Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 12
1.1 Склера, ее строение, функции и биомеханические свойства 12
1.2. Современные взгляды на роль склеры в патогенезе близорукости 16
1.3. Кросслинкинг склеры с рибофлавином и ультрафиолетом А .22
Глава II. Материал и методы исследования 34
Общая характеристика экспериментального материала 34
Статистическая обработка 36
2.1. Влияние кросслинкинга склеры с рибофлавином и UVA на биомеханические свойства склеральной ткани .36
2.2. Влияние кросслинкинга склеры с рибофлавином и UVA на структуру склеральной ткани 39
2.3. Электронно-микроскопическое исследование изменений ультраструктуры склеры в результате КЛС 40
2.4. Расчёт показателя поглощения ультрафиолетового излучения группы А склеральной тканью 42
2.5. Сравнение влияния фотосенсибилизаторов на водной и декстрановой основах на проницаемость склеральной ткани для ультрафиолетового излучения группы А .44
2.6. Оценка сохранности структур глаза после проведения кросслинкинга склеры с рибофлавином/UVA 45
Глава III. Результаты собственных исследований 49
3.1 Результаты исследования влияния кросслинкинга склеры с рибофлавином и UVA на биомеханические свойства склеральной ткани 49
3.2 Результаты исследования по оценке влияния кросслинкинга склеры с рибофлавином и UVA на структуру склеральной ткани 50
3.3. Результаты исследования влияния кросслинкинга склеры с рибофлавином и UVA на ультраструктуру склеральной ткани .52
3.4. Расчёт показателя поглощения ультрафиолетового излучения группы А склеральной тканью 55
3.6. Расчет пороговых параметров ультрафиолетового облучения при проведении процедуры КЛС с рибофлавином и УФ-А в зависимости от толщины склеры 61
3.7. Сравнение влияния фотосенсибилизаторов на водной и декстрановой основах на проницаемость склеральной ткани для ультрафиолетового излучения группы А 63
3.8. Результаты исследования по оценке сохранности структур глаза после проведения ультрафиолетового кросслинкинга склеры .66
Глава IV. Кросслинкинг склеры с рибофлавином/ультрафиолетом А на устройстве “УФалинк С” 74
Заключение .84
Выводы 92
Практические рекомендации 94
Литература 95
- Кросслинкинг склеры с рибофлавином и ультрафиолетом А
- Оценка сохранности структур глаза после проведения кросслинкинга склеры с рибофлавином/UVA
- Результаты исследования по оценке сохранности структур глаза после проведения ультрафиолетового кросслинкинга склеры
- Кросслинкинг склеры с рибофлавином/ультрафиолетом А на устройстве “УФалинк С”
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Лечение прогрессирующей
близорукости до сих пор остается нерешенной проблемой офтальмологии (Pan C.W., 2012). Особую опасность представляют осложнения данного заболевания, приводящие к необратимой потере зрения (Rada J.A.S., 2006).
Склеропластические операции, направленные на предотвращение
прогрессирования миопии, заключаются в укреплении склеры
биологическими или синтетическими трансплантатами (Аветисов Э.С., 2002, Тарутта Е.П., 2017). Однако, склеропластика не всегда эффективна и возможны ее серьезные осложнения: ущемление зрительного нерва и сосудов глазного яблока, развитие иридоциклита и эндофтальмита (Лазаренко В.И., 2014). Кроме того, при склеропластических операциях происходит предупреждение растяжения склеры за счет создания внешнего “каркаса”, при отсутствии изменения структуры самой склеральной ткани. При прогрессирующей же близорукости одним из ключевых звеньев патогенеза является снижение прочности склеры из-за нарушений ее структуры, снижения количества внутри- и межмолекулярных связей (Rada J.A., 2006, Иомдина Е.Н., 2015). В связи с этим, более патогенетически обоснованным методом лечения заболевания выглядит кросслинкинг склеры (Wollensak G., 2009, Liu T.-X., 2013, Dotan A., 2014).
Кросслинкинг (перекрестное сшивание) – это образование
дополнительных химических связей между макромолекулами, приводящее к
увеличению прочности ткани. Уже более 10 лет данный метод успешно
применяется для лечения кератэктазий (Wollensak G., 2003, Бикбов М.М.,
2011, Малюгин Б.Э., 2014, Корниловский И.М., 2016). Высказываются
предположения о перспективности использования кросслинкинга
(перекрестного сшивания) склеры с рибофлавином/ультрафиолетом А (UVA) при прогрессирующей близорукости.
