных экзонов ABCA4. При расчете границ сайтов сплайсинга минорных экзонов использовали схему сайта сплайсинга, опубликованную Braun с соавт. [48], в соответствии с которой акцепторный сайт сплайсинга располагается в границах от -2 до +13 нуклеотидов от начала экзона, а донорный сайт сплайсинга – от -5 до +2 нуклеотидов от конца экзона. Схема расположения минорных экзонов гена ABCA4 и перекрывающих их ампликонов, секвенирование которых проведено в нашем исследовании, показана на рис.31.
Генетическая панель для диагностики БШ была разработана с учетом недостатков предыдущих вариантов NGS - панелей: неполное покрытие кодирующих областей, слабое покрытие прилежащих интронных областей, погрешности дизайна праймеров, избыточный состав секвенируемых последовательностей (генов).
По результатам высокопроизводительного параллельного секвенирования генов ABCA4, ELOVL4, PROM1 и CNGB3, по крайней мере одна мутация в одном из 4 генов была обнаружена у 23 из 25 больных (91,7%). Полное молекулярно-генетическое подтверждение клинического диагноза БШ получено для 21 из 25 пациентов (84%). Один патогенный аллель гена ABCA4 в гетерозиготном состоянии выявлен у 2 больных. Подавляющее большинство мутаций пришлось на ген ABCA4 (83% от всех пациентов с выявленными мутациями); мутации в гене проминина выявлены у 3-х человек (PROM1:exon10:c.1117C T:p.R373C; c. 1114C T:p.Q372X), у одного пациента лбнаружено две мутации в гене CNGB3 (exon10:c.1148delC:p.T383fs; exon6:c.819_826del:p.P273fs). Выявленные мутации представлены в табл. 28. Структура типов 23 выявленных мутаций оказалась следующей: 13 миссенс-мутаций (56,5%), 4 нонсенс-мутаций (17,4%), 4 мутации сайта сплайсинга (17,4%), 2 делеции (8,7%).