Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1 Энофтальм: этиология и патогенез, критерии и способы диагностики 15
1.2 Жировое тело глазницы: топография, эмбриогенез, морфология, функции 19
1.3 Восполнение объема глазницы как метод коррекции энофтальма 28
1.3.1 Обзор материалов, предложенных для восполнения объема глазницы 28
1.3.2 Аутотрансплантация жировой ткани для коррекции энофтальма 30
1.3.3 Способы повышения эффективности аутотрансплантации жировой ткани 33
1.3.4 Обогащение жирового трансплантата МСК из жировой ткани 35
1.3.5 Использование МСК жирового тела глазницы при коррекции энофтальма 36
1.4 Экспериментальные модели в изучении жировой ткани и моделировании ее трансплантации 37
Глава 2. Материалы и методы 42
2.1 Получение и хранение образцов жирового тела глазницы и подкожной жировой ткани 43
2.2 Оценка безопасности интраоперационной резекции жирового тела глазницы 45
2.2.1 Общеофтальмологическое обследование пациентов 45
2.2.2 Метод компьютерной экзофтальмометрии 46
2.2.3 Оценка объективности и повторяемости результатов компьютерной экзофтальмометрии 47
2.3 Морфологическое исследование жировой ткани различной локализации 49
2.4 Биохимическое исследование жировой ткани различной локализации 50
2.5 Выделение и изучение МСК из жирового тела глазницы 51
2.5.1 Определение оптимального материала и условий для выделения МСК из жирового тела глазницы 51
2.5.1.1 Измерение объема фрагмента жировой ткани 51
2.5.1.2 Методика выделения МСК из жирового тела глазницы 52
2.5.2 Определение фенотипа клеток, выделенных из жирового тела глазницы 54
2.5.3 Изучение секреторной способности МСК жирового тела глазницы 55
2.6 Моделирование сотрансплантации МСК жирового тела глазницы с фрагментами подкожной жировой ткани в органотипической культуре 56
2.7 Статистический анализ результатов исследования 58
Глава 3. Результаты экспериментально-клинических исследований 60
3.1 Интраоперационная резекция жирового тела глазницы: безопасность, допустимый объем, разработанный метод экзофтальмометрии 60
3.1.1 Безопасность резекции жирового тела глазницы 60
3.1.2 Объективность и повторяемость результатов разработанного метода компьютерной экзофтальмометрии 62
3.2 Морфо-функциональные особенности жирового тела глазницы 66
3.2.1 Морфологические особенности жирового тела глазницы в сравнении с жировой тканью туловища 66
3.2.2 Биохимический состав жирового тела глазницы и подкожной жировой ткани 70
3.3 Особенности выделения и культивирования МСК жирового тела глазницы 72
3.3.1 Разработанная методика выделения МСК жирового тела глазницы и характеристика полученных клеток 72
3.3.2 Секреторная активность МСК жирового тела глазницы 76
3.4 Результаты моделирования сотрансплантации МСК жирового тела глазницы с фрагментами подкожной жировой ткани in vitro 78
3.4.1 Влияние предтрансплантационной подготовки на МСК жирового тела глазницы 78
3.4.2 Результаты сокультивирования МСК жирового тела глазницы и фрагментов липоаспирата подкожной жировой ткани 79
Заключение 88
Выводы 99
Практические рекомендации 101
Список сокращений 103
Библиография 104
- Жировое тело глазницы: топография, эмбриогенез, морфология, функции
- Объективность и повторяемость результатов разработанного метода компьютерной экзофтальмометрии
- Разработанная методика выделения МСК жирового тела глазницы и характеристика полученных клеток
- Результаты сокультивирования МСК жирового тела глазницы и фрагментов липоаспирата подкожной жировой ткани
Введение к работе
Актуальность темы
Под истинным энофтальмом понимают смещение нормального по размерам глазного яблока в задние отделы глазницы (Cline R.A. et al., 1984). Диплопия, ограничение поля зрения и подвижности глазного яблока, изменение положения век, косметический дефект, — всё это характерные проявления энофтальма, представляющие собой серьезную медицинскую проблему и приводящие к социально-психологической дезадаптации зрячих пациентов (Самыкин А.С., 2014). Именно этим обусловлена важность своевременной диагностики и коррекции энофтальма.
