Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы.
1.1. Методы исследования микроциркуляции глаза у экспериментальных животных 13
1.2. Методы моделирования ишемического поражения глаза в эксперименте 22
1.3. Применение антиоксидантов в коррекции нарушений микроциркуляции и ретинальной ишемии в 37 эксперименте
ГЛАВА 2. Материал и методы исследования.
2.1. Общая характеристика экспериментального материала 48
2.2. Способы моделирования регионарной ишемии-реперфузии глаза 53
2.3. Методы исследования в эксперименте
2.3.1. Объективные методы исследования 57
2.3.2. Ультразвуковые методы исследования 59
2.3.3. Методы лабораторных исследований 63
2.3.4. Методы гистологического исследования 65
2.3.5. Статистические методы обработки результатов исследования 66
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований .
3.1. Оценка состояния переднего отрезка глаза после моделирования ишемии-реперфузии 67
3.2. Результаты ультразвукового исследования глаза и орбиты в B - режиме после моделирования регионарной ишемии-реперфузии 71
3.3. Оценка гемодинамики в орбитальных сосудах у крыс до и после моделирования регионарной ишемии-реперфузии 72
3.4. Результаты лабораторного исследования тканей глаза и сыворотки крови в эксперименте на крысах до и после моделирования регионарной ишемии-реперфузии 88
3.5. Результаты морфологического исследования тканей глаза в эксперименте на крысах до и после моделирования регионарной ишемии-реперфузии 98
Заключение 116
Выводы 124
Практические рекомендации 126
Список литературы
- Методы моделирования ишемического поражения глаза в эксперименте
- Методы исследования в эксперименте
- Оценка гемодинамики в орбитальных сосудах у крыс до и после моделирования регионарной ишемии-реперфузии
- Результаты морфологического исследования тканей глаза в эксперименте на крысах до и после моделирования регионарной ишемии-реперфузии
Методы моделирования ишемического поражения глаза в эксперименте
В настоящее время существует широкий спектр методов исследования кровотока в сосудах глаза. Изучение состояния гемодинамики глаза в эксперименте необходимо для более детального понимания патогенеза сосудистых заболеваний сетчатки и зрительного нерва, оценки влияния различных препаратов и методов лечения на глазной кровоток [41].
Одним из наиболее распространённых методов исcледования микроциркуляции у экспериментальных животных является флюоресцентная ангиография (ФАГ), которая нашла широкое применение в офтальмологии для исследования ретинальной циркуляции при диабетической ретинопатии, тромбозах центральной вены сетчатки и её ветвей, дистрофических, сосудистых и онкологических заболеваниях глаз. Метод применяется для определения участков повышенной сосудистой проницаемости, ишемии, дефектов пигментного эпителия, неоваскуляризации и других сосудистых нарушений в реальном времени, что позволяет оценить не только качество созданной модели, но и эффективность последующего лечения.
У крысы, как и у человека, отмечается преобладание ретинальной сосудистой сети, за счёт которой осуществляется питание большей части сетчатки. Известно, что одной из основных причин сосудистых заболеваний глаза является нарушение кровообращения в ретинальных сосудах, поэтому экспериментальные исследования по моделированию ишемического поражения сетчатки осуществляются на крысах. Ряд авторов применяли ФАГ для изучения формирования лазериндуцированной хориоидальной неоваскулярной мембраны и оценки степени ликеджа сосудов [132]. C. Sun и соавт. [185] в модели ретинальной окклюзии ветви центральной вены сетчатки применяли ФАГ для оценки степени выраженности окклюзии сосудов. В ходе исследования авторами подтверждена эффективность системной терапии миноциклином, в качестве нейропротектора, уменьшающего постишемическое воспаление и потерю ганглиозных клеток.
В работе на модели лазериндуцированной ишемии у кроликов, Р. А. Гундорова и соавт. [25] использовали ФАГ для подтверждения степени ишемии сетчатки. В эксперименте через 20 минут и на 3 сутки после индукции ишемии, авторы наблюдали выраженную диффузию красителя из магистральных ретинальных сосудов, обусловленную значительным повреждением эндотелия. В модели ишемической оптической нейропатии не связанной с артериитом у грызунов, H. Chuman и соавт. [88] отмечали дефект заполнения в сосудах хориоидеи и диска зрительного нерва (ДЗН) на ранних стадиях и гиперфлюоресценцию со значительным снижением числа перфузируемых капилляров на диске на поздних стадиях ангиографии.