Степень разработанности темы исследования
В ряде экспериментальных работ было показано положительное влияние кросслинкинга на биомеханическую прочность склеральной ткани, замедление прогрессирования смоделированной близорукости (Wollensak G., 2004, Dotan A., 2014, Борзенок С.А., 2016, Liu S., 2016). Однако, лишь единичные работы посвящены гистологическим изменениям, происходящим в склере и других структурах глазного яблока под воздействием ультрафиолетового облучения в присутствии фотосенсибилизатора (Choi S., 2013, Wang M., 2015). Недостаточно изучена возможность использования рибофлавина на основе декстрана при проведении процедуры (Wollensak G., 2005). Отсутствует четкая система, обосновывающая выбор параметров ультрафиолетового облучения. Кроме того, все исследования проводились с применением аппаратов, предназначенных для проведения фотохимического кросслинкинга роговицы, а не склеры. Их применение в клинике для
ультрафиолетовой обработки экваториальных и заднеполярных областей фиброзной оболочки крайне затруднительно или совсем не возможно.
В связи с этим актуальной является комплексная экспериментальная разработка метода кросслинкинга склеры с рибофлавином/UVA.
Цель исследования: Обосновать эффективность и безопасность перекрестного сшивания коллагена склеры под воздействием рибофлавина и ультрафиолетового излучения.
Задачи исследования
-
Оценить влияние кросслинкинга склеры с рибофлавином и УФ-А на биомеханические свойства и структуру склеральной ткани.
-
Рассчитать проницаемость интактной и пропитанной фотосенсибилизаторами на водной и декстрановой основе склеральной ткани для ультрафиолета А, предложить способ расчета пороговых параметров ультрафиолетового облучения при проведении процедуры кросслинкинга склеры в зависимости от ее толщины.
-
Оценить безопасность кросслинкинга склеры с рибофлавином и УФ-А путем определения сохранности структур глаза после процедуры.
-
Разработать и апробировать в эксперименте щадящую методику проведения фотополимеризации склеры с применением устройства “УФалинк С”.
Научная новизна исследования
Проведена оценка влияния кросслинкинга склеры на ее структуру по данным световой и электронной микроскопии. При этом впервые выполнен объективный морфометрический анализ изменений коллагенового каркаса склеры.
Впервые изучено влияние кросслинкинга склеры с рибофлавином/УФ-А на зрительный нерв по данным световой микроскопии.
Впервые проведена прижизненная оценка безопасности процедуры кросслинкинга склеры с рибофлавином/УФ-А методом оптической когерентной томографии.
Впервые оценена проницаемость интактной и пропитанной
фотосенсибилизаторами на водной и декстрановой основе склеральной ткани для ультрафиолета А.
Теоретическая и практическая значимость работы
В эксперименте изучено влияние кросслинкинга склеры с рибофлавином
и УФ-А на биомеханические свойства склеральной ткани. Разработан
инструмент для формирования стандартизованных склеральных образцов,
повышающий точность проведения подобных экспериментов (патент РФ на
полезную модель №172812 “Инструмент для получения
стандартизированных трансплантатов склеры” от 25.07.2017).
Проведена оценка влияния кросслинкинга склеры на ее структуру по данным световой и электронной микроскопии.
Исследована безопасность ультрафиолетового кросслинкинга склеры для структур глаза с помощью оптической когерентной томографии, а также электрофизиологическими и гистологическими методами.
Разработан способ расчета пороговых параметров ультрафиолетового облучения при проведении процедуры ультрафиолетового кросслинкинга склеры в зависимости от ее толщины.
Доказана нецелесообразность использования декстрана в составе фотосенсибилизатора при проведении кросслинкинга склеры в связи с его выраженным дегидратирующим эффектом, который приводит к снижению фотоэкранирующих свойств склеральной ткани.
Разработана и апробирована в эксперименте щадящая технология ультрафиолетового кросслинкинга склеры с использованием устройства “УФалинк С”. Разработаны инструменты, обеспечивающие более быстрое, экономичное и менее травматичное выполнение данной процедуры: “Устройство для инстилляции фотосенсибилизатора в субтеноново пространство” (патент РФ на полезную модель № 167631 от 10.01.2017 г.), “Шпатель для отсепаровки конъюнктивы и теноновой оболочки от глазного яблока” (патент РФ на полезную модель № 161346 от 28.03.2016 г.).
Методология и методы исследования
Методологической основой диссертационной работы явилось
последовательное применение методов научного познания. Работа выполнена в дизайне сравнительного открытого исследования с использованием инструментальных, аналитических и статистических методов.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Кросслинкинг склеры с рибофлавином/ультрафиолетом А приводит к увеличению диаметра коллагеновых фибрилл, плотности упаковки коллагеновых волокон и биомеханической прочности склеральной ткани.
-
Выполнение процедуры кросслинкинга склеры по предложенному протоколу (насыщение склеры 0,1% раствором рибофлавина на водной основе в течение 20 минут с последующим облучением ультрафиолетом А (длина волны 370±5 нм) мощностью 3 мВт/см в течение 6 циклов по 5 минут с дополнительной инстилляцией фотосенсибилизатора между циклами) является безопасным для структур глаза в экспериментах in vivo.