Измерение положения передних границ глазных яблок в России и
мире выполняют преимущественно с помощью экзофтальмометра Гертеля.
Данный инструмент характеризуется высокой субъективностью
получаемых результатов и невозможностью применения у пациентов с асимметрией костей лицевого черепа (Бронштейн Д.А., 2010; Tengroth B. et al., 1964; Musch D.C. et al., 1985; Athanasinov P.A. et al., 2008; Clauser L. et al., 2008). Предпринимались попытки разработать новые способы экзофтальмометрии (Груша Я.О. и др., 2014; Naugle T.C., 1992; Tengroth B., 1964), которые, однако, не нашли широкого клинического применения. Т. о., актуальность разработки объективного и доступного способа экзофтальмометрии остается высокой.
Независимо от этиологического фактора, непосредственной
причиной энофтальма является дефицит объема ретробульбарной части
жирового тела глазницы (ЖТГ). В связи с этим одним из важных этапов на
пути к восстановлению нормального положения глазного яблока является
объемно-контурная пластика глазницы. Применяемая с этой целью
аутотрансплантация подкожной жировой ткани (ПЖТ) в глазницу является
наиболее перспективным методом с патогенетической, физиологической и
экономической точки зрения, по сравнению с альтернативными
методиками (Шептулин В.А., 2016; Beeson W. et al., 2010). Однако
частичная резорбция и некроз трансплантированной ткани в
послеоперационном периоде обусловливают необходимость разработки
способов повышения жизнеспособности трансплантата. По аналогии с
технологией дополнительного обогащения жирового трансплантата
мультипотентными стромальными клетками (МСК), хорошо
зарекомендовавшей себя в пластической хирургии, в офтальмологии
ведется изучение и разработка методов использования МСК, выделенных
из ЖТГ (Korn B.S. et al., 2009; Ho J.H. et al., 2011; Chien M.H. et al., 2012;
Lee J.Y. et al., 2013; Wester S.T., 2014). Предпочтительность
трансплантации именно этих клеток обусловлена известными нишевыми особенностями МСК из различных жировых депо (Tchkonia T. et al., 2002; Abreu S.C. et al., 2017) и единым эмбриональным происхождением ЖТГ с тканями глазного яблока (Johnston M.C. et al., 1979).
Несмотря на то, что использование МСК ЖТГ еще не внедрено в клиническую практику, успешные эксперименты на животных (Lee J.Y. et al., 2013) и первый положительный клинический опыт обогащения жирового трансплантата МСК в пластической хирургии позволяют предполагать хорошие результаты.
Цель исследования: обоснование возможности трансплантации мультипотентных стромальных клеток жирового тела глазницы для коррекции энофтальма.
Задачи исследования:
-
Определить допустимый объем резекции фрагментов жирового тела глазницы, безопасный для пациентов.
-
Разработать объективный метод экзофтальмометрии, применимый у пациентов с различным состоянием глазничной области.
-
Провести морфологический и биохимический анализ различных фракций жирового тела глазницы в сравнении с подкожной жировой тканью туловища человека.
-
Провести сравнительный анализ условий выделения и жизнеспособности мультипотентных стромальных клеток из кадаверных и интраоперационно резецированных фрагментов жирового тела глазницы.
-
Изучить в эксперименте in vitro секрецию мультипотентными стромальными клетками жирового тела глазницы человека цитокинов, влияющих на жизнеспособность трансплантата.
-
Оценить влияние прекультивированных мультипотентных стромальных клеток жирового тела глазницы человека на клетки фрагментов подкожной жировой ткани при сотрансплантации в условиях органотипической культуры in vitro.
Научная новизна
-
Впервые установлено, что резекция жирового тела глазницы в суммарном объеме до 0,5 мл из одной глазницы или до 0,3 мл из одного жирового пространства не сопровождается негативными анатомо-функциональными последствиями для органа зрения и является безопасной.