R. S. Wang и соавт. [199] предложили модель передней ишемической нейропатии у крыс с использованием фотодинамического эффекта. После внутривенного введения деривата гематопорферина и облучения сосудов криптоновым лазером 647 нм, через 2 часа у животных развивалась ишемия переднего отдела зрительного нерва. С помощью ФАГ была установлена информативность разработанной модели ишемической нейропатии.
Сканирующая лазерная офтальмоскопия (СЛО) с красителями обеспечивает возможность регистрации изображения глазного дна в реальном времени при использовании низких уровней освещения. В сочетании с красителями (акридиновый оранжевый, ангиография с меченным флюоресцеином изотиоцинатом, флюоресцеином натрия, карбоксифлюоресцеином, индоцианин-зеленым), методика позволяет регистрировать движение лейкоцитов на глазном дне in vivo, и таким образом, исследовать циркуляцию лейкоцитов при нарушении ретинального или хориоидального кровообращения.
В исследовании по количественному анализу динамики лейкоцитов в ретинальных сосудах у крыс N. Lu и соавт. [138] оценивали время полного восстановления скорости движения лейкоцитов в микрососудах после 5-минутной ишемии, вызванной клипированием зрительного нерва вместе с центральной веной сетчатки. Использование акридинового оранжевого в качестве красителя при лазерной офтальмоскопии позволило авторам определить скорость потока лейкоцитов в прекапиллярных артериолах, капиллярах и посткапиллярных венулах. Полное восстановление скорости наступало в течение 80 мин реперфузии, однако скорость потока лейкоцитов в артериолах отличалась от таковой в венулах. Несмотря на краткосрочность ишемии, восстановление скорости кровотока в капиллярах на 50% происходило через 5 минут.
Индоцианин-зеленая ангиография (ИЦЗА) - метод оценки хориоидального кровообращения. При проведении ИЦЗА краситель почти на 98% связывается с белками плазмы, что уменьшает его выход через фенестры капилляров сосудистой оболочки. Флуоресценция индоцианина происходит в длинноволновой зоне спектра (835 нм). Принцип этого метода аналогичен ФАГ и может проводиться одновременно с ней или последовательно. Методику в сочетании с СЛО использовали в эксперименте на крысах для оценки динамики хориоидальной циркуляции [134, 135]. Установлено, что визуализация гиперфлюоресцирующих точек (лейкоцитов) по ходу сосудов происходит через несколько минут после внутривенного введения индоцианин-зеленого (ИЦЗ). N. Matsuda и соавт. [145] предложили использовать компьютерный анализ изображений «кадр за кадром» для прижизненного подсчёта флюоресцирующих лейкоцитов в хориоидальных сосудах. C. Lee и соавт. [126] в эксперименте на кошках
Методы исследования в эксперименте
Ретинальную ишемию-реперфузию в 1А и 2А подгруппах моделировали путем повышения ВГД через прокол иглой в зоне лимба левого глаза с нагнетанием воздуха в переднюю камеру глаза с помощью устройства, содержащего инъекционную иглу, пневматически связанную гибкими трубками с анероидным манометром, подключенными последовательно ресивером (в виде манжеты от тонометра) и нагнетателем с клапаном. Воздух нагнетался в переднюю камеру глаза до ВГД 110 мм. рт. ст., которое сохранялось в течение 30 минут.
