Изучение роли матриксных металлопротеиназы-2, металлопротеиназы-9 и полиморфизма гена фактора комплемента н в прогнозе первичной открытоугольной глаукомы Леванова Ольга Николаевна

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 9

1.1. Современные представления о патогенетических механизмах развития первичной 9 открытоугольной глаукомы

1.2. Семейство матриксных металлопротеиназ

1.2.1. Роль матриксных металлопротеиназ в патогенезе первичной открытоугольной 12 глаукомы

1.2.2. Значение матриксных металлопротеиназ в фильтрационной хирургии глаукомы 17

1.3. Система комплемента: активация и регуляция. Роль в норме и при открытоугольной 19

глаукоме

ГЛАВА 2.Материал и методы исследования

2.1. Дизайн исследования 25

2.2. Офтальмологические методы исследования 26

2.3. Биохимический анализ слезной жидкости 27

2.4. Генетические методы исследования 29

2.5. Статистическая обработка результатов исследования 30

ГЛАВА 3. Характеристика клинического и генетического материала

3.1. Клиническая характеристика материала 32

3.2.Генетическая характеристика материала 38

3.2.1. Изучение полиморфизма гена CFH (T402H) у больных первичной открытоугольной глаукомы и у группы контроля

ГЛАВА 4. Изучение диагностической и прогностической значимости матриксных протеаз при первичной открытоугольной глаукоме

4.1.Изучение продукции ММП-2 в норме и при первичной открытоугольной глаукоме 61

4.2. Изучение продукции ММП-9 в норме и при первичной открытоугольной глаукоме 81

4.3. Изучение корреляционной связи между продукцией матриксных металлопротеиназ 93

с полиморфизмом гена СFH при первичной открытоугольной глаукоме

Заключение 95

Выводы 108

Практические рекомендации 110

Список литературы

• Роль матриксных металлопротеиназ в патогенезе первичной открытоугольной 12 глаукомы
• Офтальмологические методы исследования
• Изучение полиморфизма гена CFH (T402H) у больных первичной открытоугольной глаукомы и у группы контроля
• Изучение продукции ММП-9 в норме и при первичной открытоугольной глаукоме

Введение к работе

Актуальность и степень разработанности темы

Глаукома – тяжелое нейродегенеративное заболевание, приводящее к необратимой
слепоте. Доля первичной открытоугольной глаукомы (ПОУГ) составляет 90% всех ее форм,
половина из них остаются недиагностированными (Волков В.В., 2008). Cегодня в мире
насчитывается более 70 млн. человек, теряющих зрение от глаукомы. Известно, что
замедлить течение ПОУГ можно на ранней стадии. Однако каждый второй пациент узнает о
своем заболевании на поздней стадии, когда все лечебные мероприятия оказываются
безуспешными (Либман Е.С. с соавт., 1998). Инновационные диагностические технологии
расширили наши возможности выявления морфометрических признаков ремоделирования
сетчатки и диска зрительного нерва (ДЗН), но их нельзя назвать ранними. Они выявляются
на «продвинутых стадиях патологического процесса» (Азнабаев Б.М. с соавт., 2008). Это
объясняет смещение ракурса поиска перспективных диагностических технологий в сторону
лабораторной диагностики: молекулярно-генетической (Тикунова Е.В., 2014),

иммунологической и др. (Рукина Д.А. с соавт., 2011). В активной разработке находится поиск биомаркеров ПОУГ, позволяющих прогнозировать вероятность развития заболевания и характер его индивидуального течения (Graham K.L. et al., 2017). Так, публикации последних лет посвящены изучению роли матриксных металлопротеиназ (ММП) в патогенезе ПОУГ (Markiewicz L. et al., 2015; Groef L. De et al., 2015). Их участие изучалось в повреждении трабекулы (Xu S.L. et al., 2009), индукции апоптоза (Chintala S.K., Zhang X., 2002; Gu Z. et al., 2005) и нейродегенеративных процессов в зрительном анализаторе (Yan X. et al., 2000), ремоделировании решетчатой пластины склеры и области ДЗН (Morgan W.H. et al., 1995).

ММП участвуют в преобразовании экстраклеточного матрикса (ЭКМ) (Nagase H., Woessner J.F., 1999). ММП изучают морфологически, анализируя их экспрессию в трабекулярной сети (Guo M.S. et al., 2012; Groef L. De et al., 2013), в шлеммове канале (Ronkoo S. et al., 2007), в сетчатке (Groef L. De et al., 2014), решетчатой пластине склеры (Xu S.L. et al., 2009). Концентрацию ММП определяют во внутриглазной жидкости (Schltzer-Schrehardt U. et al., 2003; Kara S. et al., 2014), в сыворотке крови, слезной жидкости (Рукина Д.А., Кириенко А.В., 2011). Предполагают наличие причинно-следственной связи между уровнем продукции ММП и реакциями ремоделирования ДЗН и сетчатки (He S. et al., 2007). В этом аспекте, особую актуальность обретает анализ полиморфизма генома человека, отвечающего за нарушения механизмов регуляции иммуномолекулярного гомеостаза.

Иммунная система предназначена для надзора за постоянством иммуно-молекулярного и генетического гомеостаза. Сбой в ее регуляции способствует превращению

защитных механизмов в орудие повреждения (Фаворова О.О., 2006). Так, иммунной агрессии подвергаются нейроны сетчатки: ганглиозные клетки (ГКС), их синапсы и аксоны (Wax M.B. et al., 2008). Депозиты белков системы комплемента в сетчатке глаз с терминальной глаукомой подтверждают участие иммунной системы в патогенезе ПОУГ (Kuehn M.H. et al., 2006). Система комплемента является неотъемлемой частью врожденного иммунитета и служит для очистки от нежелательных клеток, инфекционных агентов и продуктов клеточного распада (Zipfel P.F., 2009). Она регулируется несколькими белками, ключевым регулятором признан фактор комплемента H (CFH). Мутации гена CFH ассоциируются с нарушением контроля регуляции системы комплемента, предрасположенностью к различным иммунным заболеваниям (Jozsi M., Zipfel P.F., 2008). Доказано участие комплемента в деструкции синапсов центральной нервной системы (ЦНС) (Ren L., Danias J., 2010), что делает его причастным к нейродегенеративным заболеваниям, включая глаукому (Ricklin D., 2010; Howell G.R. et al., 2011). В связи с чем, анализ состояния гена CFH, отвечающего за регуляцию системы комплемента, становится объектом пристального внимания исследователей глаукомы.