-
Впервые установлена возможность проведения экзофтальмометрии относительно вершин шиловидных отростков височных костей, визуализируемых на томографических снимках. Расположение этих отростков в мозговом отделе черепа, меньшая их подверженность патологическим изменениям, а также использование компьютеризированных методов получения и обработки изображения, обеспечивают объективность, высокую повторяемость результатов компьютерной экзофтальмометрии и возможность применения этого метода у пациентов с различным состоянием глазничной области.
-
Впервые установлено, что интраоперационно резецированные фрагменты жирового тела глазницы при хранении в условиях гипотермии до пяти часов являются предпочтительным материалом для выделения мультипотентных стромальных клеток, по сравнению с кадаверным жировым телом глазницы; при использовании модифицированной методики выделения возможно стабильное получение до 1 млн. клеток из 0,2 мл ткани за семь дней культивирования.
-
Впервые установлено, что мультипотентные стромальные клетки жирового тела глазницы, прекультивированные in vitro в течение пяти суток, секретируют VEGF A и TGF-2 и способны к адипогенной дифференцировке, что свидетельствует о потенциальном положительном влиянии этих клеток на состояние жирового трансплантата в условиях сотрансплантации.
-
В эксперименте in vitro установлено, что при сотрансплантации прекультивированных мультипотентных стромальных клеток жирового тела глазницы и фрагментов липоаспирата подкожной жировой ткани отсутствуют признаки негативного влияния клеток различного происхождения друг на друга: мультипотентные стромальные клетки жирового тела глазницы и фибробластоподобные клетки подкожной жировой ткани сохраняют свою жизнеспособность, высокую пролиферативную и секреторную активность.
Практическая значимость работы
Предложенные методы компьютерной экзофтальмометрии и пошаговой компьютерной экзофтальмометрии позволяют получать точные и повторяемые результаты (а: 0,00-0,29 мм, стандартная ошибка среднего: 0,00-0,17 мм) и могут быть рекомендованы для оценки безопасности резекции ЖТГ, предоперационной диагностики и посттрансплантационной оценки результата, а также для определения характера энофтальма.
Фрагменты ЖТГ, пригодные для выделения МСК с целью последующей сотрансплантации с липоаспиратом ПЖТ, могут быть получены в ходе операций по эстетической и реконструктивной блефаропластике, устранению птоза верхнего века методом резекции мышцы-леватора, удалению глазного яблока в объеме до 0,5 мл из одной глазницы или до 0,3 мл из одного жирового пространства без развития негативных анатомо-функциональных последствий для органа зрения.
Разработанный метод измерения объема фрагмента жировой ткани с помощью медицинского шприца позволяет быстро и с сохранением стерильности определить объем резецированного фрагмента, что обеспечивает стандартизацию результатов липофиллинга и экспериментальных исследований.
Предложенная модифицированная методика выделения МСК из малого объема ЖТГ за счет использования всей тканевой массы позволяет получать до 1 млн. клеток из 0,2 мл ткани жирового тела глазницы за 5-7 дней культивирования.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Интраоперационная резекция ЖТГ в суммарном объеме до 0,5 мл из одной глазницы или до 0,3 мл из одного жирового пространства не вызывает негативных анатомо-функциональных и эстетических последствий для пациентов и может быть использована для получения образцов ЖТГ в научно-исследовательских целях, а также для выделения МСК с целью дальнейшей сотрансплантации при липофиллинге глазницы.
-
Выделение МСК возможно из малого объема интраоперационно резецированного ЖТГ при хранении образцов в условиях гипотермии до пяти часов с момента резекции. На протяжении пяти суток прекультивирования in vitro МСК ЖТГ способны к адипогенной дифференцировке и секреции VEGF A и TGF-.
3. В модели сотрансплантации с фрагментами липоаспирата
подкожной жировой ткани МСК ЖТГ сохраняют свою жизнеспособность, высокую пролиферативную и секреторную активность и не оказывают негативного влияния на клетки липоаспирата подкожной жировой ткани.
Внедрение результатов работы в практику
Разработанные методы внедрены в практику офтальмологического
отделения ГБУЗ «Детская городская поликлиника №110» Департамента
здравоохранения г. Москвы, отделения реконструктивно-
восстановительной и пластической хирургии и Центра фундаментальных и
прикладных медико-биологических проблем ФГАУ «МНТК
«Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России.