-
Использование устройства “УФалинк С” позволяет эффективно и безопасно проводить щадящий ультрафиолетовый кросслинкинг склеры в области экватора и заднего полюса.
Степень достоверности и апробация работы
Достоверность научных выводов и положений основана на достаточном количестве экспериментальных наблюдений, применении современных методов исследования и статистической обработке полученных данных. Результаты диссертационной работы проанализированы с помощью общепринятых методов статистики и методологии доказательной медицины.
Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научно-практической конференции с международным участием «Современные технологии катарактальной и рефракционной хирургии» (г. Москва, 2016), XII Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы офтальмологии» (г. Москва, 2017), «World Ophthalmology Congress 2016» (г. Гваделахара, Мексика, 2016), научно-практических конференциях по офтальмохирургии с международным участием «Восток-Запад» (г. Уфа, 2015, 2017).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 11 научных работ в отечественной печати, из них 5 статей – в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации результатов кандидатских и докторских диссертаций. Получены 4 патента РФ на полезную модель.
Личный вклад автора
Личное участие автора состоит в осуществлении информационного поиска, постановке цели и задач работы, проведении экспериментальных исследований, статистической обработки, анализа и интерпретации полученных результатов с формулировкой основных положений, выводов и практических рекомендаций.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Диссертационная работа соответствует паспорту научной специальности 14.01.07 – глазные болезни: изучение болезней, патологии глаза, век и слезных органов, разработка методов их диагностики, лечения и профилактики.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 114 страницах, состоит из введения, обзора литературы, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов и, практических рекомендаций. Работа содержит 19 таблиц и 28 рисунков. Список литературы включает 181 источник (84 отечественных и 97 иностранных).
Кросслинкинг склеры с рибофлавином и ультрафиолетом А
Первое сообщение о влиянии ультрафиолетового кросслинкинга на биомеханические свойства склеры опубликовано в 2004 г. G. Wollensak и E. Spoerl. Материалом для исследования служили трупные человеческие и свиные глаза. Процедуру кросслинкинга начинали с инстилляции 0,1% раствора рибофлавина (10 мг рибофлавин-5-фосфата в 10 мл 20% декстрана-Т-500) в течение 10 минут. Затем выполняли облучение склеры ультрафиолетом группы А (длина волны 370±5 нм) мощностью 3 мВт/см в течение 30 минут. О прочностных характеристиках склеры судили по показателям напряжения-деформации и по модулю Юнга. В результате проведения процедуры ультрафиолетового кросслинкинга G. Wollensak и E. Spoerl наблюдали выраженное увеличение жесткости склеры. T.-X. Liu и Z. Wang (2013) получили схожие результаты. Свое исследование они проводили на кадаверных свиных глазах, используя аналогичные параметры кросслинкинга с рибофлавином/UVA.
Данные, не согласующиеся с результатами предыдущих двух работ, получили Y. Zhang с соавт. (2014). Они проводили исследование на кадаверных глазах кроликов, свиней и человека. Процедуру кросслинкинга начинали с инстилляции 0,1% водного раствора рибофлавина в течение 15 минут. Затем выполняли ультрафиолетовое облучение склеры (длина волны 365 нм) мощностью 3 мВт/см в течение 40 минут. Вычисляли показатели напряжения-деформации и модуль Юнга для оценки прочностных свойств склеры. Предельное напряжение и модуль Юнга значимо увеличились после процедуры лишь у склеры глаз кроликов. Увеличение предельного напряжения и отсутствие статистически значимого изменения модуля Юнга выявили на свиной склере. Прочностные характеристики склеры человека остались неизменными после проведения кросслинкинга с рибофлавином/UV-A. Y. Zhang с соавт. высказали предположение, что G. Wollensak и E. Spoerl (2004) выявили повышение биомеханической прочности свиной и человеческой склеры в результате процедуры из-за перекрытия полей (и соответствующего увеличения мощности) ультрафиолетового излучения, создаваемого двойными диодами. G. Wollensak и E. Iomdina (2009) исследовали стабильность биомеханического эффекта, достигаемого в результате ультрафиолетового кросслинкинга склеры. Материалом для эксперимента послужили 9 кроликов in vivo. Процедуру начинали с инстилляции на поверхность склеры 0,1% раствора рибофлавин-5-фосфата в физиологическом растворе в течение 5 минут. Затем выполняли ультрафиолетовое облучение (длина волны 370 нм) мощностью 3 мВт/см в течение 30 минут. Биомеханические показатели склеральной ткани измеряли через 3 дня, 4 и 8 месяцев. Авторы наблюдали стойкость достигнутого биомеханического эффекта процедуры кросслинкинга склеры на протяжении всего периода наблюдения. Важным моментом является изменение толщины склеры в результате кросслинкинга с рибофлавином/UVA, так как при осевой миопии происходит ее истончение (Curtin B.J., 1979; Liu K.R., 1986). Экспериментальные исследования, выполненные на склере свиней, кроликов и человека ex vivo, а также на глазах лабораторных животных in vivo, показали отсутствие статистически значимого влияния ультрафиолетового кросслинкинга на толщину склеры (Wollensak G., 2005, 2009; Liu T.-X., 2013; Zhang Y., 2014).