Цель исследования: изучить роль ММП-2 и ММП-9 у больных ПОУГ с различным генотипом CFH.

Основные задачи работы:

1. Изучить распространенность полиморфизма гена СFH (Т402Н) среди больных ПОУГ и уточнить его роль в прогрессировании заболевания.

2. Определить вариабельность референтных значений и средне-статистическую концентрацию ММП-2 и ММП-9 в слезной жидкости здоровых глаз (норма).

3. Изучить продукцию ММП-2 и ММП-9 в слезной жидкости глаз с различными стадиями заболевания.

4. Провести корреляционный анализ иммуномолекулярных и генетических показателей с клиническими, морфометрическими и функциональными параметрами.

5. Провести экспертную оценку прогностической значимости клинико-инструментальных, генетических и иммуномолекулярных показателей с отбором наиболее надежных и достоверных критериев, пригодных для построения модели прогноза риска развития и прогрессирования ПОУГ.

Положения, выносимые на защиту диссертации

ПОУГ ассоциируется с повышением продукции ММП-2 и ММП-9, тесно коррелирующими со зрительными дисфункциями и морфометрическими показателями сетчатки и ДЗН, что подтверждает их участие в механизмах ремоделирования.

Гидродинамические нарушения ПОУГ в виде снижения допустимого порога скорости водного обмена (продукция внутриглазной жидкости 1,2мм³/мин(%)) в тканях глаза повышает их чувствительность к патогенным механизмам, включая офтальмогипертензию и флуктуацию ВГД и влечет за собой нарушения иммуномолекулярного гомеостаза.

Агрессивность течения ПОУГ ассоциируются с мутацией генов-регуляторов защитных механизмов врожденного иммунитета (ген CFH), что подтверждается аккумуляцией больных с генотипом ТТ (70%) на 4 стадии ПОУГ.

Научная новизна

Определена и статистически обоснована нормативная база продукции ММП-2 и ММП-9 в слезной жидкости здоровых глаз (вариабельность референтных значений: 2,0-4,0 нг/мл и 60,0-110,0 нг/мл, средне-статистическая концентрация (Мср=M±SD): 2,64±0,68 нг/мл и 80,36±14,65нг/мл, соответственно).

Выявлены комплексные нарушения продукции ММП-2 и ММП-9 в слезной жидкости глаз с ПОУГ (расширение диапазона значений от 2,0 до 10,0 нг/мл и от 90,0 до 220,0 нг/мл; повышение средних концентраций до 3,59±1,41 и 136,11±26,44 нг/мл, р<0,05, соответственно); и доказана тесная связь выявленных нарушений со стадией заболевания (r₁=0,3807, р<0,01 и r₂=0,7132, р<0,001).

Изучена распространенность полиморфизма гена CFH (Т402Н) в популяции больных ПОУГ и продемонстрирована роль генотипа CFH в агрессивности течения заболевания.

На основе экспертной оценки показателей, отражающих гидродинамические нарушения (коэффициент легкости оттока С, объем секреции внутриглазной жидкости F, флуктуация ВГД), морфометрических параметров сетчатки (средней толщины в макуле) и концентрации ММП-2 и ММП-9 в слезной жидкости разработаны регрессионные уравнения, позволяющие рассчитать персонализированный риск развития и прогрессирования ПОУГ с высокой результативностью моделей (р₁=0,0001, р₂=0,0001) и объясняющей способностью (R₁-ssquare=0,86897, R₂-ssquare=0,69898).

Теоретическая значимость работы заключается в расширении информационной базы и
спектра генов, причастных к глаукоме, расшифровке последовательности этапов патогенеза
(нарушение водного гомеостаза в тканях глаза нарушение иммуномолекулярного
гомеостаза нарушение тканевого гомеостаза), что обосновывает алгоритм

инструментальной и лабораторной диагностики заболевания.

Практическая значимость работы заключается в идентификации и обосновании генетических (ген СFH) и иммуномолекулярных маркеров риска развития и ПОУГ, разработке высокоточной технологии прогнозирования (регрессионные модели) заболевания

на основе персонализированных показателей.

Методология и методы исследования

Исследование опиралось на международные и федеральные стандарты диагностики
ПОУГ (Код МКБ-10: Н-40.1). ПОУГ диагностировали методом стандартной автоматической
периметрии (САП-периметрии), оптической когерентной томографии (ОКТ).

Гидродинамические нарушения изучали методом тонографии.

Степень достоверности результатов

Достоверность результатов исследования подтверждена достаточным количеством
наблюдений (66 пациентов ПОУГ и 25 человек группы контроля), современными методами
исследования, соответствующие поставленным целям и задачам. Подготовка,

статистический анализ и интерпретация полученных результатов проведены с использованием современных методов обработки информации и статистического анализа. Прогнозирование осуществляется на основе регрессионных уравнений и многомерных пошаговых логистических моделей.