Апробация результатов исследования
Результаты исследования доложены и обсуждены на
X Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные
проблемы офтальмологии» (г. Москва, 2015); Всероссийской научной
конференции студентов и молодых специалистов «Актуальные вопросы
современной медицины: взгляд молодого специалиста» (г. Рязань, 2015);
Международной конференции «Сell technologies at the edge: research and
practice (CTERP)» (г. Санкт-Петербург, 2016); IV Междисциплинарном
конгрессе по заболеваниям головы и шеи (г. Москва, 2016);
XI Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные
проблемы офтальмологии» (г. Москва, 2016); Всероссийской научно-
практической конференции с международным участием «Федоровские
чтения» (г. Москва, 2016, 2017); Конгрессе Европейской ассоциации по
исследованию зрения и глаза (EVER; г. Ницца, Франция, 2016); 36-м
Ежегодном собрании Европейского общества пластических и
реконструктивных офтальмохирургов (ESOPRS; г. Стокгольм, Швеция,
2017).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 17 научных работ, в том числе шесть статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ. Получено четыре патента РФ на изобретения.
Объем и структура диссертации
Жировое тело глазницы: топография, эмбриогенез, морфология, функции
Жировое тело глазницы заполняет всё пространство между стенками глазницы, глазным яблоком, фасциями, нервными стволами, сосудами и слезной железой [11, 18]. Выделяют центральную часть ЖТГ, расположенную позади тарзоорбитальной фасции экстра- и интраконально (рисунок 2), и периферическую часть (рисунок 3). Периферическая часть ЖТГ неоднородна по строению и разделена на отдельные фракции [4, 16, 56], которые заполняют хирургические жировые пространства. На верхних веках это — верхнее среднее (жировое пространство Эслера) и верхнее внутреннее (между сухожилием верхней косой мышцы и медиальной связкой) пространства, разделенные верхней косой мышцей, и верхнее наружное пространство, окружающее слезную железу (рисунок 3) [4, 16].
И в отечественной, и зарубежной литературе ЖТГ, находящееся в верхнем наружном и верхнем среднем жировых пространствах также называют центральным или преапоневротическим («central (preaponeurotic)») жиром, а в связи с их внешним сходством и насыщенным желтым цветом — «желтым» жиром, тогда как ЖТГ в верхнем внутреннем отделе глазницы, имеющее более светлую окраску, называют медиальным или «белым» жиром [124]. В области нижних век ЖТГ заполняет внутреннее (между медиальной связкой глаза и началом нижней косой мышцы), среднее (между нижней косой мышцей глаза и дном глазницы) и нижнее наружное (между наружной щечной связкой и фасциальной растяжкой нижней прямой мышцы, идущей к наружной связке век) пространства (рисунок 3) [4, 16].
Такая фрагментарность строения в определенной степени может быть обусловлена особенностями эмбриогенеза ЖТГ. Известно, что образование будущего жирового компонента глазницы начинается только на 4-м месяце внутриутробного развития, т. е. намного позднее закладки глаз у человека, начинающейся уже на 3-й неделе [45]. Также установлено, что на верхних веках медиальная жировая подушка, окрашенная более светло [16, 27, 182], вместе с интракональной частью ЖТГ, наряду с другими соединительнотканными образованиями глазницы, формируются из клеток нервного гребня [115, 142]. В свою очередь, преапоневротическая часть ЖТГ, подобно белой жировой ткани туловища, имеет мезодермальное происхождение [48].
С различиями в эмбриогенезе могут быть связаны и следующие клинико-анатомические особенности. Анализ возрастных изменений верхней внутренней и центральной части ЖТГ, проведенный S.R. Oh (2011), показал, что ЖТГ из верхнего внутреннего жирового пространства с возрастом формирует грыжеподобные выпячивания на фоне атрофии центральной части ЖТГ [158]. Кроме того, отмечено, что у пожилых пациентов медиальный жир может быть относительно избыточным, тогда как у более молодых его меньше [138].