G.-B. Jung с соавт. (2011) исследовали влияние кросслинкинга с рибофлавином/UVA на структуру склеральной ткани. Материалом для эксперимента послужил 1 трупный глаз человека. Процедуру кросслинкинга начинали с инстилляции 0,1% раствора рибофлавин-5-фосфата на основе декстрана в течение 10 минут. Затем выполняли ультрафиолетовое облучение склеры (длина волны 370 нм) мощностью 3 мВт/см в течение 30 минут. Влияние ультрафиолетового кросслинкинга на структуру склеры оценивали методами световой и атомно-силовой микроскопии. Атомно-силовая микроскопия – это метод с высокой разрешающей способностью, используемый для изучения поверхности материала путем анализа силы взаимодействия иглы зонда с исследуемым образцом (Binnig G., 1986; Гусев А.И., 2007). После проведения ультрафиолетового кросслинкинга в склере наблюдался разнонаправленный, перекрещенный ход коллагеновых фибрилл. В интактной же склере, по данным атомно-соловой микроскопии, фибриллы располагались параллельно друг другу. Световая микроскопия показала более плотное расположение коллагеновых волокон в UVA-обработанной склере по сравнению с контролем. G.-B. Jung с соавт. считают, что полученные ими данные подтверждают образование дополнительных перекрестных сшивок в склере в результате проведения кросслинкинга с рибофлавином/UVA. Изменение структуры UVA-обработанной склеры также наблюдали S. Choi с соавт. (2013) с помощью электронной микроскопии. Они выявили увеличение на 27% диаметра коллагеновых фибрилл склеры после проведения кросслинкинга. В связи с тем, что четко не определены оптимальные параметры ультрафиолетового облучения и длительность инстилляций фотосенсибилизатора для проведения кросслинкинга склеры, ряд авторов посвятили свои исследования этим вопросам. Так Y. Zhang с соавт. (2013) считают, что продолжительность облучения склеры ультрафиолетом А должна составлять 40 минут при мощности 3 мВт/см (длина волны – 365 нм). Они проводили исследование in vivo на 36 кроликах. Склеральные образцы, облученные в течение 10 и 20 минут, по своим биомеханическим свойствам практически не отличались от контрольных интактных. При облучении в течение 40 минут и более наблюдалось значительное увеличение предельного напряжения и модуля Юнга. Однако, в глазах, облученных в течение 50 и 60 минут с помощью световой микроскопии выявили повреждение сетчатки.
Оптимальную продолжительность инстилляций фотосенсибилизатора до облучения ультрафиолетом А определяли M. Wang с соавт. (2012). Исследование проводили на 15 трупных человеческих глазах, которые были разделены на группы в зависимости от продолжительности пропитывания склеры 0,1% раствором рибофлавина (5, 10, 20 или 30 минут). После проведения процедуры кросслинкинга измеряли показатели напряжения-деформации склеральных образцов. Выявили, что напряжение и модуль Юнга увеличивались с увеличением продолжительности инстилляции фотосенсибилизатора. В случаях с 20-и и 30-минутным пропитыванием склеры не обнаружили статистически достоверной разницы. Таким образом, исследователи сделали вывод, что продолжительность инстилляций рибофлавина до проведения облучения UVA должна составлять 20 минут.
Представляет интерес экспериментальное исследование по изучению влияния кросслинкинга склеры на прогрессирование миопии, cмоделированной на животных. Dotan A. с соавт. (2014, 2016) провели исследование на 22 кроликах в возрасте 13 дней. Длину глаз измеряли ультразвуковым методом (А-сканирование). На правых глазах кроликов выполнили круговой разрез конъюнктивы. В опытной группе (11 кроликов) провели кросслинкинг склеры, в контрольной (также 11 кроликов) – его не проводили. В обеих группах выполнили тарзорафию, которая позволила вызвать рост передне-задней оси глаз в результате окклюзии. На каждый квадрант правых глаз опытной группы приходилась зона облучения площадью 0,4-1,2 см. В качестве фотосенсибилизатора использовали 0,1% раствор рибофлавина-5-фосфата без декстрана в течение 20 секунд до облучения и каждые 20 секунд в течение облучения. Облучение проводили ультрафиолетом А (370 нм) мощностью 57 мВт/см в течение 200 секунд. Веки открывали на 55 день и измеряли длину глаз. В контрольной группе средняя длина правых глаз выросла с 10,50±0,67 мм до 15,69±0,39 мм (разница составила 5,19±0,85 мм). В опытной группе соответствующие показатели составили 10,68±0,74 мм и 14,29±0,3 мм (разница – 3,61±0,76 мм). Различия между группами были статистически достоверными. Таким образом, исследователи продемонстрировали, что кросслинкинг склеры с рибофлавином и UVA препятствует удлинению глаз кроликов при моделировании миопии с помощью окклюзии.