Внедрение работы

Рекомендации по обследованию, расчетам персонализированного риска развития и прогрессирования ПОУГ внедрены в практическую деятельность ГБУ РО «КБ им. Н.А. Семашко», педагогическо-образовательный процесс кафедры глазных и ЛОР-болезней ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России

Апробация и публикация материалов исследования

Материалы диссертации представлены, доложены и обсуждены на Всероссийской
научно-практической конференции «Биохимические научные чтения памяти акад. РАН Е.А.
Строева» (Рязань, 2011, Рязань 2017); VI Российском общенациональном

офтальмологическом форуме (Москва, 2013); ежегодной научно-практической конференции молодых ученых РГМУ имени академика И.П. Павлова (Рязань, 2013); межрегиональной научной конференции с международным участием РГМУ имени академика И.П. Павлова (Рязань, 2014); межрегиональной научной конференции офтальмологов «Актуальные вопросы глаукомы» (Рязань, 2015); научно-практическая конференция офтальмологов «Актуальные вопросы глаукомы» (Рязань, 2016); межкафедральном совещании РГМУ имени академика И.П. Павлова (Рязань, 2017).

Основные положения диссертации освещены в 15 научных публикациях, из них в 8 журналах, рекомендованных ВАК.

Структура диссертации

Роль матриксных металлопротеиназ в патогенезе первичной открытоугольной 12 глаукомы

Описано более 20 членов семейства MMП, которые, в зависимости от свойств и специфичности, делятся на подсемейства: интерстициальные коллагеназы (ММП 1/коллагеназа-1, ММП-8/коллагеназа-2, ММП-13/коллагеназа-3); стромелизины (ММП-3/стромелизин-1, ММП-10/стромелизин-2, ММП-11/стромелизин-3 и ММП-12/макрофагальная металлоэластаза); желатиназы (ММП-2/желатиназа-А, ММП-9/желатиназа-В); матрилизины (ММП-7, ММП-26), мембранный тип MMП (GPI-фиксируемая эластаза) и другие MMП, включая металлоэластазы (макрофагальная эластаза, ММП-12), энамелизин (MMП-20), эпилизин (MMП-28), ММП-19,-21,-23,-27. Коллагеназы расщепляют коллагены I, II и III типа; желатиназы расщепляют денатурированные коллагены (желатины) и коллагены IV, V, и VII типа, а также эластин и витронектин; тогда как стромелизины расщепляют коллаген IV типа, протеогликаны, фибронектин, ламинин, и эластин [27,49,125,192].

Продуцентами матриксных металлопротеиназ служат клетки соединительной ткани (фибробласты) [193], гемопоэтические (моноциты) [38,79], эндотелиальные [165] и раковые клетки [197], а также гепатоциты [183], макрофаги [79], лимфоциты [120], гранулоциты и тромбоциты [100].

В физиологических условиях в тканях содержится незначительное количество ММП, активность которых зависит от присутствия активаторов и ингибиторов в окружающей среде. Кроме того, активность ферментов зависит от уровня экспрессии их генов. ММП относят к «индуцируемым» ферментам, транскрипция которых регулируется и контролируется множеством молекул, включая стероидные и тиреоидные гормоны, цитокины, факторы роста, химические агенты и др. Исключение составляет ММП-2, экспрессирующаяся по конститутивному пути. Различия в регуляции транскрипции объясняются, в частности, строением промоторов ММП. Экспрессия ММП сходна с экспрессией белков острой фазы и регулируется противовоспалительными цитокинами [65,68,86,158].

Синтез ММП жестко регулируется на уровне транскрипции, секреции и протеолитической активности [35]. Активность ММП находится под контролем специфических белков - тканевых ингибиторов металлопротеиназ (ТИМП). Хорошо изучены четыре вида ТИМП, выделенных из различных тканей человека: ТИМП-1, ТИМП-2, ТИМП-3, ТИМП-4. ТИМП способны связываться как с активными, так и неактивными формами ММП. Эти белки различаются по их специфическому действию на металлопротеиназы [40,184,185]. На уровне транскрипции секрецию ингибиторов ММП (в дополнение к TИMП) регулируют трансформирующий фактор роста TGF- и стероидные гормоны [166].

Секрецию ММП стимулируют фактор некроза опухолей и фактор роста эндотелия сосудов [189,192], интерлейкин-1 [130], простагландины [147]. На посттрансляционном уровне активность ферментов регулируют зимогены или тканевые ингибиторы ММП [190]. Патологическая экспрессия ММП и их ингибиторов, нарушения в протеолитическом балансе между ММП и ТИМП ассоциируется со многими патологическими состояниями, включая воспалительные заболевания, рак, сердечно-сосудистые и нейродегенеративные заболевания [20,41,122,178]. Установлена корреляционная связь между балансом протеолитической активности ММП и активности ТИМП, с одной стороны, и состоянием ЭКМ, с другой стороны [46].

Усиление синтеза с повышением активности ММП приводит к разрушению базальной мембраны сосудисто-эндотелиального барьера и повышению сосудистой проницаемости, к воспалительным реакциям и увеличению образования коллагена в зоне воспаления [97].

Глаукома, как патологический процесс, состоит из нескольких звеньев: нарушение циркуляции ВВ с ухудшением оттока; превышение ВГД за грань толерантного для зрительного нерва; ишемия и гипоксия ДЗН, приводящие к оптической нейропатии с апоптозом ГКС.

Отток ВГЖ происходит по основному и дополнительному пути. Примерно 85-95% ВВ оттекает в эписклеральные вены по дренажной системе глаза, расположенной на передней стенке угла передней камеры. Дренажная система глаза состоит из трабекулярного аппарата (ТА), склерального синуса (шлемов канал) и коллекторных канальцев. Около 5-15% влаги уходит из глаза, просачиваясь через строму цилиарного тела и склеру в увеальные и склеральные вены, то есть, увеосклеральным путем.