Большинство исследователей относят ЖТГ к белой жировой ткани [96, 186], однако существуют данные о наличии у нее некоторых характеристик бурой жировой ткани [204]. Как любая жировая ткань туловища, ЖТГ гистологически представлено жировыми дольками и прослойками соединительной ткани между ними, содержит МСК и прогениторные клетки, фибробласты, эндотелиальные и иммунные клетки [49, 60, 199]. Выделяют два морфофункциональных топографических варианта ЖТГ [56]. По результатам гистологического исследования D. Bremond-Gignac и H. Copin (2004), первый тип ЖТГ представлен тканью с толстыми соединительнотканными перегородками и мелкими адипоцитами. Такая жировая ткань располагается в области экстраокулярных мышц и слезной железы и играет роль поддерживающей ткани, обеспечивающей возможность движения глазного яблока. В отличие от первого, второй тип ткани ЖТГ образован крупными адипоцитами и тонкими перегородками между ними и локализуется преимущественно в задних отделах глазницы. Там он окружает зрительный нерв и позволяет ему совершать движения в глазнице [56].
Неоднократно отмечалось, что по своей структуре ЖТГ отличается от жировой ткани других локализаций. Результаты сравнительного морфометрического анализа ЖТГ, буккальной жировой ткани и ПЖТ, выполненного V. Ilankovan с коллегами (1995), показали, что по таким параметрам, как относительные объемы коллагена, содержание эндотелиальных клеток и количественная плотность тучных клеток, ткань ЖТГ сходна с буккальным жиром и значительно отличается от ПЖТ [112]. В другом исследовании были найдены отличия ЖТГ от ПЖТ и сальника по размерам адипоцитов: авторы отмечали, что в целом адипоциты в ЖТГ мельче и менее дифференцированы [160]. Ранее в соавторстве с И.Д. Беспаловой (2014) соискателем было проведено предварительное морфометрическое исследование сальника, в результате которого определили объемную плотность (ОП) кровеносных сосудов, соединительнотканных элементов и адипоцитов, а также средний диаметр адипоцитов [6]. Учитывая наличие определенных гистологических различий между ЖТГ и жировой тканью других локализаций, выявленных зарубежными авторами, в рамках настоящего исследования представляется важным сравнить значения упомянутых морфометрических параметров жировой ткани большого сальника с ЖТГ и ПЖТ.
Не остался без внимания исследователей и биохимический состав ЖТГ. По результатам, представленным в работе B.S. Sires с соавторами (1998), ЖТГ содержит пальмитиновую (22,0–24,6 %), олеиновую (45,0–51,5 %) и линоленовую (15,0–18,6 %) кислоты. При этом достоверных отличий в содержании жирных кислот и протеинов между различными жировыми фракциями глазницы не обнаружено [182]. В то же время установлено, что центральный жир содержит больше -каротина и лютеина, чем медиальный, что объясняет разную интенсивность окраски различных фракций ЖТГ. Несмотря на выявленные морфологические и биохимические особенности ЖТГ, остается широко распространенным традиционное представление об этой разновидности жировой ткани как об «амортизационной подушке» для глазного яблока и окружающих его мышц, сосудов и нервов [196, 202]. Тем не менее, установленные в настоящее время взаимосвязи между характеристиками ЖТГ и определенными патологическими состояниями органа зрения позволяют предположить наличие у этой ткани дополнительных функций. Первые предположения о выполнении ЖТГ, в частности его ретробульбарной частью (ретробульбарная клетчатка, РБК), дополнительных функций были высказаны Г.А. Шилкиным с соавторами в конце XX века [44, 45]. Гистологическое изучение зачатков глаз эмбрионов и плодов человека на сроках гестации от трех до 40 недель и микроскопия ЖТГ у пациентов с различной офтальмопатологией позволили выявить следующие закономерности. При миопии в РБК определяются пустоты и тяжи, а на клеточном уровне — снижение числа тучных и эпителиоидных клеток [44]. Для осевой гиперметропии характерно повышенное количество в РБК фибробластов, при одновременном отсутствии тучных клеток. В отличие от нормальной ткани ЖТГ, окружающей глазное яблоко с эмметропической рефракцией, в обоих случаях обнаружено уменьшение количества адипоцитов [45]. Кроме этого, при осевой гиперметропии, а также при наличии глаукомы, наследственных и приобретенных дистрофиях сетчатки отмечалось снижение количества сосудов. Бессосудистые уплотнения РБК также были выявлены у пациентов с микрофтальмом, колобомами хориоидеи, пигментной дегенерацией в сочетании с энофтальмом различной этиологии. Выявленные особенности РБК при различной офтальмопатологии позволили авторам сделать предположение о влиянии РБК на рефрактогенез и трофическую систему глаза. По мнению Г.