Описано и отрицательное воздействие кросслинкинга склеры на структуры глаза. G. Wollensak с соавт. (2005) на 6 кроликах (6 глаз) in vivo выявили серьезные побочные эффекты процедуры кросслинкинга склеры в виде потери фоторецепторов, наружного ядерного слоя и пигментного эпителия сетчатки на большом протяжении. Кроме того, отмечалось поражение роговицы у двух кроликов (2 глаза) в виде стромального отека, потери кератоцитов и эпителиальных клеток на стороне, где проводилось облучение. Повреждение роговицы связали с попаданием на нее ультрафиолетового излучения. Позднее, поражение сетчатки объяснили высокой мощностью UVA (до 6 мВт/см в местах перекрытия зон облучения от двух двойных диодов) и истончением склеры в результате ее дегидратации декстраном, входившим в состав фотосенсибилизатора (Wollensak G., 2009). Имеются единичные сообщения о применении кросслинкинга склеры в клинике. Поляк А.С. с соавт. (2009) наблюдали 6 пациентов (12 глаз) с прогрессирующей близорукостью средней степени (степень прогрессирования составляла более 1 – 1,5 D в год). На правых глазах проводили процедуру кросслинкинга склеры, левые глаза использовали в качестве контроля. Методика операции была следующей: с помощью специально разработанной системы доставки ультрафиолетового излучения (370 нм) облучали полосу склеры в одном сегменте с 10 до 15 мм от экватора в течение 30 минут. Облучавшаяся зона склеры предварительно насыщалась раствором рибофлавина на декстране в течение 10 минут. Динамическое наблюдение пациентов проводили до 6 месяцев после процедуры. Во всех случаях применения кросслинкинга склеры наблюдалась стабилизация близорукости. На контрольных глазах в 4 случаях отмечалось незначительное прогрессирование миопии (-4,5±0,5 D по сравнению с первоначальной рефракцией -4,0±0,5 D). На 2 контрольных глазах наблюдалась стабилизация процесса. Однако, из тезиса Поляка А.С. с соавт. не до конца ясно каким образом авторы проводили кросслинкинг склеры. Также нет данных о течении близорукости у наблюдавшихся больных в более поздние послеоперационные сроки и о проведении аналогичной процедуры у других пациентов.
Оценка сохранности структур глаза после проведения кросслинкинга склеры с рибофлавином/UVA
Исследование проводили на 34 кроликах породы Шиншилла (34 глаза) in vivo. На правых глазах выполняли процедуру кросслинкинга склеры с рибофлавином/ультрафиолетом А, левые – служили контролем.
Кросслинкинг склеры выполняли под внутримышечной анестезией препаратом «Ксилазин» 2% в дозе 0,2 мл/кг и местной анестезией 0,4% раствором Оксибупрокаина («Инокаин»). После установки блефаростата проводили циркулярный разрез конъюнктивы и теноновой оболочки в паралимбальной зоне и отсепаровывали их от глазного яблока тупым путем. Верхнюю и наружную прямые мышцы глазного яблока брали на швы-держатели и открывали доступ к верхне-наружному сектору глазного яблока. Выполняли насыщение склеры фотосенсибилизатором путем инстилляции 0,1% водного раствора рибофлавина мононуклеотида в течение 20 минут. Затем проводили облучение склеры ультрафиолетом А (длина волны 370±5 нм, мощность излучения – 3 мВт/см) в течение 6 циклов по 5 минут (суммарное время облучения – 30 минут). Между циклами дополнительно инстиллировали раствор фотосенсибилизатора (2-3 капли). Облучение проводили с помощью офтальмологического аппарата для УФ-кросслинкинга “УФалинк” (Россия) (рисунок 7). После завершения процедуры швы-держатели удаляли. На конъюнктивальный разрез накладывали несколько узловых швов 8/0.
В послеоперационном периоде проводили местную антибактериальную и противовоспалительную терапию в течение 1 недели (0,5% раствор левофлоксацина и 0,1% раствор дексаметазона 3 раза в день).
Офтальмобиомикроскопическое исследование выполняли с помощью фотощелевой лампы через 1 сутки, неделю и месяц после операции. Оценивали состояние конъюнктивы, склеры и оптических сред глаза. С помощью бесконтактной асферической высокодиоптрийной линзы 90 D выполняли осмотр глазного дна.