Морфологические исследования обнаружили избыточное образование ЭКМ в трабекулярной сети (ТС) глаукомных глаз. По мнению экспертов это может стать причиной затрудненного оттока внутриглазной жидкости [89,149,164,168,169]. С 90-х годов в литературе появляются данные, указывающие на роль протеолитических ферментов, таких как ММП, в избыточном образовании ЭКМ и затруднении циркуляции ВГЖ через ТС [162,181]. Установлено, что клетками-продуцентами молекул ЭКМ являются клеточные элементы ТС. J.P. Alexander (1991) обнаружил in situ в тканях трабекулы человека и крупного рогатого скота иммуногистохимическим методом экспрессию ММП-1, -2, -3 и -9 [81]. Другой исследователь -Kee С. с соавторами, изучая состав ВГЖ, полученный во время операции на глазах с ПОУГ, закрытоугольной глаукомой (ЗУГ) и катарактой, обнаружил, что уровень ММП-2 при ПОУГ, выше, чем при катаракте и ЗУГ [102]. При этом, авторы ad priore отвергли версию повышения активности ММП-2 в тканях глаза в ответ на офтальмогипертензию, мотивируя это компенсацией ВГД у больных, идущих на операцию. Они предположили, что даже краткосрочное повышение ММП-2 может привести к уменьшению базального ламинина и апоптозу клеток ТС. В другой работе авторы выявили, напротив, значительное снижение уровня ММП-2 во ВГЖ при ПОУГ [106,122]. В этом же ракурсе следуют работы Bradley J.M. с соавторами. J.M Bradley продемонстрировал увеличение водного оттока более чем на 50%, продолжительностью 5 дней и более после воздействия очищенных ММП-2, ММП-3 и ММП-9 на передний отрезок глаза. В соответствии с его данными, ингибиторы ММП теоретически должны подавлять отток ВВ. Активация ММП, препятствуя избыточному накоплению в глаукомных глазах молекул ЭКМ, таких как протеогликаны, коллагены, фибронектины и ламинин, напротив, должна снижать гидродинамическое сопротивление оттоку ВВ и увеличивать его объем [73]. Раскрывались возможности применения ММП в качестве терапевтических препаратов. Ранее было установлено, что экспрессия ММП-3 в ТС, индуцированная лазерной трабекулопластикой, усиливает лечебный (гипотензивный) потенциал процедуры. Это подтверждало терапевтический потенциал ММП-3 в лечении ПОУГ [71,104].

S.Rnkk (2007) предположил, что в функционировании ТС большую роль играет баланс между ММП и их тканевыми ингибиторами (TИMП). В качестве показателя, отражающего этот баланс, предложено определять активность ММП в комплексе с их ингибитором TИMП (ММП/TИMП-1). На роль маркера фибротизации и склерозирования тканей, развившихся вследствие нарушения баланса между синтезом и деградацией компонентов ЭКМ выдвинут ММП/TИMП-1. В тканях шлеммова канала, полученных интраоперационно, методом ИГХ обнаружена гиперэкспрессия ММП-1,2,3,9 в комплексе с дисбалансом с тканевыми ингибиторами (TИMП-1,2,3). Авторы пришли к выводу, что высокие концентрации MMП -причина ремоделирования ЭКМ в структурах передней камеры глаза, нарушения оттока ВВ и офтальмогипертензии [160].

Популяризация назначения простагландинов (ПГ) с гипотензивной целью привела к повышению интереса к увеосклеральному оттоку. Увеосклеральный отток осуществляется через внеклеточные пространства цилиарной мышцы, а затем через супрахориоидальное пространство глаза. Установлено, что гипотензивный эффект ПГ связан с увеличением увеосклерального оттока, реализуется по рецептор-лигандному принципу, и зависит от экспрессии простагландиновых рецепторов в цилиарной мышце [129]. С другой стороны, активация этих рецепторов, стимулируя различные реакции, увеличивает биосинтез матричных ММП [43,48,72]. ММП обнаруживаются в таких компартментах ЭКМ, как коллаген, ламинин и фибронектин. Добавление в среду ПГ при культивировании цилиарной мышцы повышает синтез про-ММП-1 и про-ММП-3. Разлагая фибриллы коллагена, включая коллаген I типа (коллагеназу) и III типа (стромелиpин); коллаген IV и V типа, ММП-1 и ММП-3 осуществляют ремоделирование ЭКМ. Наряду с этим, ММП могут регулировать состояние коллагенов в самой цилиарной мышце, снижая гидравлическое сопротивление в увеосклеральном пути оттока [67,74,98,147,148,163] (рисунок 1).

Офтальмологические методы исследования

Работа представляет собой статическое исследование, в ходе которого методом рандомизации осуществляли набор пациентов с ПОУГ. Отбор и обследование пациентов проходил на базе поликлинического отделения Государственного бюджетного учреждения Рязанской области «Клинической больницы им. Н.А. Семашко».

Отбор пациент для проведения исследования проводили по Протоколу. Критерии включения в исследования: пациенты с впервые выявленной, нелеченой ПОУГ. Диагноз подтвержден клиническими, периметрическими и морфометрическими показателями.. Критерии исключения: нормотензивная, закрытоугольная и псевдоэксфоллиативная глаукома, операции, травмы, воспалительные и аутоиммунные заболевания глаз в анамнезе, заболевания сетчатки и зрительного нерва, помутнение роговицы, затрудняющие осмотр глазного дна, аметропия высокой степени; тяжелая соматическая патология (инфаркт миокарда, инсульт, флеботромбоз), острые заболевания печени и почек, нейроэндокринные, психические заболевания, наличие сахарного диабета. Соматический статус оценивали кардиолог и/или терапевт, и эндокринолог.

В контрольную группу вошли 25 пациентов (17 мужчин и 8 женщин, средний возраст 72,2±1,6 года), не имеющие родственников первой линии, страдающих глаукомой, с роговично-компенсированным внутриглазным давлением 21 мм рт.ст., неизмененным ДЗН, нормальным состоянием слоя нервных волокон сетчатки и отсутствием дефектов полей зрения. Группа контроля была рандомизирована по гендерному признаку, возрасту, распространенности сердечно-сосудистых и аутоиммунных заболеваний, аметропиям. Такой подход минимизировал роль этих факторов риска, способствуя точной ценке роли ММП-2, ММП-9 и генотипа СFH.

Характеристика больных ПОУГ и распределение по стадиям представлено в главе 3.