А. Шилкина с соавторами (1990), РБК регулирует рост и развитие глазного яблока за счет контакта с камбиальной зоной склеры и своего тургора, участвует в формировании объема и конфигурации глазницы. Предположительно, РБК является поставщиком липидов фоторецепторных мембран, поэтому врожденные и возрастные изменения липидного состава могут быть причиной дистрофий сетчатки. Учитывая выделение тучными клетками биологически активных веществ (гистамин, серотонин, гепарин) и ряда ферментов (пептидаза, фосфатаза), возможную секрецию гормонов эпителиоидными клетками, важную роль ненасыщенных жирных кислот как конструктивного компонента нейроэпителия, можно предположить активное участие РБК в анатомо-функциональном развитии глаза [45].
Позднее в работе R. Gola et al. (1995) было отмечено, что ЖТГ играет важную роль в физиологии глаза и обеспечении его подвижности [99]. По данным O. Stojanov с коллегами (2013), существует положительная корреляция между объемом РБК и внутриглазным давлением [186]. В результате проведенного ими исследования было показано, что у тучных людей объем РБК увеличен и сопровождается достоверно более высокими значениями внутриглазного давления, чем у людей с нормальной массой тела. Помимо упомянутых, имеются и другие данные в пользу более значительной роли ЖТГ. Например, предполагается наличие взаимосвязи между локальным изменением метаболизма в тканях глазницы и развитием приобретенного птоза [48]. Основанием для этого служат результаты спектрофотометрического анализа у пациентов с приобретенным прогрессирующим птозом, демонстрирующие тенденцию к меньшему содержанию у них каротиноидов в преапоневротической части ЖТГ. Доказано, что благодаря наличию в своем составе иммунных клеток, ЖТГ активно участвует и в воспалительных заболеваниях глазницы. Не вызывает сомнения участие фибробластов ЖТГ в развитии иммуномедиаторного воспаления, лежащего в основе патогенеза эндокринной офтальмопатии у пациентов с болезнью Грейвса [31, 48, 120, 134, 183, 185].
Объективность и повторяемость результатов разработанного метода компьютерной экзофтальмометрии
Так как для определения влияния резекции ЖТГ на выстояние передних границ глазных яблок был применен разработанный метод компьютерной экзофтальмометрии, провели ретроспективный анализ, результаты которого представлены в данном подразделе.
Сравнение результатов, полученных с помощью компьютерной экзофтальмометрии и традиционной экзофтальмометрии по Гертелю у одних и тех же пациентов, выявил сильную положительную корреляцию между ними (рисунок 6).
Так как в амбулаторных картах у таких пациентов не было зафиксировано никаких признаков энофтальма и соответствующих жалоб, асимметрия выстояния глазных яблок менее 1,0 мм была расценена как вариант нормы. При этом сравнение величины стандартного отклонения между 1-й и 2-й группами при использовании метода компьютерной экзофтальмометрии не выявило статистически значимых различий (рисунок 7). Пунктирной линией отмечен возможный уровень вариации между повторными измерениями с помощью экзофтальмометра Гертеля, по данным P.A. Athanasiov et al. (2008), Д.А. Бронштейна (2010)
Таким образом, был разработан метод компьютерной экзофтальмометрии, основанный на измерении выстояния глазных яблок относительно прямой, соединяющей вершины шиловидных отростков височных костей (см. раздел 2.2.2). Использование указанных анатомических образований, а также компьютеризированных методов получения и анализа изображения, обусловливает объективность и достоверность результатов, получаемых у пациентов с различным состоянием глазничной области. Дополнительно проведенное ретроспективное исследование позволило установить высокую повторяемость результатов измерений, сделанных одним исследователем по методу компьютерной экзофтальмометрии, а также сильную положительную корреляцию с результатами экзофтальмометрии по Гертелю. Также определены границы допустимой асимметрии выстояния глазных яблок: при отсутствии соответствующих функциональных нарушений и жалоб асимметрию до 1,0 мм, определяемую методом компьютерной экзофтальмометрии, можно считать незначимой.