Оптическая когерентная томография сетчатки. После седации внутримышечным введением 2% раствора ксилазина гидрохлорида кролика оборачивали в стерильную салфетку и подносили к подбороднику аппарата спектральной оптической когерентной томографии высокого разрешения “DRI OCT Triton” в боковой позе, удобной для обследования. На каждом глазу выполняли по 3 последовательных снимка сетчатки в режиме “Macula Radial”. Оценивали состояние слоев сетчатки, хориоидеи и склеры, а также проводили измерение их толщины. Исследование выполнялось до начала эксперимента, а также на 1, 7 и 30 сутки после операции.
Метод электрофизиологической оценки. С целью оценки функционального состояния сетчатки выполняли регистрацию ЭРГ до операции, через 1 сутки, неделю и месяц после проведения кросслинкинга. За 20 минут до измерений проводили седацию внутримышечным введением раствора ксилазина гидрохлорида (1-2 мг на кг веса животного), а также инстиллировали 1% тропикамид для получения медикаментозного мидриаза с целью унификации условий записи ЭРГ. Регистрацию электроретинографических показателей проводили с помощью электрофизиологической установки «Нейро-ЭРГ» (ООО «Нейрософт», Россия). Под местной анестезией 0,4% раствором оксибупрокаина за нижнее веко кролика закрепляли активный электрод (“крючок”). На ушах лабораторного животного располагали референтный и заземляющий электроды. В ходе измерений положение электродов не менялось. Пороговое сопротивление под электродами составляло 5 кОм. Исследование выполняли в условиях темновой адаптации. Для проведения световой стимуляции использовали мини-ганцфельд сферу с частотой стимуляции 0,5 Гц, полосой пропускания усилителя 2200 Гц. Изучали палочковую, колбочковую и максимальную ЭРГ. Условия стимуляции и форма кривой соответствовали смешанному палочко-колбочковому ответу сетчатки и стандарту Международного общества клинической физиологии зрения ISCEV 2015 (Marmor M.F., 1999; McCulloch D.L., 2015). Стандартизацию ЭРГ осуществляли путем троекратной регистрации исходных (нормальных) показателей на всех глазах животных во всех группах наблюдения (Куликов А.Н., 2006, 2007). При анализе использовали усредненную запись ЭРГ, оценивая амплитудные характеристики а- и b-волн, их латентность, а также изменение конфигураций волн. Данные, полученные после хирургического вмешательства, в ходе эксперимента сравнивались с дооперационной нормой и дополнительным контролем, которым являлся левый интактный глаз у всех кроликов.
Световая микроскопия. 15 кроликов выводили из эксперимента через 1 сутки, 1 неделю и 1 месяц после операции (по 5 животных на каждый срок). Глаза энуклеировали и фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Выкраивали облученный участок склеры с прилежащими внутренними оболочками, роговицу и зрительный нерв. В контрольной группе выкраивали соответствующий участок. Полученные образцы проводили через спирты и заливали в парафин. Готовили гистологические срезы толщиной 5-7 мкм, окрашивали их гематоксилином и эозином. Визуальный анализ препаратов проводили с помощью светового микроскопа Leica DME при различных увеличениях (х40, х100, х200, х400, х1000). Фотоснимки гистологических препаратов делали с помощью микроскопа Leica DME и цифровой фотокамеры Leica DC4.
Исследование проводили в соответствии с общепринятыми принципами гуманности и существующими международными правилами по работе с лабораторными животными, установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных (принята 18.03.1986 г. и подтверждена 15.06.2006 г. в г. Страсбург, Франция).
Результаты исследования по оценке сохранности структур глаза после проведения ультрафиолетового кросслинкинга склеры
При проведении биомикроскопического исследования через 1 сутки после процедуры кросслинкинга у кроликов наблюдались незначительные блефароспазм и инъекция конъюнктивы оперированного глаза. Нарушения прозрачности оптических сред не выявлялось. Воспалительные явления постепенно стихали и полностью исчезали через несколько дней после операции.
При офтальмоскопии экспериментальных животных во все сроки наблюдения хорошо просматривались как поверхность зрительного нерва, так и волокна медуллярной лучистости вокруг него. Определялась близкая к равномерной пигментация сетчатки.
Оптическая когерентная томография не выявила каких-либо патологических изменений после проведения SCXL. На снимках четко визуализировались слои сетчатки, хориоидея и склера (рисунок 13). Результаты измерения толщины оболочек глаз представлены в таблицах 13-15.
Проведенная статистическая обработка полученных результатов не выявила статистически значимой разницы между исследованными группами (p 0,05).
Результаты электрофизиологического исследования. Амплитудно временные характеристики и форма электроретинограммы экспериментального (правого) и контрольного (левого) глаз кроликов были идентичными во все сроки наблюдения, имели классический вид. Все волны ЭРГ хорошо выражены, что свидетельствует об удовлетворительном функциональном состоянии ретинальных нейрорецепторных механизмов.