Пациентам, вошедшим в исследование (66 пациентам с установленным диагнозом ПОУГ) проводили, наряду с офтальмологическим исследованием, иммуномолекулярное исследование слезной жидкости с количественной оценкой концентрации ММП-2 и ММП-9 и генетическое исследование. В ходе генетического исследования изучали однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs) гена СFН. Материалом для генетических исследований служила венозная кровь.

Из 25 пациентов группы контроля, 14-ти проводили иммуномолекулярное + генетическое исследование, 11-ти – только генетическое исследование (рисунок 5). I стадия (34 глаза) ПОУГ диагностировали на основании клинических и инструментальных данных, согласно Федеральным стандартам диагностики глаукомы (Национальное Руководство по глаукоме). Популяция ПОУГ и контрольная группа были сопоставимы по сопутствующим соматическим заболеваниям. Сопутствующей соматической патологией в группе контроля были в основном заболевания сердечно - сосудистой системы.

Больных обследовали однократно. По завершении исследований заносили лабораторные данные и результаты офтальмологического обследования в традиционную XL-таблицу, после чего проводили полномасштабный статистический анализ (см. далее в главе 2).

Всем пациентам проводили одинаковое офтальмологическое обследование: визометрию, биомикроскопию, авторефрактометрию, офтальмоскопию, тонометрию, тонографию, периметрию, оптическую когерентную томографию (ОКТ). Визометрию (измерение остроты зрения) осуществляли по общепринятой методике с использованием проектора знаков монокулярно в стандартных условиях освещенности с максимальной коррекцией аметропии. Биомикроскопию – оценку состояния переднего отрезка глаза проводили с использованием щелевой лампы Shin Nipon (Япония). Авторефрактометрию выполняли на авторефрактокератометре (фирмы HUVITZ).

Непрямую офтальмоскопию на щелевой лампе с помощью бесконтактной линзы в 78Д (Oculus, США) осуществляли в условиях медикаментозного мидриаза. Тонометрию (измерение внутриглазного давления) проводили контактным методом тонометром Маклакова (весом 10г). Тонографию стандартным методом проводили на электронном офтальмотонографе «GlauTest-60». Определяли следующие показатели: истинное внутриглазное давление Ро (мм рт. ст.), коэффициент легкости оттока внутриглазной жидкости С (мм/мин/мм рт.ст.), минутный объем секреции внутриглазной жидкости F (мм3/мин.), V (объем вытесненной за время тонографии из передней камеры глаза внутриглазной жидкости; мм3), коэффициент Беккера (КБ).

Компьютерную статическую периметрию проводили на автоматическом периметре «OCTOPUS 900» (Швейцария). Использовали стандартную пороговую программу 32, рекомендуемую для диагностики глаукомы. Пациентам с аномалиями рефракции и пресбиопией компьютерную периметрию проводили в условиях очковой коррекции для близи. Анализировали показатели пороговой световой чувствительности: МD (mean deviation) — среднее отклонение дефекта в анализируемой группе от возрастной нормы; MS (mean sensitivity) — средняя внутригрупповая светочувствительность, SLV (corrected loss variance)— корректированная внутригрупповая вариабельность снижения светочувствительности (отражает выраженность очаговых изменений). ОКТ заднего отрезка глаза проводили на приборе Stratus OCT модель 3000 фирмы Zeiss (Германия). С помощью программного анализа количественно оценивали параметры ДЗН и толщину слоя нервных волокон сетчатки (СНВС) в перипапиллярной зоне, детализировали состояние нервных волокон и степень их повреждения, а также определяли толщину сетчатки в различных зонах. Результаты отображали в виде стандартных протоколов сканирования макулярной области, толщины СНВС и головки зрительного нерва. Исследование проводили на базе ФБГУ областной клинической больницы имени Семашко Н.А. (врач функциональной диагностики высшей категории С.А.Безручко).

Исследование слезной жидкости проводили на базе центральной научно-исследовательской лаборатории ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России (зав. Лаб. - Никифоров Александр Алексеевич – к.м.н., доцент кафедры фармакологии ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России, ст. н. с. Л.В.Никифорова).

Материалом исследования служила СЖ 80-ти пациентов, из них 66 больных с нелеченой ПОУГ и 14 пациентов группы контроля.

Неиндуцированную слезу собирали стерильной микропипеткой из нижнего конъюнктивального свода глаза в сухую герметичную пробирку (рисунок 6). Собранную СЖ в объеме 30-50 мкл помещали в микропробирки «Eppendorf», замораживали и хранили при температуре -20С. Размораживали однократно непосредственно перед проведением исследования. В слезе оценивали количественный уровень ММП-2 и ММП-9 сэндвич-методом твердофазного иммуноферментного анализа. Концентрацию ММП-2 определяли с помощью реактива фирмы «BCM Diagnostics», концентрацию ММП-9 – реактивом фирмы «Bander Medsystems». Каждую пробу тестировали дважды.

Изучение полиморфизма гена CFH (T402H) у больных первичной открытоугольной глаукомы и у группы контроля

Для оценки значения повышения ММП-2 в механизмах патологического процесса, мы распределили больных ПОУГ на 2 группы по уровню фермента в слезе больного глаза. 1 группу составили 98 глаз с ПОУГ с концентрацией MMP-2, укладывающейся в коридор 2,0-4,0 нг/мл. В группу 2 вошли 22 глаза с ПОУГ, с концентрацией ММП-2, вышедшей за верхнюю границу нормы. Как видно из представленных данных, группы различались по стратегически важным клиническим и морфометрическим позициям. Известно, что малые размеры ДЗН ( 1,5 мм в диаметре), являются фактором риска развития ПОУГ. Наибольшее количество глаз с малым ДЗН вошло в 1 группу (для сравнения: 29,6% против 4,5%, р=0,00270, р 0,01) (таблица 16).