Разработанная методика выделения МСК жирового тела глазницы и характеристика полученных клеток
С использованием стандартной методики выделения МСК из жировой ткани первичную культуру жизнеспособных фибробластоподобных колониеобразующих клеток, адгезивных к культуральному пластику, из ЖТГ удалось выделить только в одном случае из 11 образцов кадаверного ЖТГ (рисунок 13).
Такой результат свидетельствовал о низкой жизнеспособности МСК и не позволил использовать фрагменты кадаверного ЖТГ в качестве стабильного источника для экспериментально-клинических исследований, что определило необходимость использования интраоперационно резецированных фрагментов ЖТГ для выделения МСК.
На этапе отработки методики выделения МСК из 11 образцов ЖТГ, резецированных интраоперационно, при условии хранения образцов в физиологическом растворе с антибиотиками при температуре 4 С до пяти часов с момента резекции, были получены жизнеспособные фибробластоподобные колониеобразующие клетки, адгезивные к пластику во всех 11 случаях (таблица 4). В то же время из двух образцов интраоперационно резецированного ЖТГ, хранившихся при тех же температурных условиях, но более длительно (24 часа), необходимую клеточную культуру выделить не удалось (таблица 4). Модифицированная методика выделения МСК (см. раздел 2.5.1.3) позволила получать из 0,2 мл ЖТГ от 0,4х106 до 1,0х106 клеток через 7–10 дней культивирования, в отличие от стандартной методики, обеспечивавшей получение не более 0,4х105 клеток за аналогичный период времени. Получение дополнительного количества фибробластоподобных колониеобразующих клеток происходило за счет активной миграции этих клеток из фрагментов тканевого дебриса (рисунок 14), помещенных в культуральный флакон наряду с осадком стромально-клеточной фракции. Клетки, выделенные с использованием модифицированной методики, характеризовались специфичной фибробластоподобной формой (рисунок 14, 15 а), адгезией к культуральному пластику и спонтанной дифференцировкой в адипоциты (рисунок 15 б, в).
Иммунофенотипирование методом проточной цитофлуориметрии показало, что полученная культура клеток была представлена клетками CD9+/CD10+/CD13+/CD19-/CD29+/CD34±/CD44+/CD73+/CD90±/CD105+/CD117-/ CD166+ (рисунок 16). Совокупность культуральных и иммунофенотипических характеристик позволила идентифицировать получаемые с помощью модифицированной методики клетки как МСК.
Таким образом, проведенный сравнительный анализ условий выделения и жизнеспособности МСК показал, что интраоперационно резецированные фрагменты ЖТГ при хранении в условиях гипотермии не более пяти часов являются предпочтительным источником для выделения МСК, по сравнению с образцами кадаверного ЖТГ. Использование модифицированной методики выделения клеток позволяет даже из малого (0,2 мл) объема ЖТГ получать до 1,0х106 клеток через 7–10 дней культивирования. При этом выделяемая культура клеток соответствовала основным критериям отнесения к МСК и использовалась в дальнейших экспериментах in vitro.
Результаты сокультивирования МСК жирового тела глазницы и фрагментов липоаспирата подкожной жировой ткани
В ходе проведения эксперимента с использованием органотипического культивирования жировой ткани выявлено следующее. За время культивирования в образцах ПЖТ, обогащенной прекультивированными МСК, отмечалось увеличение количества веретеновидных клеток (рисунок 18, 19, 20), в том числе за счет пролиферации дополнительно введенных МСК, что подтверждает конфокальная микроскопия (рисунок 19). На рисунке 19 наглядно видно, что уже ко вторым суткам эксперимента произошло увеличение количества светящихся клеток. При этом клетки отличаются от исходных МСК меньшими размерами (рисунок 19 а, в).