Результаты количественной оценки амплитуд волн представлены в таблицах 16-18.
Проведенная статистическая обработка полученных результатов не выявила статистически значимой разницы между исследованными группами (p 0,05).
Полученные данные отражают стабильность кинетики процессов электрогенеза, что свидетельствует об отсутствии выраженного влияния процедуры SCXL на фундаментальные процессы генерации биоэлектрического импульса в сетчатке (Николаенко Е.Н., Сосновский С.В., 2015).
Результаты световой микроскопии. В дополнение к прижизненным методам оценки состояния сетчатки при воздействии КЛС нами было проведено гистологическое исследование методом световой микроскопии. При энуклеации оперированных глаз отмечалось свободное отделение конъюнктивы и теноновой оболочки от поверхности склеры, не было выявлено выраженного фиброзного процесса.
При световой микроскопии гистологических препаратов в сетчатке, зрительном нерве и роговице не было выявлено патологических изменений ни в один из сроков наблюдения (1 сутки, 1 неделя, 1 месяц) (рисунки 14-18).
G. Wollensak с соавт. (2005 г.) проводили схожее исследование и выявили поражение сетчатки в виде потери фоторецепторов, наружного ядерного слоя и пигментного эпителия в результате проведения кросслинкинга склеры. Данный побочный эффект процедуры авторы объяснили использованием UVA высокой мощности (до 6 мВт/см) и истончением склеры в результате ее дегидратации декстраном, входившим в состав фотосенсибилизатора.
Таким образом, для безопасного проведения кросслинкинга склеры с рибофлавином/UVA крайне важно учитывать дозу облучения ультрафиолетом А. Это подтверждается и работами других авторов. Так, Yali Zhang с соавт. наблюдали повреждение сетчатки кроликов в эксперименте при облучении склеры в течение 50 минут и более (мощность излучения 3 мВт/см). При сокращении времени воздействия UVA той же мощности (до 40 минут) патологических изменений выявлено не было.
В эксперименте мы использовали UVA мощностью 3 мВт/см в течение 30 минут и водный раствор рибофлавина без содержания декстрана и не выявили серьезных побочных эффектов процедуры.
Кросслинкинг склеры с рибофлавином/ультрафиолетом А на устройстве “УФалинк С”
В первых экспериментальных работах, посвященных ультрафиолетовому кросслинкингу склеры, применялись устройства, разработанные для ультрафиолетового облучения роговицы. Проведение процедуры в области экватора и заднего полюса при этом требовало обширного вмешательства – широкого разреза конъюнктивы, отсечения экстраокулярных мышц, интрасклерального наложения швов-держателей (Wollensak G., 2005; Dotan A., 2014; Wang M., 2015; Liu S., 2016). Очевидно, что выполнение кросслинкинга склеры подобным образом в клинике является неоправданно сложным, травматичным и поэтому, неприемлемым.
В связи с этим в Уфимском НИИ глазных болезней было разработано устройство для перекрестного сшивания коллагена склеры “УФалинк С”, предназначенное для облучения ультрафиолетом фиброзной оболочки глазного яблока в области экватора и заднего полюса (патент на полезную модель №144673 от 28.07.2014 г.). Особенностью данного устройства является наличие излучателя, выполненного в виде изогнутой полосы, содержащей светодиоды, которые и создают пучок ультрафиолетового света (рисунок 19).
Необходимо указать, что чуть позже в Московском НИИ глазных болезней им. Гельмгольца также было разработано устройство, предназначенное для малоинвазивного выполнения процедуры ультрафиолетового кросслинкинга склеры (патент РФ №161372 от 29.03.2016 г.). Данный аппарат имеет съемный металлический наконечник, содержащий 2 канала. В одном из них располагается многомодовое кварцевое оптоволокно, соединенное с источником ультрафиолетового излучения. Второй канал служит для доставки фотосенсибилизатора на поверхность склеры. Данное устройство было апробировано в экспериментах на кроликах in vivo. При этом отмечалось увеличение биомеханической прочности склеральной ткани, ее акустической плотности и уровня поперечной связанности склерального коллагена (Иомдина Е.Н., 2016). Однако, вызывает сомнения возможность малоинвазивного облучения склеры заднего полюса глазного яблока с помощью данного устройства ввиду особенностей конструкции его излучателя и большого фокусного расстояния. В устройстве же “УФалинк С” излучатель выполнен в виде изогнутой пластины с фокусировкой ультрафиолетовых лучей непосредственно на ее внутренней поверхности, что обеспечивает возможность UVA-обработки склеры глазного яблока области экватора и заднего полюса при полном контакте излучателя с поверхностью склеры (рисунок 20).