То есть, по этому показателю (фактор риска развития ПОУГ и прогрессирования ГОН) 1 группа достоверно отличалась от 2 группы. Однако, подавляющее большинство глаз с более продвинутой 3-4 стадией ПОУГ, напротив, вошли во 2 группу, в то время, как подавляющее большинство (62,2%) глаз с 1-2 стадиями, вошли в 1 группу (таблица 16).

Отчасти это объясняло статистически достоверную межгрупповую разницу некоторых морфометрических параметров сетчатки и ДЗН. В частности, во 2 группе оказались тоньше минимальная (р=0,05234, р 0,1) и средняя толщина сетчатки в фовеа (р=0,0122, р 0,05), соответственно, меньше объем фовеа (р=0,0123, р 0,05), ниже средняя толщина сетчатки в нижне-наружной зоне макулы (р=0,0686, р 0,1), при этом, в 1,3 раза чаще встречались глаза с истончением нижне-наружного отдела макулы (77, 3% против 58,2%, р 0,1) и в 2 раза чаще обнаруживались глаза со снижением объема макулы (45,5% против 22,5%); что привело к значимой межгрупповой разнице общего макулярного объема (р=0,0824, р 0,1). Кроме того, во 2 группе оказались ниже максимальная толщина СНВС в верхнем (р=0,0196, р 0,05) и нижнем отделе (р=0,0001, р 0,001), а также средняя толщина СНВС в этих отделах (р=0,0075, р 0,01; р=0,0001, р 0,001, соответственно); средняя толщина СНВС в целом (р=0,0001, р 0,001).

Наряду с этим, 2 группа отличалась более низкими, по сравнению с 1 группой поперечным размером (р=0,0071, р 0,01), протяженностью (р=0,0568, р 0,1), площадью (р=0,0006, р 0,001) и объемом НРП (р 0,001).

Не обнаружено межгрупповых различий по тонографическим показателям, включая коэффициент легкости оттока, продукцию водянистой влаги, коэффициент Беккера и Ро. Заметим, достоверность различий по Ро и КБ не достигнута исключительно из-за малочисленности 2 группы.

В целом, представленные результаты сопоставления свидетельствуют о наличии достоверных различий морфометрических показателей в группах, различающихся уровнем продукции ММП-2. Поэтому, на этом этапе исследований нельзя было исключить возможное участие ММП-2 в триггерных механизмах развития ПОУГ.

Для уточнения характера причинно-следственной связи, мы распределили больных с ПОУГ в зависимости от длительности их заболевания на 3 группы (таблица 17).

Уровни ММП-2 в слезе (нг/мл) 1 группа 0 мес. 2 группа 12 мес. 3 группа 12 мес. глаза 31 глаз 48 глаз Коридор значений 2,0-6,0 2,0-6,0 2,0-10,0 Mean±SD 2,75±0,90 2,80±0,98 3,59±1,41 Примечание: – достоверность межгрупповых отличий показателей по сравнению с 1 группой p 0,001 В 1 группу вошли 62 глаза с нулевым «стажем» заболевания, во 2 группу – 31 глаз с давностью заболевания до 12 месяцев, в 3-– 48 глаз со стажем более 1 года (таблица 16). Диаграмма на рисунке 35 наглядно иллюстрирует объемные изменения средне-группового уровня фермента в процентах от базисных показателей контроля. Высокие и умеренно-высокие уровни ММП-2 не предшествуют манифестации глаукомы. Скорее, можно говорить о том, что уровень фермента повышается по мере продвижения патологического процесса во временном пространстве и запущенности заболевания. Этот вывод демонстрирует диаграмма долевого распределения низких, умеренно-высоких и высоких уровней фермента ММП-2 в слезной жидкости глаз группы контроля и на глазах пациентов с различным стажем ПОУГ (рисунок 36). Достоверность межгрупповых различий выявляется только при длительности заболевания более 1 года (р 0,0001).

Мы попытались проанализировать причинно-следственные связи, сравнивая здоровые глаза (контроль, подгруппа 1) с низким уровнем ММП-2 в слезе (до 2,0 нг/мл) и здоровые глаза (контроль, подгруппа 2) c умеренно-высокими значениями ММП-2 в слезной жидкости (таблица 18).

Светочувствительность в нижневисочном отделе 478,6±9,8 459,2±2,4 0,0757, р 0,1 Оказалось, что группа с низкими уровнями ММП-2 отличается более пожилым возрастом: подавляющее большинство лиц (69,3%) старше 65 лет, а их средне-групповой возраст выше аналогичного показателя подгруппы 2 (для сравнения: 69,0±1,8 лет против 63,0±2,3 года, р=0,0534, р 0,1). Кроме того, 1 подгруппа отличалась худшим соматическим статусом. Все лица 1 подгруппы страдали гипертонической болезнью, что отразилось на их глазах, в частности, в большей степени были сужены артериальные сосуды на глазном дне, отмечалась тенденция к снижению средней толщины и объема сетчатки, например, в нижне-наружной зоне макулы, нередко выявлялась выраженная асимметрия морфометрических параметров сетчатки на двух глазах.

В этом аспекте не меньший научный интерес представляло сопоставление концентрации ММП-2 в слезе 12 глаз с облигатным риском развития ПОУГ и в слезной жидкости глаз с глазами с начальной стадией заболевания (таблица 19).

Было установлено, что на глазах с облигатным риском развития ПОУГ синтез ММП-2 на 13,6% выше базального уровня фермента (контроль). При этом, пропорция глаз с концентрацией ниже 3,0 нг/мл составила 50,0%, что было сопоставимо с контролем (46,4%, н/д). Вместе с тем, в 8,3% выявлялись глаза с уровнем ММП-2 выше 4,0 нг/мл (рисунок 37).