Способ моделирования ишемии-реперфузии осуществляли по предложенному нами методу («Способ моделирования транзиторной ишемии сетчатки у крыс». Патент на изобретение №2577449 от 15.02.2016) [59]. Первоначально осуществляли подготовку устройства для нагнетания воздуха с анероидным манометром. Для создания устройства была использована система от механического тонометра MT-10 (Meditech), состоящего из резиновой груши для нагнетания воздуха, манжеты, манометра и замкнутой системы резиновых трубочек. Кроме того, использовали резиновые трубочки от стетоскопа, инсулиновую иглу размерами 0,4х13 мм (27 G) и систему для внутривенных инфузий, включающую инъекционную иглу, длинную гибкую трубку из поливинилхлорида, роликовый регулятор скорости потока и прозрачную камеру. Сборка устройства осуществлялась следующим образом: в одно из отверстий коротких плечей трубочек от стетоскопа (без раструба и наконечника для ушей) переставляли манометр от механического тонометра. Далее соединяли второе короткое плечо трубочек стетоскопа с помощью прозрачной трубки от системы для внутривенных инфузий длиной 2-3 см с трубочкой от тонометра, в которой изначально находился манометр. При этом диаметры просвета обеих трубочек соответствовали друг другу по типу «ключ в замок». Для герметичности системы использовали изоляционную ленту. Часть системы для внутривенных инфузий с инъекционной иглой и прозрачной поливинилхлоридной трубочкой соединяли с длинным плечом трубочки стетоскопа, при этом производили замену иглы на инсулиновую. Устройство для моделирования регионарной ишемии-реперфузии глаза в собранном виде и его схема представлены на Рис. 1. и Рис. 2.
Устройство для моделирования ишемии-реперфузии путём повышения ВГД воздухом. После подготовки устройства к работе и анестезии животного с использованием системного наркоза и местного анестетика – глазные капли инокаин 0,4% (оксибупрокаина гидрохлорид) устанавливали иглу (5) в переднюю камеру глаза. Вкол иглы в области лимба (5) осуществяли под углом 25-35 градусов к его плоскости, направляя иглу срезом в сторону роговицы. Далее иглу постепенно вводили на - 2/3 её длины между радужкой и внутренней поверхностью роговицы не меняя расположения среза иглы, избегая травматического повреждения структур переднего отрезка глаза. Введение воздуха в переднюю камеру глаза проводили с помощью груши (3) под контролем давления на анероидном манометре (1). Давление повышали до 110 мм. рт. ст. и закрывали клапан сброса воздуха. При этом манжета (ресивер) (2) служила для равномерной подачи воздуха без резких перепадов давления, которые сопровождают процесс нагнетания воздуха с минимальным травматическим воздействием на ткани глаза. Метод позволил поддерживать давление на заданном уровне в течение 30 минут с помощью добавочных сжатий груши (3). После 30 минут воздействия открывали воздушный клапан груши (нагнетателя) и воздух постепенно выпускали в течение 0,5-1,5 минут, затем осуществляли инстилляцию глазного геля видисик.
В 1Б и 2Б подгруппах моделирование односторонней ишемии-реперфузии проводили путем однократного субконъюнктивального введения в левый глаз 0,2 мл 4 10-6 М раствора эндотелина-1 (ЭТ-1) в фосфатном буфере 0,05 М, ph=7,4 по предложенному нами методу ("Способ создания модели транзиторной ишемии сетчатки". Патент на изобретение №2577242 от 11.02.2016) [58]. Первоначально готовили раствор ЭТ-1 из сухого вещества. В ампуле ЭТ-1 (Sigma-Aldrich) содержится 0, 1 мг ЭТ-1 в виде белого порошка с молярной массой (Mr) = 2491,9, т.е. 1 моль вещества содержит 2491,9 г., что соответствует 4 10-8 моль ЭТ-1 во флаконе. Разводили сухое вещество ЭТ-1 в 10 мл стерильного раствора калиевого фосфатного буфера, имеющего pH 7,4. В результате концентрация ЭТ-1 в полученном растворе составила 4 10-6 моль/л (М). Для субконъюнктивального введения использовали 0,2 мл полученного раствора.
После анестезии (системный наркоз в сочетании с местным анестетиком), проводили субконъюнктивальную инъекцию иглой 0,4х13 мм (27G). Срез иглы направляли к верхнему веку в область экватора глаза в верхне-наружный квадрант. Проводили иглу под конъюнктиву не менее чем на половину ее длины в направлении заднего полюса глаза. Затем медленно вводили 0, 2 мл 4 10-6 М раствора ЭТ-1 в калиевом фосфатном буфере, рН 7,4. Через несколько секунд отмечали выраженное побледнение конъюнктивы (Рис. 3). В течение минуты регистрировали начало полного прекращения тока крови в сосудах на глазном дне, что подтверждалось офтальмоскопически. Извлекали иглу и производили инстилляцию глазного геля видисик.