Наряду с пролиферацией введенных клеток с 4-х суток наблюдались выход и пролиферация веретеновидных клеток на периферии фрагментов жировой ткани (рисунок 18). Это подтверждают фотографии контрольной лунки (рисунок 21), где дополнительное введение МСК не имело места по условиям эксперимента (см. раздел 2.6).
Активное увеличение количества МСК в опытной лунке способствовало тому, что с 7-го дня культивирования коллагеновый матрикс был плотно заполнен клеточной массой (рисунок 20, 21, 22), что сопровождалось постепенным сокращением его объема.
В условиях сокультивирования МСК ЖТГ и фрагментов ПЖТ отсутствовали признаки негативного влияния материала различного происхождения друг на друга. МСК из ЖТГ активно пролиферировали и окружали фрагменты ПЖТ (рисунок 23). За время культивирования наблюдалось распространение веретеновидных клеток за пределы коллагенового геля, их адгезия и пролиферация на дне лунки планшета (рисунок 22).
Для анализа выраженности апоптоза в опытных и контрольных образцах провели иммуногистохимическое исследование с использованием антител к каспазе-3 и 7. Данные каспазы относятся к эффекторным — они ингибируют синтез белков, активируют ДНКазу и расщепляют актиновые филаменты. Сравнение выраженности флуоресценции антител к маркерам апоптоза между образцами контрольной и опытной групп на всех сроках эксперимента не выявило статистически значимых различий (рисунок 24). При этом в обеих лунках выраженность флуоресценции антител к каспазе-3 статистически значимо увеличивалась с 1-х по 7-е сутки органотипического культивирования (р 0,05), что наглядно демонстрирует линия тренда на рисунке 24.
Также иммуногистохимически в образцах из опытной и контрольной лунок определяли такие маркеры, как ki-67 и эндоглин (CD105). Ядерный белок ki-67 является специфичным маркером пролиферации и определяется в активной фазе клеточного цикла (G1, S, G2, M). В проведенном эксперименте на протяжении всего периода органотипического культивирования отмечалась тенденция к росту выраженности флуоресценции антител к данному белку как в опытной, так и в контрольной лунках (рисунок 25).
При этом в опытной лунке с добавлением МСК из ЖТГ показатель клеточной пролиферации уже на 1-е сутки был статистически значимо выше, чем в контрольной группе, и сохранялся таким вплоть до 7-х суток органотипического культивирования (рисунок 25).
В свою очередь эндоглин (CD105) является мембранным белком и стабильно экспрессируется в МСК из жировой ткани, в том числе в культуре МСК из ЖТГ, используемой в данном исследовании (рисунок 16, раздел 3.3.1), и поэтому был использован как маркер стромальных клеток. На 1-е сутки органотипического культивирования фрагментов ПЖТ выраженность флуоресценции антител к данному маркеру была статистически значимо выше в образце из опытной лунки (с добавлением МСК), по сравнению с контролем (рисунок 25). С 4-х суток достоверных различий по выраженности флуоресценции антител к CD105 между анализируемыми лунками выявлено не было. К 7-м суткам органотипического культивирования наблюдалась тенденция к росту данного показателя в контрольной лунке.
Таким образом, на последнем этапе исследования показано, что механические воздействия, связанные с предтрансплантационной подготовкой и инъекционным введением, не оказывали негативного влияния на прекультивированные МСК из ЖТГ. Результаты эксперимента по сокультивированию МСК ЖТГ и фрагментов ПЖТ в условиях органотипической культуры позволили сделать заключение о том, что МСК ЖТГ сохраняли свою жизнеспособность и не оказывали негативного влияния на клетки фрагментов ПЖТ. Более того, в лунке с добавлением МСК ЖТГ клетки характеризовались более высокой пролиферативной активностью. В свою очередь это является потенциальным источником обновления клеток жирового трансплантата и поддержания его стабильного объема в отдаленном послеоперационном периоде.