Рисунок 37 - Долевое распределение (в %) низких ( 3,0нг/мл), умеренно-высоких (3,0нг/мл- 4,0нг/мл) и высоких (4,0нг/мл) концентраций ММП-2 в слезе в норме (контроль), группе облигатного риска ПОУГ и начальной стадии ПОУГ Средне-групповая концентрация ММП-2 при начальной стадии ПОУГ оказалась ниже значений группы облигатного риска, но на 9,5% выше базального уровня контроля; при этом доля умеренно-высоких значений (более 4,0 нг/мл) ММП-2 в популяции глаз с начальной стадией ПОУГ была в 2 раза меньше (4,0% против 8,3%) группы риска.

Для более глубокого понимания связей мы сравнили клинико-инструментальные показатели 6 глаз с уровнем ММП-2 до 2,0 нг/мл включительно (1 подгруппа) с аналогичными параметрами 6 глаз с уровнем ММП-2 более 2,0 нг/мл (2 подгруппа). Оказалось, что все глаза с низким уровнем ММП-2 (1 подгруппа облигатного риска ПОУГ) отличаются снижением диффузной светочувствительности в нижне-височном секторе поля зрения (р 0,001) На пяти глазах выявляются небольшие флуктуирующие скотомы в секторе 10-20 и 20-30 от точки фиксации (р 0,001)., а MD выше нормы на 2 глазах из 6 (р 0,1). В этой подгруппе среднее отклонение дефекта от возрастной нормы (Mean±SD) составляет 1,6±0,48 против 0,36±0,40 (р=0,0013, р 0,01), а средняя внутригрупповая светочувствительность (Mean±SD) - 2575±1054 против 2654±413 на глазах полгруппы 2 (р=0,0268, р 0,05). Наряду с различиями на уровне функциональных показателей, выявлены морфометрические отличия. Они проявлялись более высокой билатеральной асимметрией объема назально-наружной (р=0,0142, р 0,01), верхненаружной (р=0,0670, р 0,1) и назально-внутренней зоны макулы р=0,0312, р 0,05), средней толщины назально-внутренней зоны макулы (р=0,0651, р 0,01). При этом средняя толщина сетчатки в назально - наружной зоне макулы оказались выше нормы (270 микрон ) на двух глазах из шести (р=0,0726, р 0,1), и ниже нормы в височно-наружной зоне макулы на аналогичном количестве глаз (р= 0,0726, р 0,1).

Подгруппа 1 отличалась тонографическими показателями от подгруппы 2. Так, на трех глазах из шести суточный перепад максимального и минимального ВГД достиг 10 мм рт ст (50%), что в принципе не встречалось в подгруппе 2 (р=0,0290, р0,05). Коридор вариабельности значений максимального ВГД в 1 подгруппе составил 16-26 мм рт против 18-21 мм в подгруппе 2. При этом среднее ВГД (Mean±SD) в 1 подгруппе составило: 25,0±1,7 мм рт ст против 19,2±1,2 мм рт ст (р=0,0920, р0,1), а средний суточный перепад ВГД (Mean±SD) -7,2±5,4 против 2,0±0,7 мм рт ст (р=0,0701, р0,1).

Мы предположили, что уровень ферментов, регулирующих стабильность ЭКМ, должен коррелировать с офтальмоскопическими признаками ПОУГ на уровне субъективных критериев, в частности, - с цветом самого ДЗН, глубиной экскавации, или коррелировать с таким важным показателем, как соотношение экскавации к ДЗН. Был проведен анализ сопряженности связи (таблица 20). Связь оказалась достоверной.

Изучение продукции ММП-9 в норме и при первичной открытоугольной глаукоме

Анализируя продукцию ММП-9 в слезе, как и в случае ММП-2, вначале мы установили норму. В слезной жидкости здоровых лиц аналогичного возраста с ПОУГ ММП-9 находился в коридоре 60,0-110,0 нг/мл, составляя в среднем 80,36±14,65нг/мл. Были обоснованы и введены градации нормы: «низкая» норма 90,0 нг/мл, которая не встречалась при ПОУГ, и глазах облигатного риска, и высокая норма: ММП-9 90,0 – 110,0 нг/мл. При этом все глаза группы облигатного риска развития ПОУГ имели MMП-9 90,0 нг/мл (вплоть до 155,0), т.е. Ни один из глаз этой группы не попал в границы низкой нормы контроля. Более того, в группе больных ПОУГ на 29 глазах значения MMП-9 располагались в интервале от 90,0 до 110,0 нг/мл, т.е. они перекрывались с контролем, и ни один из глаз с глаукомой не имел MMП-9 от 60,0 до 85,0 нг/мл. Это позволяло методически выделить "строгий контрольный интервал 60,0-85,0 нг/мл" ("левый" интервал контрольного распределения) и "правый контрольный интервал" (т.е. интервал 90,0), характерный для группы облигатного риска глаукомы и значительной доли глаз с развитой глаукомой. Имея такое дифференцированное описание интервала значений показателя MMП-9 (и располагая соответствующими ранговыми и бинарными показателями), можно было ставить задачу поиска маркера-предвестника глаукомы - в лице количественного показателя MMП-9 и/или ММП-2. Кроме того была проведена еще одна граница – 130,0 нг/мл, позволявшая разделить группу больных ПОУГ пополам: 58 глаз имели уровень MMП-9130,0 нг/мл, остальные 62 глаза - 130,0 нг/мл. Такое распределение представлялось крайне выгодным при сравнении подгрупп, так как в случае соразмерности групп лучше выявляются межгрупповые различия. Это представлялось целесообразным еще и потому, что в группе облигатного риска глаукомы 2 глаза имели MMП-9 130,0 нг/мл, что можно было бы интерпретировать как попадание подавляющего большинства глаз с пока еще не развившейся ПОУГ, но имеющих обоснованный риск заболевания, за гранью тех показателей MMП-9, которые заведомо не встречаются в контроле, но встречаются у значительной доли глаз в популяции ПОУГ.