По сравнению с ранее предложенным методом K. Masuzawa и соавт. [144], которые субконъюнктивально вводили крысам 0,3 мл 4 10 -5 М ЭТ-1, предложенный нами метод включает в себя уменьшение концентрации вещества в 10 раз и объема вводимого препарата на 30% , что снижает риск возможного системного влияния ЭТ-1 и делает исследование более экономичным, при сохранении эффективности и воспроизводимости модели ишемии-реперфузии.
Оценка гемодинамики в орбитальных сосудах у крыс до и после моделирования регионарной ишемии-реперфузии
Ультразвуковое сканирование в режиме серой шкалы применялось для исключения отслойки сетчатки, эндофтальмита или цилиохориоидальной отслойки в постишемическом периоде.
Сразу после введения воздуха в переднюю камеру в подгруппах 1А и 2А сканирование было затруднено из-за артефактов. Через 3 суток после рассасывания воздуха в передней камере у одного животного в 1А подгруппе были обнаружены признаки эндофтальмита и у одного - отслойка сетчатки. Во 2А подгруппе в одном случае выявлена цилиохориоидальная отслойка. Эти животные были исключены из исследования.
В 1Б и 2Б подгруппах, где моделирование ишемии-реперфузии проводилось с помощью субконъюнктивального введения ЭТ-1, частичное восстановление кровотока в орбитальных сосудах по данным офтальмоскопии и допплерографических методов наблюдалось в интервале от 5 до 60 минут. Через 3 суток у 7 животных (35%) 1Б подгруппы и 10 животных (33,3%) 2Б подгруппы отмечался частичный гемофтальм (менее объёма стёкловидного тела), который практически полностью подвергался резорбции к концу периода наблюдения. Через 30 суток в позднем постишемическом периоде у 5 животных 1Б подгруппы наблюдались фиброзные изменения стекловидного тела. Осложнений, являющихся основанием для исключения из исследования, у животных 1Б и 2Б подгрупп не выявлено.
Имеющиеся в литературе сведения о кровоснабжении глаза крысы и методика исследования представлены в разделе «Материалы и методы исследования».
Применение мультичастотного объемного (4D) линейного датчика RSP6–16-D позволило четко визуализировать основные орбитальные сосуды глаза и орбиты крысы в режиме 3D c использованием энергетического цветового картирования (ЭК), при котором анализируется амплитуда сигналов отражённых от эритроцитов в заданном объеме. Соотношение результатов исследования в серой шкале с объемной цветовой картой потоков крови в режиме ЭК позволило оценить прижизненную пространственную топографию хода сосудов в орбите.
Учитывая результаты собственных исследований, особенности спектральных характеристик кровотока и литературные данные анатомо-топографических особенностей, была разработана 2D (Рис. 8) и 3D (Рис. 9) схема кровоснабжения глаза крысы.
Особенностью кровоснабжения глаза крысы является то, что в образовании хориоидальной сосудистой сети у крыс учавствуют две ЗДЦА, а не задние короткие цилиарные артерии, как у человека. Рис. 8. 2D cхема кровоснабжения глаза крысы: ЗЦВ – задняя цилиарная вена, ВП – витреальная полость, ЗН – зрительный нерв, ЦВС – центральная вена сетчатки, ЗДЦА – задняя длинная цилиарная артерия (медиальная и латеральная), ЦАС – центральная артерия сетчатки, ЗЦВ – задняя цилиарная вена, ЗЦА – задняя цилиарная артерия.