Кроме того, нами были разработаны инструменты, облегчающие проведение щадящего ультрафиолетового кросслинкинга склеры: шпатель для отсепаровки конъюнктивы и теноновой оболочки от глазного яблока (патент на полезную модель №161346 от 28.03.2016) и устройство для инстилляции фотосенсибилизатора в субтеноново пространство (патент на полезную модель №167631 от 10.01.2017) (рисунки 21, 22).
В экспериментах проводили оценку эффективности и безопасности кросслинкинга, выполненного с помощью данного устройства, путем изучения биомеханических свойств склеральной ткани и гистологической оценки сохранности структур глаз лабораторных животных после проведения процедуры in vivo.
Исследование проводили на 66 кроликах породы Шиншилла (132 глаза). На правом глазу выполняли процедуру кросслинкинга, левый глаз служил контролем.
Кросслинкинг склеры проводили под внутримышечной анестезией препаратом «Ксилазин» 2% в дозе 0,2 мл/кг и местной анестезией 0,4% раствором Оксибупрокаина («Инокаин»). После установки блефаростата в верхне-внутреннем и верхне-наружном секторах выполняли паралимбальный разрез конъюнктивы и теноновой оболочки длиной около 1 см для подхода к склеральной ткани. Через полученный разрез тупым путем формировали карман между склерой и теноновой оболочкой, в который инстиллировали 0,1% водный раствор рибофлавина мононуклеотида шприцом с канюлей. Таким образом насыщали склеру фотосенсибилизатором в течение 20 минут (рис. 23а).
Облучение фиброзной оболочки ультрафиолетом А выполняли с помощью устройства “УФалинк С”: излучатель аппарата вводили в сформированный карман и обеспечивали воздействие UVA на склеру в течение 30 минут (6 циклов по 5 минут) (рис. 23б).
В промежутках между циклами дополнительно инстиллировали фотосенсибилизатор в течение 20-30 секунд. После завершения облучения на конъюнктиву накладывали 1-2 узловых шва 8/0. В послеоперационном периоде проводили местную антибактериальную и противовоспалительную терапию в течение 1 недели (0,5% раствор левофлоксацина и 0,1% раствор дексаметазона 3 раза в день).
Лабораторных животных выводили из эксперимента через 1 сутки, 1 неделю и 1 месяц после операции (по 3 кролика на каждый срок). Глаза энуклеировали и фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина. Из верхне-наружного сектора каждого глазного яблока выкраивали склеральные лоскуты размером 3х10 мм, начиная от зрительного нерва, до фиксации в формалине. Полученные образцы склеры растягивали вдоль продольной оси на разрывной установке до их полного разрыва. При этом фиксировали величину растяжения образца и затрачиваемую на это силу. Затем рассчитывали предел прочности и модуль Юнга опытных и контрольных образцов.
Из верхне-внутреннего сектора каждого глазного яблока выкраивали облученный участок склеры с прилежащими внутренними оболочками, а также зрительный нерв после фиксации в формалине. Морфологические исследования данных структур проводили для выявления прямого или опосредованного повреждающего воздействия кросслинкинга. В контрольной группе выкраивали соответствующий участок. Полученные образцы проводили через спирты и заливали в парафин. Готовили гистологические срезы толщиной 5-7 мкм, окрашивали их гематоксилином и эозином. Визуальный анализ препаратов проводили с помощью светового микроскопа Leica DME при различных увеличениях (х40, х100, х200, х400, х1000). Фотоснимки гистологических препаратов делали с помощью микроскопа Leica DME и цифровой фотокамеры Leica DC4.
Исследование проводили в соответствии с общепринятыми принципами гуманности и существующими международными правилами по работе с лабораторными животными, установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных (принята 18.03.1986 г. и подтверждена 15.06.2006 г. в г. Страсбург, Франция).
Результаты. Полученные биомеханические показатели склеральных лоскутов представлены в таблице 19.
Таким образом, в результате кросслинкинга склеры с рибофлавином/УФА наблюдалось статистически достоверное увеличение прочностных характеристик склеральной ткани (предел прочности увеличился на 71%, модуль Юнга – на 64%) (рисунок 24). В группах сравнения (только насыщение склеры фотосенсибилизатором или только ультрафиолетовое облучение) статистически значимых изменений прочности склеры выявлено не было.
Через 1 сутки после процедуры кросслинкинга у кроликов наблюдались умеренный блефароспазм и инъекция конъюнктивы оперированного глаза. Нарушения прозрачности оптических сред не выявлялось. Воспалительные явления постепенно стихали и полностью исчезали через 2-3 дня после операции.
При энуклеации оперированных глаз отмечалось свободное отделение конъюнктивы и теноновой оболочки от поверхности склеры, не было выявлено выраженного фиброзного процесса.
При световой микроскопии гистологических препаратов в оболочках глазного яблока и зрительном нерве пролеченных глаз не было выявлено патологических изменений ни в один из сроков наблюдения (рисунки 25-28).