В группе облигатного риска ПОУГ не встречались глаза с низкой нормой ММП-9 в слезе ( 90,0 нг/мл), в подавляющем большинстве (83,43%) глаз концентрация ММП-9 находилась в коридоре средней нормы (90,0 – 130,0 нг/мл) и в 16,57% случаев выявлялись повышенные уровни ММП-9 130,0 нг/мл, не встречавшиеся в контроле, но выявлявшиеся у значительной пропорции глаз с ПОУГ (51,67%).

На глазах с ПОУГ коридор ММП-9 был шире (90,0-220,0 нг/мл), нижняя граница и средние значения (90,0 нг/мл, 136,11±26,44) выше нормы (р=0,01094, р 0,05), частота выявления значений ММП-9 130,0 нг/мл достигала 51,7% (р 0,001). От стадии к стадии заболевания концентрация ММП-9 увеличивалась. На этапе манифестации средне-групповые показатели составляли 119,18±17,04 нг/мл, превышая норму, но были (р=0,0234, р 0,05) ниже показателей 2 стадии ПОУГ, соответственно, показатели 4 стадии превышали показатели 1, 2 и 3 стадий ПОУГ (р 0,001; р=0,00007, р 0,0001; р=0,04184, р 0,05; соответственно). При этом пропорция глаз с повышенным значением ММП-9 выросла до 93,8% (4 стадия) с 20,6% (1 стадия).

Высокая концентрация ММП-2 и ММП-9 в слезной жидкости глаз с ПОУГ указывала на возможное участие этих ферментов в патологическом процессе. Будучи маркером активности воспаления и деградации ЭКМ, дестабилизации клеток и повреждения тканей, ММП-2 и ММП-9, могли свидетельствовать о начале перестройки тканей на уровне трабекулярной сети, сетчатки и головки зрительного нерва. Однако эту версию нам еще только предстояло доказать. В нашем распоряжении были методы корреляционного анализа и логистического регрессионного моделирования глаукомы на основе выявленных корреляционных связей. Корреляционный анализ позволял найти и доказать сопряженную связь между признанными инструментальными экспертными критериями ранней диагностики ПОУГ и количественными показателями ММП-2 и ММП-9.

Как известно, в клинической практике ранняя диагностика ПОУГ строится на данных периметрии. К наиболее ранним функциональным изменениям поля зрения при ПОУГ, выявленным методом периметрии, относят изменение дифференциального светового порога глаза, как общего, так и локального. Варьирующие изменения порогов свидетельствуют о снижении ретинальной чувствительности и начинаются задолго до появления скотом. В начале заболевания дефекты поля зрения не имеют четко очерченных границ, они представлены областями, в которых зрительные функции становятся нестабильными. В функциональном аспекте нестабильность проявляется снижением световой чувствительности в той области, где расположен пучок нервных волокон, вовлеченный в начальные метаболические нарушения (Werner E.B., 1977). Ранние экспертные критерии прогрессирования заболевания проявляются ремоделированием сетчатки и ДЗН и выявляются морфометрически [2]. Поэтому следующим шагом наших исследований на пути к цели стал поиск корреляционных связей между уровнем ММП-2 и ММП-9 с одной стороны и функциональными и морфометрическими экспертными критериями манифестации и прогрессирования ПОУГ, - с другой стороны.

Вначале мы провели тщательный корреляционный анализ продукции ММП-2 в группе облигатного риска ПОУГ. В 13% глаз этой группы уровень ММП-2 оказался повышен. Наряду с этим, выявлены глаза с низким уровнем ММП-2. Оказалось, что именно глаза с низким уровнем ММП-2 (1 подгруппа облигатного риска ПОУГ) ассоциируются со снижением диффузной светочувствительности в нижне-височном секторе поля зрения (р 0,001) и небольшими флюктуирующими (5 глаз) скотомами в секторе 10-20 и 20-30 от точки фиксации (р 0,001), значимым средним отклонением дефекта от возрастной нормы (1,6±0,48 против 0,36±0,40, р=0,0013, р 0,01), и низкой средней светочувствительностью (2575±1054 против 2654±413, р=0,0268, р 0,05). Наряду с функциональными различиями, выявлены морфометрические отличия. Они проявлялись более высокой билатеральной асимметрией объема макулы в назально-наружной (р=0,0142, р 0,01), верхне-наружной (р=0,0670, р 0,1) и назально-внутренней зоне (р=0,0312, р 0,05), средней толщины назально-внутренней зоны макулы (р=0,0651, р 0,01). Заметим, именно на этих глазах водный обмен оказался снижен (субпороговые значения F). Таким образом, данные, полученные на глазах облигатного риска развития ПОУГ, подтверждали важное значение количественных показателей ММП-2 в оценке молекулярного гомеостаза и раскрывали возможность использование этого маркера в прогнозе вероятности развития заболевания.

Далее был проведен аналогичный корреляционный анализ в популяции манифестировавшей ПОУГ. Уровни MMП-2 были выше у больных ПОУГ, страдающих гипертонической болезнью, которая, как известно сцеплена с полиморфизмом гена СFH (коэффициент корреляции по Спирману r=0,29029 (р0,01). На миопичных глазах больных ПОУГ уровень ММП-2 оказался ниже, чем при эмметропии (коэффициент корреляции с миопией по Спирману = -0,2985 p 0,001).

Выявлена прямая корреляционная связь показателей ММП-2 с минимальным и максимальным внутриглазным давлением, а также с флуктуацией ВГД более 4 мм рт ст (коэффициенты корреляции по Спирману r=0,23509, r=0,3945 и r=0,22489, соответственно, p 0,001). Иными словами, рост показателей ММП-2 ассоциировался с гидродинамическими нарушениями в глазу.

В комплексе с установленной связью ММП-2 и гидродинамическими нарушениями выявленная закономерность объясняет меньшие показатели офтальмотонуса и флуктуации ВГД при миопии высокой степени.

Логичной закономерностью представляется выявленная сопряженная связь параметров ММП-2 с отношением экскавации к ДЗН r=0,21645, р 0,05, отражающим характер ремоделирования тканей глаза при ПОУГ.