Рис. 9. 3D cхема кровоснабжения глаза крысы: 1. Глазная вена, v. ophthalmica; 2. Глазная артерия, a. ophthalmica; 3. Верхняя глазная артерия, a. ophthalmica superior; 4. Нижняя глазная артерия, a. ophthalmica inferior; 5. Задние цилиарные вены, vv. ciliaris posterior; 6. Задняя цилиарная артерия, a. ciliaris posterior; 7. Зрительный нерв, n. opticus 8. Центральная вена сетчатки, central retinal vein; 9. Центральная артерия сетчатки, central retinal artery; 10. Латеральная и медиальная задние длинные цилиарные артерии, lateral et medial a. ciliaris posterior longus. Средний уровень нормального артериального давления (АД) в хвостовой артерии у интактных крыс установлен на основании анализа данных 1-й контрольной группы и составлял для систолического АД в среднем 121,1±9,5 мм. рт.ст. (M+), для диастолического - 80±14,3 мм.рт.ст (M+).
На первом этапе исследования проводили оценку состояния кровотока в орбитальных сосудах до начала приема антиоксиданта ресвератрола и через 30 суток после начала его применения.
После статистической обработки полученных данных были установлены параметры средних показателей кровотока в сосудах орбиты у здоровых крыс (табл. 5) [118]. Анализ показателей кровотока в ЦАС показал достоверное увеличение максимальной систолической скорости кровотока (Vsyst) на 35,6% (p 0,05), конечной диастолической (Vdiast) на 25,4% (p 0,001) и снижение RI на 13,5% (p 0,05) по сравнению с показателями в группе контроля. Аналогичные изменения гемодинамики отмечали в ЗДЦА, НГА и ВГА, в которых регистрировали увеличение Vsyst в среднем на 30,6%, 26,8% и 32% соответственно (p 0,05); увеличение Vdiast на 25,4% в ЗДЦА и 22,5% в НГА (p 0,001); на 19% в ВГА (p 0,05) и достоверное снижение индекса периферического сопротивления во всех артериях (p 0,05) по сравнению с контролем (табл. 5., Рис. 10).
Результаты морфологического исследования тканей глаза в эксперименте на крысах до и после моделирования регионарной ишемии-реперфузии
Для определения характеристик нормальной сетчатки и проведения оценки степени ишемического повреждения тканей оболочек глаза в ранний и поздний постишемический период, а также исследования эффективности применения ресвератрола, было выполнено патогистологическое исследование тканей глаза у 5 животных из контрольной 1В подгруппы. После фиксации тканей глаза в растворе Боуэна и подготовки парафиновых срезов, проводили окрашивание гематоксилин-эозином и световую микроскопию. В результате выполненного исследования были определены следующие основные характеристики глазных структур. Глаз крысы имеет три оболочки: наружную - склеру, среднюю - радужку, цилиарное тело и хориоидею и внутреннюю сетчатую оболочку. Роговица состоит из 5 слоев: многослойный плоский эпителий, боуменова мембрана, строма, десцеметова мембрана и один слой эндотелиальных клеток. Сосуды в роговице отсутствуют. Склера состоит из плотно расположенных коллагеновых пучков и единичных фиброцитов. Особенностью строения лимба является наличие сосудистого слоя под многослойным плоским эпителием, которые являются источником роста новых сосудов при ишемии.
Особенностью сосудистой оболочки у крыс породы Wistar является отсутствие пигмента в радужке и в пигментном эпителии хориоидеи. В цилиарном теле различают наружную поверхность, граничащую с передней камерой и внутреннюю, граничащую с хрусталиком. Хрусталик имеет относительно большие размеры, чем у человека. Сетчатка имеет схожее гистологическое строение для всего класса млекопитающих: пигментный эпителий, слой палочек и колбочек, наружняя пограничная мембрана, наружный ядерный слой (6-8 рядов клеток), наружный плексиформный слой, внутренний ядерный слой (8-10 рядов клеток), внутренний плексиформный слой, один слой ганглиозных клеток, слой нервных волокон, внутренняя пограничная мембрана (Рис. 17). Сосуды чаще визуализируются в слое ганглиозных клеток. Анатомической особенностью сосудов сетчатки является присутствие базальной мембраны, окружающей эндотелий и перициты. Морфологическое исследование при моделировании ишемии-реперфузии путём повышения ВГД.
Морфологическая картина состояния тканей оболочек глаза у животных 1А подгруппы через 3 суток после ишемии, индуцированной высоким ВГД, имела следующие характеристики: нормальный размер глазного яблока; отёк роговицы с участками истончения и эктазии; инфильтрация роговицы, радужки и цилиарного тела лимфоцитами; отёк сетчатки, преимущественно за счет внутреннего плексиформного слоя и слоя нервных волокон. Обращало на себя внимание частичное разрушение слоя палочек и колбочек, апоптоз ганглиозных клеток, в то время как наружный и внутренний ядерный слой сохраняли нормальную толщину 6-8 рядов и 8-10 рядов клеток соответственно. Многочисленные сосуды поверхностного капиллярного сплетения были значительно расширены (Рис. 18), а стенка венозных сосудов истончена.
Через 7 суток после ишемии особенности патогистологической картины у этих животных включали увеличение площади разрушенного фоторецепторного слоя, уменьшение толщины наружного ядерного слоя (5-6 рядов клеток) на фоне сохраняющегося отёка сетчатки.
Через 30 суток отмечалась неоваскуляризация роговицы, выраженные фиброзные изменения в виде образования тонкой пленки в углу передней камеры и у основания цилиарного тела, атрофия радужки. Кроме того, наблюдалась инфильтрация хориоидеи лимфоцитами (Рис. 19а), а также выраженные изменения сетчатки в виде пролиферации глиальной ткани, участки отсутствия фоторецепторного слоя, уменьшение наружного ядерного слоя до одного ряда и исчезновения наружного плексиформного слоя. Внутренний ядерный слой истончался в меньшей степени (до 6-8 рядов клеток), определяли гипохромию ядер его клеток, кроме того, уменьшалось число ганглиозных клеток (Рис. 19б).
Патогистологическая картина сетчатки у животных 2А подгруппы, получавших ресвератрол, через 3 суток после ишемии, отличалась менее выраженным отёком внутреннего плексиформного слоя, наличием неповрежденных участков на фоне признаков нарушения структуры сетчатки в виде разрушения фоторецепторного слоя и апоптоза части ганглиозных клеток. Через 7 суток в имеющихся измененных участках сетчатки толщина наружного ядерного слоя составляла 5-6 рядов и внутреннего ядерного - 7-8 рядов клеток. Наблюдались зоны сохранной сетчатки, в том числе фоторецепторного слоя и переходные зоны с частично разрушенным слоем палочек и колбочек (рис. 20а). Через 30 суток, в отличие от 1A подгруппы, не отмечалось фиброзных изменений в углу передней камеры и у основания цилиарного тела. В сетчатке имели место участки с частичным разрушением фоторецепторного слоя (Рис. 20б) и зоны, где все слои были полностью сохранны (Рис. 20в).
Таким образом, результаты выполненного нами патоморфологического исследования тканей оболочек глаза показали чётко выраженные признаки ишемии сетчатки, а именно её отёк, апоптоз ганглиозных клеток в ранний постишемический период и уменьшение числа рядов обоих ядерных слоёв с атрофией фоторецепторного слоя (разрушение палочек и колбочек, наружного ядерного и плексиформного слоя), что подтверждает эффективность представленной модели регионарной ишемии-реперфузии глаза для изучения ишемического поражения сетчатки. Преимущественное повреждение наружных слоёв сетчатки и лимфоцитарная инфильтрация хориоидеи может свидетельствовать в пользу нарушения кровоснабжения преимущественно в системе задних длинных цилиарных артерий.
В единичных публикациях представлены данные о патогистологических изменениях в сетчатке (отёк внутреннего плексиформного слоя, апоптоз ганглиозных клеток) в ранний период после моделирования ишемии-реперфузии под влиянием высокого ВГД [74, 137, 172, 195], что согласуется с нашими результатами. Нами впервые выявлены патоморфологические изменения сетчатки в отдалённом постишемическом периоде (через 30 суток) после ишемии-реперфузии, индуцированной высоким ВГД, характеризующиеся повреждением не только наружных слоёв сетчатки, но и внутренних, вероятно, вследствие компрессионно-ишемической травмы хориоидеи, приводящей к её инфильтрации лимфоцитами (Рис. 19а). У всех животных, получавших ресвератрол в течение длительного времени (более 1 месяца), при патогистологическом исследовании оболочек глаза установлено наличие интактных участков сетчатки с сохранными ганглиозным, ядерными и фоторецепторным слоями.